Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Protokół ten służy do badania właściwości transportowych ciasnych skrzyżowań. Korzystając z potencjałów rozcieńczenia, można zmierzyć przepuszczalność i zrozumieć ścisłe połączenia w tkance. Technika ta jest specyficzna i wykorzystuje tkanki natywne do badań funkcjonalnych nabłonka.

Ponadto technika ta mierzy fizjologiczne właściwości tkanki w czasie rzeczywistym, co jest bardzo przydatne. Największym wyzwaniem jest przygotowanie tkanek. Pomocne będzie ćwiczenie techniki, a także oglądanie tego filmu.

Ważnym krokiem jest również potwierdzenie żywotności tkanek. Na początek umieść pożądane segmenty tkanki jelitowej pobranej od myszy z nokautem claudin-15 w lodowatym roztworze Ringera i odetnij tłuszcz i tkankę łączną. Po odcięciu tłuszczu i tkanki łącznej przetnij wzdłuż przyczepów krezkowych, aby otworzyć każdy segment wzdłużnie, a następnie włóż segmenty z powrotem do lodowatego roztworu Ringera i dokładnie umyj kawałki.

Aby usunąć warstwę mięśniową, wlej dwa do trzech mililitrów świeżego, lodowatego, bąbelkowego roztworu Ringera do płytki preparacyjnej pokrytej gumą silikonową pod mikroskopem preparacyjnym i użyj szpilek, aby zabezpieczyć końce jednego segmentu tkanki jelitowej w naczyniu stroną śluzówkową skierowaną w dół. Za pomocą cienkich kleszczy tępo odetnij warstwę mięśniową od leżącej pod nią błony śluzowej, uważając, aby nie rozerwać ani nie wprowadzić żadnych do tkanki. Po usunięciu warstwy mięśniowej wytnij kawałek wystarczająco duży, aby uzyskać otwór o średnicy pięciu milimetrów i umieść tkankę na kawałku pięciomilimetrowej dziurkowanej bibuły filtracyjnej zwilżonej roztworem Ringera śluzówką do dołu, używając czarnego tła, aby upewnić się, że otwór w bibule filtracyjnej jest całkowicie pokryty tkanką bez zmarszczek.

Aby zamontować preparaty jelitowe w komorze Ussing, należy najpierw wyjąć roztwór z komory, zanim zostanie on rozłożony. Połóż bibułę filtracyjną preparatem jelitowym błoną śluzową do dołu na komorze po stronie błony śluzowej, używając czarnych oznaczeń, aby wyrównać okno komory z otworem w bibule filtracyjnej. Ostrożnie połącz boczną komorę surowiczą z boczną komorą błony śluzowej, nie przesuwając arkusza jelitowego.

Szybko napełnij obie komory buforem HEPES i umieść bulgoczące komory na przeciwległym końcu każdej komory, z dala od membrany. Podłącz ponownie mostki solne i sprawdź, czy napięcie jest stabilne, a następnie pulsuj prądem, aby upewnić się, że połączenia są w porządku, zanim pozwolisz systemowi na zrównoważenie przez około 15 minut. Aby przeprowadzić eksperyment z potencjałem rozcieńczenia, najpierw umyj obie strony komory pięcioma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego buforu HEPES z każdej strony.

Włącz system nagrywania i ustaw zakres na 250 miliwoltów. Ustaw pozycje znaczników, ustaw system rejestracji na pomiar i ustaw systemy studzienek Ussing w tryb zacisku. Po ustabilizowaniu się potencjału pomiarowego wykorzystaj dane do pomiarów.

Szybko zastąp bufor HEPES od strony błony śluzowej komory pięcioma mililitrami podgrzanego buforu HEPES do rozcieńczenia uzupełnionego 75 milimolowym chlorkiem sodu. Gdy potencjał błonowy osiągnie szczyt, należy zastąpić bufor rozcieńczający od strony błony śluzowej świeżym buforem HEPES. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj 10 mikromolowych Forskolina po stronie surowiczej.

Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony. Aby zmierzyć przeznabłonkową przewodność elektryczną i podstawowy prąd zwarciowy, po umyciu obu stron komory, jak pokazano, dodaj pięć mililitrów świeżego bąbelkowego roztworu Ringera z każdej strony i ustaw zakres systemu rejestrującego na 2,5 wolta. Ustaw pozycje znaczników, ustaw system nagrywania na pomiar i ustaw system komory Ussing w trybie zaciskowym.

Po ustabilizowaniu się prądu zwarciowego i przewodności wykorzystaj dane do pomiarów bazowych. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodać Forskolina do strony surowiczej, jak pokazano. Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony

W tej reprezentatywnej analizie wyjściowe przewodnictwo przezśluzówkowe środkowego odcinka jelita cienkiego było niższe u myszy z nokautem klaudyny-15 w warunkach zwarcia w porównaniu z obserwowanym u myszy typu dzikiego, podczas gdy wyjściowy prąd zwarciowy był wyższy. Po rozcieńczeniu światłem chlorku sodu zaobserwowano dodatnią różnicę potencjału w odniesieniu do strony surowiczej u myszy typu dzikiego, ale różnica zmniejszyła się u myszy z nokautem klaudyny-15. Podobnie, względna przepuszczalność chlorku sodu była również zmniejszona u zwierząt nokautujących.

Obliczenia przepuszczalności bezwzględnej wykazały, że bezwzględna przepuszczalność sodu zmniejszyła się u myszy z nokautem klaudyny-15, podczas gdy bezwzględna przepuszczalność chlorku nie, co sugeruje, że spadek przepuszczalności względnej jest spowodowany spadkiem przepuszczalności sodu. Zgodnie z oczekiwaniami, dodanie forskoliny do surowiczej strony komory nie spowodowało znaczącej różnicy w zmianie prądu zwarciowego między myszami z nokautem a myszami typu dzikiego. Ponieważ segmenty jelitowe wykazywały wystarczająco dużą odpowiedź na forskolinę, preparaty błonowe uznano za żywotne.

Ważne jest, aby wykonać odpowiednie usunięcie warstwy mięśniowej i upewnić się, że tkanka jest żywotna. Proszę przepłukać sekcję preparacyjną myszy, czy preparat jest żywotny.