Name: Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj technikę komory Ussing do oceny przepuszczalności jonów przez połączenia ścisłe w tkance jelita myszy z nokautem genu claudin-15. Metoda pozwala badać selektywność jonową bariery nabłonkowej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest obsługiwana przez 17K00860 (do HH) i 19K20152 (do NI). WH pragnie podziękować Fundacji Stypendialnej Otsuka Toshimi za wsparcie finansowe w latach 2018-2021.

<ol><li>Ussing, H. H., Zerahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+sodium+as+the+source+of+electric+current+in+the+short-circuited+isolated+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).</li>
<li>Field, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+in+rabbit+ileal+mucosa.+II.+Effects+of+cyclic+3%27%2C+5%27-AMP%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Legacy+Content%22%5BJournal%5D)">Ion transport in rabbit ileal mucosa. II. Effects of cyclic 3', 5'-AMP.</a> American Journal of Physiology - Legacy Content. 221, 992-997 (1971).</li>
<li>Herrmann, J. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Ussing%27s+chambers%3A+contemporary+thoughts+on+integration+of+transepithelial+transport%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beyond Ussing's chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 423-431 (2015).</li>
<li>Ishizuka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Na+%2B+homeostasis+has+an+important+role+in+intestinal+peptide+absorption+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastorintestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Na + homeostasis has an important role in intestinal peptide absorption in vivo.</a> American Journal of Physiology - Gastorintestinal and Liver Physiology. 315, 799-809 (2018).</li>
<li>Ikehara, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+trypsin+induces+enteric+nerve-mediated+anion+secretion+by+activating+proteinase-activated+receptor+1+in+the+mouse+cecum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Subepithelial trypsin induces enteric nerve-mediated anion secretion by activating proteinase-activated receptor 1 in the mouse cecum.</a> Journal of Physiological Sciences. 62, 211-219 (2012).</li>
<li>Furuse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+core+structure+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the core structure of tight junctions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 002907(2010).</li>
<li>Tsukita, S., Tanaka, H., Tamura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+claudins%3A+From+tight+junctions+to+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The claudins: From tight junctions to biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44, 141-152 (2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+determine+intestinal+epithelial+cell+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability.</a> Journal of Visual Experiments: JoVE. , e57032(2018).</li>
<li>Schoultz, I., Keita, ÅV. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9, (2020).</li>
<li>Yu, A. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+cation+selectivity+in+claudin-2-based+paracellular+pores%3A+Identifi+cation+of+an+electrostatic+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: Identifi cation of an electrostatic interaction site.</a> Journal of General Physiology. 133, 111-127 (2009).</li>
<li>Kimizuka, H., Koketsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+through+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Ion transport through cell membrane.</a> Journal of Theoretical Biology. 6, 290-305 (1964).</li>
<li>Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+measurements+with+the+Ussing+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 3, 123-126 (2004).</li>
<li>Riordan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+Cloning+and+characterization+of+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA.</a> Science. 245, 1066-1073 (1989).</li>
<li>Smith, J. J., Karp, P. H., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+fluid+transport+by+cystic+fibrosis+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Defective fluid transport by cystic fibrosis airway epithelia.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 1307-1311 (1994).</li>
<li>Molinski, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orkambi+and+amplifier+co-therapy+improves+function+from+a+rare+CFTR+mutation+in+gene-edited+cells+and+patient+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Orkambi and amplifier co-therapy improves function from a rare CFTR mutation in gene-edited cells and patient tissue.</a> EMBO Molecular Medicine. 9, 1224-1243 (2017).</li>
<li>Kisser, B., et al. The Ussing chamber assay to study drug metabolism and transport in the human intestine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKisser%2C+B+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22">Current Protocols in Pharmacology</a>. 77, John Wiley & Sons, Inc. 1-19 (2017).</li>
<li>Östh, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+horizontal+Ussing+chamber+method+in+studies+of+nasal+drug+delivery+-+Method+Delopment+and+Applications+Using+Different+Formulations%22">The horizontal Ussing chamber method in studies of nasal drug delivery - Method Delopment and Applications Using Different Formulations</a>. , Uppsala University. Dissertation thesis (2002).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+penetration+mechanism+of+labrasol+on+rabbit+cornea+by+Ussing+chamber%2C+RT-PCR+assay%2C+Western+blot+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Study of penetration mechanism of labrasol on rabbit cornea by Ussing chamber, RT-PCR assay, Western blot and immunohistochemistry.</a> Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 14, 329-339 (2019).</li>
<li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Benzalkonium+Chloride+on+transscleral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of Benzalkonium Chloride on transscleral drug delivery.</a> Investigative Opthalmology & Visual Science. 46, 703(2005).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+and+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform.</a> Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).</li>
<li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megaintestine+in+claudin-15-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Megaintestine in claudin-15-deficient mice.</a> Gastroenterology. 134, 523-534 (2008).</li>
<li>Nakayama, M., Ishizuka, N., Hempstock, W., Ikari, A., Hayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-coupled+nutrient+cotransport+induced+luminal+negative+potential+and+Claudin-15+play+an+important+role+in+paracellular+Na%2B+recycling+in+mouse+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Na+-coupled nutrient cotransport induced luminal negative potential and Claudin-15 play an important role in paracellular Na+ recycling in mouse small intestine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 376(2020).</li>
<li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+claudin-15%2C+but+not+claudin-2%2C+causes+Na%2B+deficiency+and+glucose+malabsorption+in+mouse+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Loss of claudin-15, but not claudin-2, causes Na+ deficiency and glucose malabsorption in mouse small intestine.</a> Gastroenterology. 140, 913-923 (2011).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 296, (2009).</li>
<li>Dobson, J. G., Kidder, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edge+damage+effect+in+in+vitro+frog+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Edge damage effect in in vitro frog skin preparations.</a> American Journal of Physiology. 214, 719-724 (1968).</li>
<li>Corman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streaming+potentials+and+diffusion+potentials+across+rabbit+proximal+convoluted+tubule%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Streaming potentials and diffusion potentials across rabbit proximal convoluted tubule.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 403, 156-163 (1985).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+A+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: A dynamic duo.</a> Annual Review of Physiology. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Frizzell, R. A., Schultz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+conductances+of+extracellular+shunt+pathway+in+rabbit+ileum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ionic conductances of extracellular shunt pathway in rabbit ileum.</a> Journal of General Physiology. 59, 318-346 (1972).</li>
<li>Otani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudins+and+JAM-A+coordinately+regulate+tight+junction+formation+and+epithelial+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Claudins and JAM-A coordinately regulate tight junction formation and epithelial polarity.</a> Journal of Cell Biology. 218, 3372-3396 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia potencjalnych konfliktów interesów.

W tym eksperymencie wykorzystano komory Ussinga do pomiaru podstawowych parametrów elektrycznych i potencjału rozcieńczania NaCl w jelicie cienkim myszy Cldn15-/- i WT. Bardzo ważne jest, aby podczas wykonywania doświadczeń w komorze Ussinga sprawdzić, czy preparat membranowy użyty w eksperymentach jest opłacalny. Zwykle odbywa się to poprzez dodanie glukozy lub aktywatora cyklazy adenylanowej forskoliny i sprawdzenie, czy występuje odpowiedni wzrost Isc (100-300 μA /cm2...

Metoda komory Ussing została po raz pierwszy opracowana przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga. Ussing po raz pierwszy użył go do pomiaru prądu zwarciowego transportu sodu przez skórę żaby po tym, jak zaobserwowano, że NaCl może być transportowany przez skórę przy stromym gradiencie stężeń1. Jego system składał się ze skóry żaby umieszczonej między dwiema komorami z dostępem po obu stronach skóry. Każda komora zawierała roztwór Ringera, który był cyrkulowany i napowietrzany. Dwa wąskie mostki agarowe umieszczone w pobliżu skóry i połączone z nasyconymi elektrodami KCl-kalomelowymi mierzyły różnicę potencjałów odczytywaną przez wzmacniacz. Druga para mostków pierścieniowych agaru znajdowała się na przeciwległym końcu każdej komory, połączona ze zlewkami z nasyconym KCl nasyconym AgCl w celu przyłożenia siły elektromotorycznej dostarczanej przez baterię. Dzielnik potencjału został użyty do regulacji napięcia w taki sposób, aby różnica potencjałów w poprzek powłoki pozostała zerowa, tworząc w ten sposób warunki zwarciowe. Podłączono również mikroamperomierz do odczytu prądu przepływającego przez powłokę (patrz rysunek w ref.1 dla oryginalnego projektu komory).
W ciągu ostatnich 70 lat, technika ta była stosowana do wielu różnych tkanek, szczególnie tkanki jelitowej, do badania transportu składników odżywczych i jonów. Na przykład, mechanizm biegunki wywołanej został zbadany poprzez zamontowanie jelita krętego królika w tych komorach i stwierdzono, że biegunka wywołana toksyną jest wywoływana przez cAMP2. Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania mechanizmu leżącego u podstaw transportu glukozy przez kotransporter Na+-glukozy 1 (SGLT1)3. Nasze laboratorium koncentruje się na transporcie transkomórkowym i parakomórkowym w komórkach nabłonka jelitowego. Stosując metodę komory Usinga, transport peptydów oceniano u myszy z nokautem Claudin 15, które mają upośledzony parakomórkowy transport sodu, używając komór Ussinga do pomiaru wchłaniania niehydrolizowanego dipeptydu glicylosarkozyny. Stwierdzono, że homeostaza luminalnego Na+ jest ważna dla transportu peptydów sprzężonych z protonami4. Ponadto komory te wykorzystano również do zbadania wydzielania anionów w mysim jelicie ślepym w odpowiedzi na podśluzówkową aktywację receptora 1 aktywowanego proteinazą przez proteazę serynową trypsin5.
Komory Ussingowe są ostatnio używane do oceny ścieżek parakomórkowych w tkance nabłonkowej. Szlaki parakomórkowe są regulowane przez ścisłe połączenia, które są kompleksami białek, które tworzą się w punkcie, w którym spotykają się dwie lub więcej komórek6. Funkcja bariery i selektywność jonowa (czy aniony lub kationy są selektywnie zdolne do przechodzenia przez ścisłe połączenie) są określane przez obecność białek z rodziny klaudyny; Niektóre z nich działają jako bariery (klaudyna 3 i 7), pory anionowe (kludyna 10a) lub pory kationowe (klaudyna 2, 10b i 15)<klasa SUP="xref">7. Do oceny szlaku parakomórkowego zastosowano inne metody, takie jak zgłębnik FITC w jamie ustnej w połączeniu ze stężeniem FITC w osoczu krwi8, lub EDTA-Cr9; Techniki te mają jednak niższą rozdzielczość i nie mogą ocenić selektywności jonowej ani określonego odcinka odcinka przewodu pokarmowego. Komory Ussing mogą być jednak wykorzystywane do oceny potencjału rozcieńczania jonów docelowych, a tym samym do określania selektywności jonowej połączeń ścisłych. Na przykład w przypadku NaCl selektywność połączeń ścisłych dla Na+ i Cl- można obliczyć, rozcieńczając jedną stronę błony (zwykle stronę błony śluzowej) i mierząc zmianę różnicy potencjału przeznabłonkowego. Względną przepuszczalność Na+ i Cl- można oszacować za pomocą równania Goldmana-Hodgkina-Katza10, a selektywność ciasnego połączenia można oszacować za pomocą równania Kimizuka-Koketsu11. Komory te mają zatem tę zaletę, że mierzą parametry elektrofizjologiczne tkanek i w efekcie dostarczają więcej informacji o przechodzeniu jonów przez złącza ścisłe niż inne metody o niższej rozdzielczości.
Metoda komory Ussinga nie ogranicza się tylko do przewodu pokarmowego, chociaż jest szeroko stosowana w badaniach dotyczących jelit, ma również wiele innych zastosowań. Na przykład, komory te były używane do badania mukowiscydozy, a w szczególności transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) kanału chlorkowego mukowiscydozy (CFTR)12. Mukowiscydoza jest spowodowana mutacją w CFTR13, która powoduje upośledzenie wydzielania chlorków i transportu płynów przez komórki nabłonka oddechowego, co skutkuje grubszą, bardziej suchą warstwą śluzu14. Badanie nabłonka dróg oddechowych CFTR zostało przeprowadzone za pomocą tych komór, aby nie tylko zrozumieć chorobę, ale także odkryć sposoby leczenia choroby. Na przykład u pacjentów z rzadkimi mutacjami powodującymi mukowiscydozę analiza komórek nabłonka oddechowego pacjenta została wykorzystana do przetestowania terapii, takich jak Orkambi i koterapia wzmacniacza15.
Komory użytkowe były również wykorzystywane do badania dróg dostarczania leków, takich jak ludzka biopsja tkanek do badania absorpcji leku i farmakokinetyki16. Wychwyt jelitowy nie jest jedyną drogą dostarczania leków. Komory te były również wykorzystywane do badania donosowych systemów dostarczania leków17. Przeprowadzono również badania nad podawaniem leków za pomocą komór Ussinga dla oka. W rogówce królika przeprowadzono badania przepuszczalności i wychwytu z użyciem leku Labrasol, który ma na celu zwiększenie wchłaniania leków przez tkanki18. W innym badaniu badano wpływ chlorku benzylalkoniowego na przeztwardówkowe dostarczanie leków w klasie królika sclera<sup="xref">19.
Metoda komory Ussing jest użyteczna, ponieważ można użyć natywnej tkanki. W związku z tym jest lepszy od modeli in vitro, takich jak linie komórkowe Caco-2. Jednak technika ta wymaga umiejętności i czasu na przygotowanie próbek, więc nie nadaje się do zastosowań o dużej przepustowości. Właściwości elektrofizjologiczne monowarstw komórkowych można badać za pomocą wkładek do hodowli komórkowych w tych komorach. Ostatnie odkrycia pozwoliły na hodowlę organoidów, które są mini-organami wyhodowanymi w kulturze z pozyskania komórek macierzystych nabłonka lub śródbłonka20. Kulturą organoidów można manipulować tak, aby rosła w monowarstwie, co umożliwia montowanie organoidów w komorze Ussinga21. Można badać organoidy różnych tkanek nabłonka i śródbłonka, zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt, ponieważ hodowla organoidów może być utrzymywana przez długi czas. Zwiększy to również przepustowość, ponieważ nie będzie konieczne czasochłonne i pracochłonne rozwarstwianie tkanek oraz etapy przygotowania. W przyszłości badania w komorze Ussing będą nadal bardzo przydatne w badaniu transportu tkanek i będą szczególnie ważne w dziedzinie medycyny spersonalizowanej.
Poniższy protokół demonstruje zastosowanie metody komory Ussinga do oceny permselektywności i funkcji barierowej połączeń ścisłych w jelicie cienkim myszy z nokautem Claudin 15 (Cldn15-/-) i kontroli typu dzikiego (WT) poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl. Połączenia ścisłe (TJ) powstają w miejscu, w którym dwie lub więcej komórek spotyka się w tkance nabłonkowej i śródbłonka. Uważa się, że dwukomórkowe połączenia ścisłe (bTJ), w szczególności białka z rodziny klaudyny znajdujące się w bTJ, determinują funkcję bariery i permselektywność TJ7. Myszy Cldn15-/- mają mega jelito cienkie22 i zmniejszoną zdolność pobierania składników odżywczych z powodu utraty recyklingu jelitowego Na+, który następuje przez klaudinę 154,23,24. Myszy Cldn15-/- mają upośledzoną homeostazę Na+, co czyni je interesującym modelem do badania permselektywności TJ. Poniższy protokół ocenia przepuszczalność TJ dla NaCl poprzez pomiar potencjału rozcieńczania NaCl (PNa / PCl) w środkowym jelicie cienkim. Krótko mówiąc, zmiana różnicy potencjałów błony, która następuje przez rozcieńczenie jednej strony membrany (strona M lub strona S, obie są mierzone w poniższym protokole) można wykorzystać do obliczenia przepuszczalności Na+ (PNa) i Cl- (PCl), a potencjał rozcieńczenia (PNa / PCl) pokaże, czy ścisłe połączenie ma selektywność kationową czy anionową.
Eksperymenty w tym protokole zostały przeprowadzone przy użyciu dostosowanej komory Ussing (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), która składa się z dwóch połówek, pomiędzy którymi preparacja jelitowa jest zamontowana pionowo, wzmacniacz cęgowy napięcia, rejestrator elektryczny, elektrody, mostki solne, roztwór Ringera, bufor HEPES (150 mM NaCl), rozcieńczony bufor HEPES (75 mM NaCl), preparat jelitowy (szczegóły dotyczące sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów).

<table><tbody><tr><td>#3 rurki polietylenowe</td><td>Hibiki</td><td></td><td>średnica zewnętrzna 1,0 mm; średnica wewnętrzna 0,5 mm</td></tr><tr><td>#7 rurki polietylenowe</td><td>Hibiki</td><td></td><td>średnica zewnętrzna 2,3 mm; średnica wewnętrzna 1,3 mm</td></tr><tr><td>Strzykawka blokująca 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10LZ</td><td>Strzykawki blokujące są niezbędne, aby zapobiec przemieszczaniu się igły podczas napełniania</td></tr><tr><td>igły 19 g</td><td>Terumo</td><td>NN-1938R</td><td>Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre</td></tr> przedmioty <tr><td>Igła 23 g</td><td>Terumo</td><td>NN-2332R</td><td>Zachowaj ostrożność podczas pracy z igłami i wyrzuć do pojemnika na ostre przedmioty</td></tr><tr><td>Dziurkacz 5 mm</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Służy do przebijania otworów w bibule filtracyjnej i parafilmie</td></tr><tr><td>igły do akupunktury</td><td>Seirin</td><td>NS</td><td>Używany jako szpilki preparacyjne do przypinania tkanki do płytki rozwarstwiającej</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fujifilm Wako</td><td>010-15815</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski krokodylkowe</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Łączy elektrodę ze wzmacniaczem</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fujifilm Wako</td><td>038-00445</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-mannitol</td><td>Fujifilm Wako</td><td>133-00845</td><td>Służy do korygowania różnicy osmolalności w rozcieńczeniu Bufor HEPES</td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza</td><td>Fujifilm Wako</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr>Zestaw <td></td><td></td><td>do preparacji</td><td>Będziesz potrzebować, nożyczki i zakrzywione kleszcze</td></tr><tr><td>Płytki</td><td></td><td></td> preparacyjne <td>Użyliśmy 10 cm płytek do hodowli komórkowych i pokrytych gumą silikonową</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301-500ML</td><td>Do robienia zapasu forskoliny</td></tr><tr><td>Rejestrator elektryczny</td><td>TOA Electronics</td><td>PRR-5041</td><td>Inne równoważne rejestratory elektryczne są dostępne na rynku</td></tr><tr><td>Nabłonkowy wzmacniacz cęgowy</td><td>Nihon Kohden CEZ9100</td><td></td><td>Inne równoważne wzmacniacze są dostępne komercyjnie</td></tr><tr><td>bibuła filtracyjna, pocięta na kwadraty</td><td></td><td>NA NA</td><td>Dziurkowany dziurkaczem 5 mm, służy do przytrzymywania preparatu jelitowego</td></tr><tr><td>drobne kleszcze</td><td>Fast Gene</td><td>FG-B50476</td><td>Do rozwarstwienia warstwy mięśniowej</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Alomone Labs</td><td>F-500</td><td>Zrób 10 mM zapasów w DMSO, końcowe stężenie wyniesie 10 i mikro; M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I7338-5G</td><td>Zrób 1 mM zapas w 21 mM NaHCO3, końcowe stężenie wynosi 10 &mikro; M</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fujifilm Wako</td><td>164-04295</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>KCl/elektroda kalomelowa</td><td>Asch Japan Co.</td><td>SCE-100</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Kanto chemical</td><td>32379-00</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Glutamina</td><td>Fujifilm Wako</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fujifilm Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Gaz mieszany (95% O2/5% CO2)</td><td>Shizuoka Oxygen Company</td><td></td><td>Służy do bulgotania roztworu Ringera i komór podczas korzystania z roztworu Ringera</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda NaCl</td><td>NA</td><td></td><td>NA Ręcznie robione elektrody, które wymagają skoncentrowanego NaCl i drutu srebrnego</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fujifilm Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>O2 Gas</td><td>Shizuoka Oxygen Company</td><td></td><td>Służy do komór bąbelkowania podczas korzystania z parafilmu buforowego HEPES</td></tr><tr><td></td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Służy do uszczelniania komór Ussing</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>DKK-TOA Corp</td><td>HM-305</td><td>Bufor HEPES należy dostosować do pH 7,4 przy 37 & stopniach; C</td></tr><tr><td>Elektroda pH-TOA</td><td>Corp</td><td>GST-5311C</td><td></td></tr><tr><td>guma silikonowa</td><td>Shinetsu Chemical</td><td>KE-12</td><td>Służy do wypełniania płytek rozwarstwiających</td></tr><tr><td>srebrny drut</td><td></td><td></td><td>Służy do produkcji elektrod NaCl</td></tr><tr><td>Małe słoiki z plastikowymi pokrywkami</td><td></td><td>NA NA Służy</td><td>do elektrod NaCl</td></tr><tr><td>stereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 305</td><td>Mikroskop stereoskopowy pozwala zobaczyć głębię, dzięki czemu można łatwiej wypreparować tkankę</td></tr><tr><td>Tris (podstawa Trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Przygotuj roztwór 1M do regulacji pH HEPES</td></tr><tr><td>Komory uspensowe</td><td>Sanki Kagaku Kougei</td><td></td><td>Komory te są wykonywanymi na zamówienie komorami z ciągłą perfuzją o średnicy okna 5 mm</td></tr><tr><td>Pompa wodna i system grzewczy</td><td>Tokyo Rikakikai Co., Ltd.</td><td>Zobacz materiał NTT-110</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Functional Assessment of Intestinal Tight Junction Barrier and Ion Permeability in Native Tissue by Ussing Chamber Technique

Technika komory Ussing została po raz pierwszy wynaleziona przez duńskiego naukowca Hansa Ussinga w 1951 roku w celu zbadania transkomórkowego transportu sodu przez skórę żaby. Od tego czasu technika ta została zastosowana do wielu różnych tkanek w celu zbadania fizjologicznych parametrów transportu przez błony. Metoda komory Ussinga jest lepsza od innych metod, ponieważ można wykorzystać tkankę natywną, dzięki czemu ma ona większe zastosowanie do tego, co dzieje się in vivo. Jednak ze względu na to, że używana jest tkanka natywna, przepustowość jest niska, czas jest ograniczony, a przygotowanie tkanek wymaga umiejętności i szkolenia. Komory te zostały wykorzystane do badania specyficznych białek transportowych w różnych tkankach, zrozumienia patofizjologii chorób, takich jak mukowiscydoza, badania transportu i wychwytu leków, a zwłaszcza przyczyniły się do zrozumienia transportu składników odżywczych w jelicie. Biorąc pod uwagę cały proces transportu nabłonkowego tkanki, ważne są nie tylko szlaki transnabłonkowe, ale także szlaki parakomórkowe. Połączenia ścisłe są kluczowym wyznacznikiem specyficznej dla tkanek przepuszczalności parakomórkowej w jelicie. W tym artykule technika komory Ussinga zostanie wykorzystana do oceny parakomórkowej przepuszczalności jonów poprzez pomiar przeznabłonkowego przewodnictwa i potencjałów rozcieńczenia.

Wyniki przedstawione w niniejszej pracy stanowią część większego, zakończonego już projektu (patrz ref.4,23,24).
Przewodnictwo elektryczne transepitelialne jelita cienkiego jest zmniejszone u myszy Cldn15-/-. 
Bazowe przewodnictwo transmukozalne (w warunkach zwarcia) środkowego segmentu jelita cienkiego u myszy ...

Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.

Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

The Ussing chamber technique was first invented by the Danish scientist Hans Ussing in 1951 to study the transcellular transport of sodium across frog ...

Protokół ten służy do badania właściwości transportowych ciasnych skrzyżowań. Korzystając z potencjałów rozcieńczenia, można zmierzyć przepuszczalność i zrozumieć ścisłe połączenia w tkance. Technika ta jest specyficzna i wykorzystuje tkanki natywne do badań funkcjonalnych nabłonka.Ponadto technika ta mierzy fizjologiczne właściwości tkanki w czasie rzeczywistym, co jest bardzo przydatne. Największym wyzwaniem jest przygotowanie tkanek. Pomocne będzie ćwiczenie techniki, a także oglądanie tego filmu.Ważnym krokiem jest również potwierdzenie żywotności tkanek. Na początek umieść pożądane segmenty tkanki jelitowej pobranej od myszy z nokautem claudin-15 w lodowatym roztworze Ringera i odetnij tłuszcz i tkankę łączną. Po odcięciu tłuszczu i tkanki łącznej przetnij wzdłuż przyczepów krezkowych, aby otworzyć każdy segment wzdłużnie, a następnie włóż segmenty z powrotem do lodowatego roztworu Ringera i dokładnie umyj kawałki.Aby usunąć warstwę mięśniową, wlej dwa do trzech mililitrów świeżego, lodowatego, bąbelkowego roztworu Ringera do płytki preparacyjnej pokrytej gumą silikonową pod mikroskopem preparacyjnym i użyj szpilek, aby zabezpieczyć końce jednego segmentu tkanki jelitowej w naczyniu stroną śluzówkową skierowaną w dół. Za pomocą cienkich kleszczy tępo odetnij warstwę mięśniową od leżącej pod nią błony śluzowej, uważając, aby nie rozerwać ani nie wprowadzić żadnych do tkanki. Po usunięciu warstwy mięśniowej wytnij kawałek wystarczająco duży, aby uzyskać otwór o średnicy pięciu milimetrów i umieść tkankę na kawałku pięciomilimetrowej dziurkowanej bibuły filtracyjnej zwilżonej roztworem Ringera śluzówką do dołu, używając czarnego tła, aby upewnić się, że otwór w bibule filtracyjnej jest całkowicie pokryty tkanką bez zmarszczek.Aby zamontować preparaty jelitowe w komorze Ussing, należy najpierw wyjąć roztwór z komory, zanim zostanie on rozłożony. Połóż bibułę filtracyjną preparatem jelitowym błoną śluzową do dołu na komorze po stronie błony śluzowej, używając czarnych oznaczeń, aby wyrównać okno komory z otworem w bibule filtracyjnej. Ostrożnie połącz boczną komorę surowiczą z boczną komorą błony śluzowej, nie przesuwając arkusza jelitowego.Szybko napełnij obie komory buforem HEPES i umieść bulgoczące komory na przeciwległym końcu każdej komory, z dala od membrany. Podłącz ponownie mostki solne i sprawdź, czy napięcie jest stabilne, a następnie pulsuj prądem, aby upewnić się, że połączenia są w porządku, zanim pozwolisz systemowi na zrównoważenie przez około 15 minut. Aby przeprowadzić eksperyment z potencjałem rozcieńczenia, najpierw umyj obie strony komory pięcioma mililitrami świeżego, wstępnie podgrzanego buforu HEPES z każdej strony.Włącz system nagrywania i ustaw zakres na 250 miliwoltów. Ustaw pozycje znaczników, ustaw system rejestracji na pomiar i ustaw systemy studzienek Ussing w tryb zacisku. Po ustabilizowaniu się potencjału pomiarowego wykorzystaj dane do pomiarów.Szybko zastąp bufor HEPES od strony błony śluzowej komory pięcioma mililitrami podgrzanego buforu HEPES do rozcieńczenia uzupełnionego 75 milimolowym chlorkiem sodu. Gdy potencjał błonowy osiągnie szczyt, należy zastąpić bufor rozcieńczający od strony błony śluzowej świeżym buforem HEPES. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodaj 10 mikromolowych Forskolina po stronie surowiczej.Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony. Aby zmierzyć przeznabłonkową przewodność elektryczną i podstawowy prąd zwarciowy, po umyciu obu stron komory, jak pokazano, dodaj pięć mililitrów świeżego bąbelkowego roztworu Ringera z każdej strony i ustaw zakres systemu rejestrującego na 2,5 wolta. Ustaw pozycje znaczników, ustaw system nagrywania na pomiar i ustaw system komory Ussing w trybie zaciskowym.Po ustabilizowaniu się prądu zwarciowego i przewodności wykorzystaj dane do pomiarów bazowych. Aby upewnić się, że tkanka jest żywotna, dodać Forskolina do strony surowiczej, jak pokazano. Gdy różnica potencjałów błony osiągnie szczyt i zacznie spadać, eksperyment jest zakończony.W tej reprezentatywnej analizie wyjściowe przewodnictwo przezśluzówkowe środkowego odcinka jelita cienkiego było niższe u myszy z nokautem klaudyny-15 w warunkach zwarcia w porównaniu z obserwowanym u myszy typu dzikiego, podczas gdy wyjściowy prąd zwarciowy był wyższy. Po rozcieńczeniu światłem chlorku sodu zaobserwowano dodatnią różnicę potencjału w odniesieniu do strony surowiczej u myszy typu dzikiego, ale różnica zmniejszyła się u myszy z nokautem klaudyny-15. Podobnie, względna przepuszczalność chlorku sodu była również zmniejszona u zwierząt nokautujących.Obliczenia przepuszczalności bezwzględnej wykazały, że bezwzględna przepuszczalność sodu zmniejszyła się u myszy z nokautem klaudyny-15, podczas gdy bezwzględna przepuszczalność chlorku nie, co sugeruje, że spadek przepuszczalności względnej jest spowodowany spadkiem przepuszczalności sodu. Zgodnie z oczekiwaniami, dodanie forskoliny do surowiczej strony komory nie spowodowało znaczącej różnicy w zmianie prądu zwarciowego między myszami z nokautem a myszami typu dzikiego. Ponieważ segmenty jelitowe wykazywały wystarczająco dużą odpowiedź na forskolinę, preparaty błonowe uznano za żywotne.Ważne jest, aby wykonać odpowiednie usunięcie warstwy mięśniowej i upewnić się, że tkanka jest żywotna. Proszę przepłukać sekcję preparacyjną myszy, czy preparat jest żywotny.

functional-assessment-intestinal-tight-junction-barrier-ion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Organiczny tranzystor elektrochemiczny jest zintegrowany z żywymi komórkami i służy do monitorowania przepływu jonów przez barierę nabłonkową przewodu pokarmowego. W tym badaniu mierzony jest wzrost strumienia jonów, związany z rozerwaniem połączeń ścisłych, wywołany obecnością chelatora wapnia EGTA (glikol etylenowy-bis(beta-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-tetraoctowy kwas).

Wykrywanie przerwania tkanki barierowej za pomocą organicznego tranzystora elektrochemicznego

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Poznaj technikę komory Ussing do oceny przepuszczalności jonów przez połączenia ścisłe w tkance jelita myszy z nokautem genu claudin-15. Metoda pozwala badać selektywność jonową bariery nabłonkowej in vivo.

Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Przeglądaj więcej filmów