Uogólniona metoda oznaczania składu swobodnie rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych

Uogólniona metoda oznaczania składu wolnych rozpuszczalnych kwasów fenolowych i zdolności przeciwutleniających zbóż i roślin strączkowych. Produkty pełnoziarniste, w tym zboża i rośliny strączkowe, stanowią istotną część diety człowieka. Ich znaczenie odżywcze dla ludzi jest od dawna znane.

Jednak ostatnio zgłoszono ich przeciwutleniające korzyści zdrowotne dla zdrowia. Kwasy fenolowe znajdujące się w zewnętrznych warstwach ziarna zbóż i okrywie nasiennej roślin strączkowych przyczyniają się do właściwości przeciwutleniających całych ziaren. Wymiatają wolne rodniki, które powodują oksydacyjne uszkodzenia biomolekuł.

Dwie klasy kwasów fenolowych występujących w pełnych ziarnach to kwasy hydroksybenzoesowe i kwasy hydroksycynamonowe. Badanie to zapewnia prostą metodę ekstrakcji pełnoziarnistych kwasów fenolowych i określenia ich zdolności przeciwutleniającej in vitro. Do tego badania użyj pięciu próbek pełnego ziarna: pszenicy durum, żółtej kukurydzy, fasoli cowpea o czarnych oczach, soi i czerwonej fasoli.

Dokładnie zważ 100 miligramów próbki mąki pełnoziarnistej bezpośrednio do bursztynowej mikroprobówki wirówkowej o pojemności dwóch mililitrów. Ciemny kolor rurki pomaga zapobiegać ekspozycji mieszaniny na światło. Dodaj jeden mililitr 80% wodnego metanolu do każdej z probówek zawierających przykłady.

Krótko przetrząsnąć, aby wymieszać roztwór metanolu i próbkę. Sonikować próbki przez 60 minut w celu ekstrakcji wolnych rozpuszczalnych związków fenolowych. Na czas sonikacji należy przykryć próbki, aby zapewnić dodatkową ochronę przed światłem.

Po sonikacji należy odwirować mieszaniny w temperaturze 20 000 razy G przez pięć minut, aby osadzać stałe pozostałości, pozostawiając supernatant na wierzchu. Wolne związki fenolowe będą obecne w supernatancie po odwirowaniu. Supernatant musi zostać przefiltrowany przed wstrzyknięciem do instrumentu HPLC.

Aby przefiltrować supernatant, należy zdjąć tłok strzykawki o pojemności 3 ml i założyć filtr strzykawkowy. Filtr powinien mieć porów o wielkości nie większej niż 0,22 mikrometra. Odpipetować około 0,4 mililitra supernatantu do górnej części strzykawki.

Ponownie włożyć tłok i przepchnąć płyn przez filtr do fiolki HPLC zawierającej wkładkę do fiolki. Po skonfigurowaniu urządzenia do uruchamiania metody opisanej w manuskrypcie do analizy HPLC, załaduj fiolki do karuzeli, aby odpowiadały liście próbek. Otrzymać chromatogramy HPLC o długości 320 nanometrów i 280 nanometrach, wykazujące wyraźne piki reprezentujące różne związki fenolowe.

Używając odpowiednich krzywych wzorcowych, określ ilościowo kwasy hydroksycynamonowe przy 320 nanometrach, ponieważ mają one maksymalną absorbancję przy tej długości fali. Na tej samej zasadzie oznacz ilościowo kwasy hydroksybenzoesowe w 280 nanometrach. Użyj Trolox, rozpuszczalnego w wodzie analogu witaminy E, jako standardu do oszacowania zdolności przeciwutleniającej in vitro ekstraktów z pełnego ziarna.

Dokładnie zważ jeden miligram leku Trolox do probówki Falcon. Rozpuść w czterech mililitrach 50% wodnego roztworu metanolu, aby przygotować roztwór podstawowy jednego milimola na litr, czyli tyle samo, co 1000 mikromoli na litr. Przygotuj sześć stężeń Troloxu, czyli 50, 100, 200, 400, 600 i 800 mikromoli na litr, aby wykreślić krzywe standardowe do oszacowania zdolności wymiatania rodników DPPH i równoważnej zdolności przeciwutleniającej Trolox, TEAC.

Podobnie przygotuj stężenia Trolox 6,25, 12,5, 25 i 50 mikromoli na litr w celu oszacowania zdolności absorpcji rodników tlenowych, ORAC. Uzupełnić całkowitą objętość każdego stężenia do 500 mikrolitrów, jak pokazano w tabeli pierwszej. Rozcieńczyć ekstrakty próbki metanolem przed analizą.

Tutaj ekstrakty z żółtej kukurydzy i wspięgi chińskiej zostały dwukrotnie rozcieńczone. Ekstrakty z pszenicy i fasoli rozcieńczono pięciokrotnie, natomiast ekstrakt z soi rozcieńczono 10-krotnie metanolem. Odważ 8,23 miligrama ABTS w czystej, bursztynowej mikroprobówce wirówkowej o pojemności dwóch mililitrów.

Następnie zważ 1,62 miligrama nadsiarczanu potasu w czystej, bursztynowej mikrowirówce o pojemności dwóch mililitrów. Rozpuść każdą z ważonych substancji chemicznych w jednym mililitrze wody destylowanej przez wirowanie. W ten sposób powstaje 16-milimolowy roztwór ABTS i sześciomilimolowy roztwór nadsiarczanu potasu.

Przygotować roztwór podstawowy ABTS, mieszając roztwory ABTS i nadsiarczanu potasu w równych objętościach. Roztwór natychmiast zmieni kolor na ciemny. Pozostaw tę mieszaninę do inkubacji w ciemności przez 12 do 16 godzin.

Rozcieńczyć roztwór podstawowy ABTS 30 razy 200-milimolowym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, aby utworzyć roztwór roboczy ABTS. Aby to zrobić, dodaj 58 mililitrów 200 milimolowych PBS do dwóch mililitrów roztworu roboczego ABTS. Roztwór roboczy będzie zawierał 0,27 milimolowego ABTS i 0,1 milimolowego nadsiarczanu potasu.

Do analizy umieść 10 mikrolitrów każdego rozcieńczonego ekstraktu w 96-dołkowej mikropłytce. Dodaj 190 mikrolitrów roztworu roboczego ABTS do każdej studzienki i inkubuj przez 60 minut. Zmierzyć absorbancję mieszanin reakcyjnych przy 750 nanometrach w czytniku mikropłytek.

Użyj wzorców Trolox w stężeniach w zakresie od 100 do 800 mikromoli na litr, aby wykreślić krzywą kalibracyjną. Test przeciwutleniający DPPH wymaga związku generującego rodniki, DPPH. Odważyć 1,2 miligrama DPPH do pustej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Rozpuścić DPPH w metanolu, aby przygotować roztwór o stężeniu 60 mikromolów. Test DPPH testuje zdolność ekstraktów próbek do wymiatania wolnych rodników wytwarzanych przez DPPH. Dodaj pięć mikrolitrów ekstraktu próbki do studzienek na mikropłytkę.

Następnie dodaj 195 mikrolitrów 60-mikromolowego roztworu metanolowego DPPH i inkubuj przez 60 minut. Zmierz absorbancję przy 515 nanometrach. Użyj wzorców Trolox, aby wykreślić krzywą kalibracyjną.

Rysunek pierwszy przedstawia strukturę kwasów hydroksybenzoesowych znajdujących się w pełnych ziarnach. W obecnym badaniu kwas wanilinowy był jedynym zidentyfikowanym kwasem hydroksybenzoesowym. Rysunek drugi przedstawia strukturę kwasów hydroksycynamonowych występujących w produktach pełnoziarnistych.

W obecnym badaniu w próbkach zidentyfikowano kwas p-kumarowy, kawowy i ferulowy. W tabeli drugiej przedstawiono kwasy fenolowe zidentyfikowane w próbkach. Jak wspomniano wcześniej, kwas wanilinowy był jedynym kwasem hydroksybenzoesowym zidentyfikowanym w próbkach.

Został zidentyfikowany tylko w ekstrakcie z wspięgi chińskiej. Kwas hydroksycynamonowy, kwas kawowy zidentyfikowano tylko w fasoli, podczas gdy kwas p-kumarowy zidentyfikowano w żółtej kukurydzy, wspiędze chińskiej i soi. Kwas ferulowy zidentyfikowano we wszystkich próbkach i był on dominującym kwasem fenolowym w próbkach.

Całkowite stężenie kwasów fenolowych w kolejności od największego do najmniejszego było w kolejności soi, wspięgi, żółtej kukurydzy i fasoli lub równoważnej, a następnie pszenicy. Tabela trzecia przedstawiała całkowitą zawartość fenolu i zdolność przeciwutleniającą próbek. Zdolność przeciwutleniająca obejmowała zdolność wymiatania rodników DPPH, TEAC, ORAC i całkowitą zdolność przeciwutleniającą próbek.

Całkowita zdolność przeciwutleniająca to suma wartości DPPH, TEAC i ORAC. Podobnie jak w drugiej tabeli, soja miała najwyższą całkowitą zdolność przeciwutleniającą. Jednak zamiast wspięgi chińskiej to raczej fasola nerkowata miała drugą co do wielkości całkowitą zdolność przeciwutleniającą, chociaż wspięga chińska miała drugą najwyższą całkowitą zawartość kwasu fenolowego.

Anomalia ta jest związana ze strukturą poszczególnych kwasów fenolowych i możliwym antagonistycznym wpływem kwasu hydroksybenzoesowego kwasu wanilinowego na działanie przeciwutleniające kwasów hydroksycynamonowych w wspięgu chińskim. Badanie to wykazało, że produkty pełnoziarniste różnią się składem kwasu fenolowego. Spośród badanych produktów pełnoziarnistych soja ma największą łączną ilość kwasów fenolowych i odpowiednio najwyższą zdolność przeciwutleniającą.