Name: Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj metody indukcji komórek macierzystych miazgi zębowej w kierunku komórek trzustkowych in vitro. Protokoły integracyjny i nieintegracyjny pozwalają uzyskać funkcjonalne komórki produkujące insulinę.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SK, WR i QDL były wspierane przez Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University. TO i PP były wspierane przez Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2 nd Century Project. CS był wspierany przez grant wspierający badania Wydziału Nauk Weterynaryjnych, Chulalongkorn Academic Advancement into Its 2Nd Century Project, Veterinary Stem Cell and Bioengineering Research Unit, Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund, Chulalongkorn University oraz Government Research Fund.

Ta praca została wykonana zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzona przez Komitet Etyki Badań Naukowych na Ludziach, Wydział Stomatologii Uniwersytetu Chulalongkorn. Ludzkie DPSC (hDPSC) wyizolowano z ludzkich tkanek miazgi zębowej pobranych zarówno z zębów przedtrzonowych, jak i trzonowych z powodu problemów z zębami mądrości. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów zgodnie z zatwierdzonym protokołem (HREC-DCU 2018/054).
1. Protokół indukcji integracyjnej
<ol>
	<li>Przygotowanie wektora lentiwirusowego przenoszącego PDX1
	<ol>
		<li>Użyj ludzkich komórek nerki embrionalnej (HEK) 293FT do pakowania wirusa. Hoduj i utrzymuj te komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyko-przeciwgrzybiczej.</li>
		<li>Generuj wektory PDX1-lentiwirusa przez kotransfekcję 10 μg każdego z plazmidów pakujących i otoczkowych oraz 20 μg docelowego plazmidu genu do komórek HEK293FT za pomocą systemu transfekcji fosforanu wapnia, np. psPAX2, pMD2.G i ludzka klasa pWPT-PDX1<sup="xref">11. Upewnij się, że komórki zlewają się w 80%-90% w czasie infekcji.</li>
		<li>Zebrać pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusa po 48 i 72 godzinach od transfekcji.</li>
		<li>Przefiltrować zebrane podłoże przez filtr 0,45 μm; zagęścić wirusy za pomocą filtra odśrodkowego przy granicy nominalnej masy cząsteczkowej 100 kDa (NMWCO).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nadekspresja PDX1 
	<ol>
		<li>Użyj pasaży 3-5 hDPSC, które są zlewające się w 70-80%. Trypsynizuj i policz komórki za pomocą licznika komórek. Wysiewać 1 x 106 hDPSC na 60-milimetrowej szalce poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubować przez noc.</li>
		<li>24 godziny później dodać świeże cząsteczki wirusa uzyskane w kroku 1.1.4 w celu transdukcji komórek poddanych wstępnej obróbce polibrenu (4 μg/ml polibrenu, 30 minut w temperaturze poniżej 37 °C i 5% CO2 ) przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Na przykład w tym przypadku używany MOI to 20. Utrzymać komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
		<li>Po 24 godzinnym okresie infekcji należy wyrzucić pożywkę zawierającą cząsteczki wirusa. Dodać świeże pożywki hodowlane i kontynuować hodowlę komórek przez 48 godzin. Wszystkie kultury są utrzymywane w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Sprawdź zagregowaną morfologię transfekowanych komórek przed przejściem do etapu indukcji. Transdukcja PDX1 jest potwierdzana przez analizę ekspresji genów (rysunek uzupełniający 1). 
		UWAGA: Sprawdź morfologię komórki pod mikroskopem przed przejściem do kolejnych kroków.</li>
		<li>Zebrać i przejść do trzyetapowego protokołu indukcji (krok 1.3) jako podejścia do indukcji mikrośrodowiskowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzystopniowy protokół indukcyjny 
	UWAGA: Trzyetapowy protokół indukcji spowodował serię różnicowania trzustki hDPSC do ostatecznej endodermy, endodermy trzustki / endokrynologicznej i komórek beta trzustki / IPC przy użyciu odpowiednio pożywki wolnej od surowicy (SFM)-A, SFM-B i SFM-C.
	<ol>
		<li>Wyrzuć pożywkę hodowlaną, a następnie przemyj transdukowane hDPSC 1x roztworem buforowanym fosforanem (PBS).</li>
		<li>Dodać 0,25% roztwór trypsyny-EDTA do komórek i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Dodaj pożywkę hodowlaną, aby zatrzymać aktywność trypsyny i delikatnie przepłucz komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Policz komórki i podnieś 1 x 106 komórek do każdej probówki zbiorczej.</li>
		<li>Zawiesinę komórek odwirować w temperaturze 468 x g (względna siła odśrodkowa: RCF), 4 °C, przez 5 minut. Odrzucić supernatant i zachować osad komórkowy.</li>
		<li>Zawiesić osad w 3 ml pierwszej pożywki indukcyjnej trzustki, tj. pożywki bez surowicy (SFM)-A. Wysiewać komórki na płytce hodowlanej o niskim przyczepie (60 mm). Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni. 
		UWAGA: Obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem przed przejściem do następnego kroku.</li>
		<li>Usuń SFM-A i dodaj 3 ml drugiej pożywki indukcyjnej, tj. SFM-B. Utrzymuj komórki przez następne 2 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 
		UWAGA: Obserwuj morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem przed przejściem do następnego kroku.</li>
		<li>Usunąć SFM-B i dodać 3 ml trzeciego podłoża indukcyjnego, tj. SFM-C. Utrzymać komórki przez następne 5 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 48 godzin. Obserwuj ich morfologię po 5 dniach. 
		UWAGA: Każde podłoże indukcyjne jest uzupełnione różnymi odczynnikami zgodnie z opisem; SFM-A: 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 1x insulina-transferyna-selen (ITS), 4 nM aktywiny A, 1 nM maślanu sodu i 50 μM beta-merkaptoetanolu; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS i 0,3 mM tauryna; i SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM tauryna, 100 nM peptydu glukagonopodobnego (GLP)-1, 1 mM nikotynamidu i 1x aminokwasy endogenne (NEAA).</li>
		<li>Upewnij się, że sprawdziłeś morfologię komórki pod odwróconym mikroskopem po każdym kroku. Komórki staną się bardziej zagregowane i unoszą się jako kolonie.</li>
		<li>Zbierz kolonie komórek do dalszej analizy. Sprawdź morfologię i wielkość kolonii. Wykonaj analizę ekspresji markerów genowych trzustki i analizę funkcjonalną (test wydzielania peptydu C stymulowany glukozą).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół indukcji nieintegracyjnej
UWAGA: Protokół nieintegracyjny jest podstawowym protokołem do dostarczania IPC z trzyetapowym procesem indukcji jako podejście do indukcji mikrośrodowiskowej8,9.
<ol>
	<li>Użyj przejścia 3-5 hDPSC przy zbiegowiźnie 70%-80%.</li>
	<li>Odrzucić pożywkę hodowlaną i przemyć hDPSC 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 0,25% roztwór trypsyny-EDTA na komórki i inkubować przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Dodaj pożywkę hodowlaną, aby zatrzymać aktywność trypsyny i delikatnie pipetuj komórki, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Policz komórki i podwielokrotność 1 x 106 komórek do każdej probówki zbiorczej.
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 468 x g (RCF), 4 °C, 5 min. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w SFM-A i wysiać nasiona na niskiej płytce hodowlanej (60 mm). Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 dni. Sprawdź morfologię komórki pod odwróconym mikroskopem.</li>
		<li>Usuń SFM-A, dodaj SFM-B (dzień 3), a następnie utrzymuj komórki przez następne 2 dni w temperaturze poniżej 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Usuń SFM-B, dodaj SFM-C (dzień 5), a następnie utrzymuj komórki przez następne 5 dni w temperaturze poniżej 37 °C, 5% CO2 . SFM-C jest wymieniany co 48 godz. 
		UWAGA: Każde podłoże indukcyjne jest uzupełnione różnymi odczynnikami zgodnie z opisem; SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM aktywiny A, 1 nM maślanu sodu i 50 μM beta-merkaptoetanolu; SFM-B: 1% BSA, 1x ITS i 0,3 mM tauryna; i SFM C: 1,5% BSA, 1x ITS, 3 mM tauryna, 100 nM GLP-1, 1 mM nikotynamidu i 1x NEAA.</li>
		<li>Upewnij się, że sprawdziłeś morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem po każdym kroku i w dniu 10. 
		UWAGA: Komórki staną się bardziej zagregowane i będą unosić się jako kolonie.</li>
		<li>Zbierz kolonie komórek do dalszej analizy. Sprawdź morfologię i wielkość kolonii. Wykonaj analizę ekspresji markerów genowych trzustki i analizę funkcjonalną (test wydzielania peptydu C stymulowany glukozą).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cho, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+diabetes+atlas%3A+Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2017+and+projections+for+2045%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).</li>
<li>Danaei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National%2C+regional%2C+and+global+trends+in+fasting+plasma+glucose+and+diabetes+prevalence+since+1980%3A+systematic+analysis+of+health+examination+surveys+and+epidemiological+studies+with+370+country-years+and+2.7+million+participants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants.</a> Lancet. 378 (9785), 31-40 (2011).</li>
<li>Diabetes Care. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+hypoglycemia+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Minimizing hypoglycemia in diabetes.</a> Diabetes Care. 38 (8), 1583(2015).</li>
<li>Health Quality Ontario. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation%3A+an+evidence-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ontario+Health+Technology+Assessment+Series%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation: an evidence-based analysis.</a> Ontario Health Technology Assessment Series. 3 (4), 1-45 (2003).</li>
<li>Brennan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+the+Edmonton+protocol+of+islet+transplantation+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of the Edmonton protocol of islet transplantation in the United States.</a> American Journal of Transplantation. 16 (2), 509-517 (2016).</li>
<li>Korsgren, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+encapsulation%3A+Physiological+possibilities+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Islet encapsulation: Physiological possibilities and limitations.</a> Diabetes. 66 (7), 1748-1754 (2017).</li>
<li>Kuncorojakti, S., Srisuwatanasagul, S., Kradangnga, K., Sawangmake, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Producing+Cell+Transplantation+Platform+for+Veterinary+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Insulin-Producing Cell Transplantation Platform for Veterinary Practice.</a> Frontiers in Veterinary Science. 7, 4(2020).</li>
<li>Sawangmake, C., Nowwarote, N., Pavasant, P., Chansiripornchai, P., Osathanon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feasibility+study+of+an+in+vitro+differentiation+potential+toward+insulin-producing+cells+by+dental+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A feasibility study of an in vitro differentiation potential toward insulin-producing cells by dental tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (3), 581-587 (2014).</li>
<li>Sawangmake, C., Rodprasert, W., Osathanon, T., Pavasant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+protocols+for+an+in+vitro+generation+of+pancreatic+progenitors+from+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative protocols for an in vitro generation of pancreatic progenitors from human dental pulp stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 530 (1), 222-229 (2020).</li>
<li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%2FPluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).</li>
<li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li>
<li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
<li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA%2Fnanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li>
<li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).</li>
<li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li>
<li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+%CE%B2-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li>
<li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX1%2C+Neurogenin-3%2C+and+MAFA%3A+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+transcriptome+profiling+of+progenitor-like+colonies+derived+from+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 172(2017).</li>
<li>Tiedemann, H. B., Schneltzer, E., Beckers, J., Przemeck, G. K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hrabe+de+Angelis%2C+M.+Modeling+coexistence+of+oscillation+and+Delta%2FNotch-mediated+lateral+inhibition+in+pancreas+development+and+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hrabe de Angelis, M. Modeling coexistence of oscillation and Delta/Notch-mediated lateral inhibition in pancreas development and neurogenesis.</a> Journal of Theoretical Biology. 430, 32-44 (2017).</li>
<li>Xu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+promotes+the+differentiation+of+human+dental+pulp+mesenchymal+stem+cells+into+insulin-producing+cells+for+improving+the+diabetes+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture promotes the differentiation of human dental pulp mesenchymal stem cells into insulin-producing cells for improving the diabetes therapy.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1576(2019).</li>
<li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+under+microgravity+conditions-use+of+stem+cells+and+specialized+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells.</a> Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).</li>
<li>Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+clustering+enhances+PDX1+and+NKX6.1+expression+in+pancreatic+endoderm+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).</li>
<li>Li, X. Y., Zhai, W. J., Teng, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in pancreatic development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 48(2015).</li>
<li>Motoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+specific+soluble+factors+promotes+the+functional+maturation+of+transcription+factor-mediated%2C+pancreatic+transdifferentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Treatment with specific soluble factors promotes the functional maturation of transcription factor-mediated, pancreatic transdifferentiated cells.</a> PLoS One. 13 (5), 0197175(2018).</li>
<li>Baldan, J., Houbracken, I., Rooman, I., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+pancreatic+acinar+cells+dedifferentiate+into+an+embryonic+progenitor-like+state+in+3D+suspension+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Adult human pancreatic acinar cells dedifferentiate into an embryonic progenitor-like state in 3D suspension culture.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4040(2019).</li>
<li>Wedeken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+murine+pancreatic+progenitors+require+epidermal+growth+factor+and+nicotinamide+for+self-renewal+and+differentiation+in+a+serum-+and+conditioned+medium-free+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Adult murine pancreatic progenitors require epidermal growth factor and nicotinamide for self-renewal and differentiation in a serum- and conditioned medium-free culture.</a> Stem Cells and Development. 26 (8), 599-607 (2017).</li>
<li>Trott, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+self-renewing+pancreatic+progenitors+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of self-renewing pancreatic progenitors derived from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1675-1688 (2017).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+EMSC-islet+co-localizing+composites+for+xenogeneic+porcine+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Construction of EMSC-islet co-localizing composites for xenogeneic porcine islet transplantation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (2), 506-512 (2018).</li>
<li>Gauthaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+human+Wharton%27s+jelly+stem+cells+do+not+induce+tumorigenesis%2C+unlike+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic human Wharton's jelly stem cells do not induce tumorigenesis, unlike human embryonic stem cells.</a> Reproductive BioMedicine Online. 24 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Schiesser, J. V., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+beta+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of beta cells from human pluripotent stem cells: are we there yet.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1311, 124-137 (2014).</li>
<li>Chmielowiec, J., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+and+expansion+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+Diabetic+Studies%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation and expansion of human pluripotent stem cell-derived pancreatic progenitors.</a> The Review of Diabetic Studies. 11 (1), 19-34 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Osiągnięcie wyższej produkcji IPC z MSCs odgrywa zasadniczą rolę w terapii cukrzycy. Kluczowe etapy protokołu integracyjnego zależą od jakości komórek, które mają być użyte do transdukcji, oraz od jakości transdukowanych komórek. Niektóre wymagania dotyczące komórek, które należy sprawdzić w celu pomyślnej transdukcji, to zapewnienie zdrowia komórek, zarządzanie bankami komórek oraz komórki są w stanie mitotycznie aktywnym. Ponadto ważną rolę odgrywa również monitorowanie żywotności transdukowanych komórek. Mniej udana t...

Cukrzyca jest ciągłym globalnym problemem. Raport Międzynarodowej Federacji Diabetologicznej (IDF) oszacował, że globalne rozpowszechnienie cukrzycy wzrośnie ze 151 milionów w 2000 roku do 415 milionów w 2015 roku1,2. Najnowsze badanie epidemiologiczne przewiduje, że szacowana częstość występowania cukrzycy na świecie wzrośnie z 451 milionów w 2017 roku do 693 milionów w 2045 roku1. Sukces przeszczepu wysp trzustkowych przy użyciu protokołu Edmonton został po raz pierwszy zademonstrowany w 2000 roku, kiedy wykazano, że utrzymuje on endogenną produkcję insuliny i stabilizuje stan normoglikemiczny u pacjentów z cukrzycą typu I3. Jednak stosowanie protokołu z Edmonton nadal napotyka problem wąskiego gardła. Głównym problemem jest ograniczona liczba dawców trzustki ze zwłokami, ponieważ każdy pacjent z cukrzycą typu I wymaga co najmniej 2-4 dawców wysp trzustkowych. Ponadto długotrwałe stosowanie leków immunosupresyjnych może powodować zagrażające życiu skutki uboczne4,5. Aby temu zaradzić, rozwój potencjalnej terapii cukrzycy w ciągu ostatniej dekady skupił się głównie na generowaniu skutecznych komórek produkujących insulinę (IPC) z różnych źródeł komórek macierzystych6.
Komórki macierzyste stały się alternatywnym sposobem leczenia wielu chorób, w tym cukrzycy typu I, która jest spowodowana utratą komórek beta. Przeszczepienie IPC to nowa, obiecująca metoda kontrolowania stężenia glukozy we krwi u tych pacjentów7. W artykule przedstawiono dwa podejścia do generowania IPC, protokoły indukcji integracyjnej i nieintegracyjnej. Protokół indukcji naśladował naturalny proces rozwoju trzustki, aby uzyskać dojrzałe i funkcjonalne IPCs8,9.
Na potrzeby tego badania, hDPSC zostały scharakteryzowane za pomocą cytometrii przepływowej do wykrywania markerów powierzchniowych MSC, potencjału różnicowania wieloliniowego oraz RT-qPCR w celu określenia ekspresji właściwości macierzystej i markerów genów proliferacyjnych (dane nie pokazane)8,9,10. hDPSC były indukowane w kierunku definitywnej endodermy, endodermy trzustki, endokrynologicznej trzustki i komórek beta trzustki lub IPC ( <silna klasa="xfig">Rysunek 1), odpowiednio7. Aby indukować komórki, jako protokół szkieletowy zastosowano trzyetapowe podejście indukcyjne. Protokół ten został nazwany protokołem nieintegracyjnym. W przypadku protokołu integracyjnego niezbędny czynnik transkrypcyjny trzustki, PDX1, uległ nadekspresji w hDPSC, a następnie indukcji nadekspresji PDX1 w hDPSC przy użyciu trzyetapowego protokołu różnicowania. Różnica między protokołem nieintegracyjnym a integracyjnym polega na nadekspresji PDX1 w protokole integracyjnym, a nie w protokole nieintegracyjnym. W tym badaniu porównano różnicowanie trzustki między protokołami integracyjnymi i nieintegracyjnymi.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation, USA</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; 60 mm Naczynie hodowlane poddane działaniu TC</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>430166</tr><tr><td>Dulbecco" s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&handel;</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) w proszku, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td>Jedno opakowanie służy do przygotowania 1 l roztworu PBS ze sterylnym DDI</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>lentiwirusowy wektor przenoszący PDX1 Preparat</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; Filtr odśrodkowy Ultra-15 Merck</td><td>Millipore, USA</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki plazmid pWPT-PDX1</td><td>Addgene</td><td>12256</td><td>Prezent od Didiera Trono; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0.45&nbsp; &mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plazmid</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Prezent od Didiera Trono; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259</td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenem</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Prezent od Didiera Trono; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: Addgene_12260</td></tr><tr><td>Trzyetapowy protokół indukcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A Rekombinowane białko ludzkie</td><td>Merck Millipore</td><td>GF300</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA, frakcja Cohna V, bez kwasów tłuszczowych)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd glukagonopodobny (GLP)-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3265</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych bez obróbki, 60 mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701011</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

Od 2000 roku, sukces przeszczepu wysp trzustkowych przy użyciu protokołu Edmonton w leczeniu cukrzycy typu I nadal napotykał pewne przeszkody. Należą do nich ograniczona liczba dawców trzustki ze zwłok oraz długotrwałe stosowanie leków immunosupresyjnych. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały uznane za potencjalnego kandydata jako alternatywne źródło wytwarzania komórek podobnych do wysp trzustkowych. Nasze poprzednie raporty z powodzeniem zilustrowały ustanowienie protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSC) do komórek produkujących insulinę (IPC). Jednak wydajność indukcji była bardzo zróżnicowana. W tym artykule przedstawiono porównanie skuteczności indukcji trzustki hDPSC za pomocą integracyjnych (manipulacje mikrośrodowiskowe i genetyczne) i nieintegracyjnych (manipulacje mikrośrodowiskowe) protokołów indukcji w celu dostarczania IPC POCHODZĄCYCH Z HDPSC (HDPSC-IPC). Wyniki sugerują wyraźną skuteczność indukcji dla obu podejść do indukcji pod względem trójwymiarowej struktury kolonii, wydajności, markerów mRNA trzustki i właściwości funkcjonalnych po prowokacji wielodawkowym glukozą. Odkrycia te pomogą w przyszłości w stworzeniu klinicznie stosowanych IPC i platformy produkcji linii trzustkowych.

W niniejszym artykule porównano wyniki obu protokołów indukcji. Schematy obu protokołów indukcji przedstawiono na Rysunku 2A,C. W obu protokołach oceny dokonano pod mikroskopem świetlnym, a obrazy przeanalizowano za pomocą programu ImageJ. hDPSCs były w stanie tworzyć struktury przypominające kolonie od pierwszego dnia indukcji w obu protokołach. Morfologia kolonii była okrągła i gęsta, a wszystkie kolonie unosiły się w naczyniach hodowlanych przez cały okres indukcji (<stro...

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

Ten film pokazuje indukcję in vitro ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w kierunku linii trzustki. Komórki macierzyste stanowią alternatywne leczenie w wielu chorobach, w tym w cukrzycy typu I, która powoduje biolaging komórek beta. Przeszczepianie komórek produkujących insulinę będzie nową obiecującą metodą wywoływania choroby przez całe życie.W tym filmie opisano dwa podejścia do generowania komórki produkującej insulinę, w tym protokół indukcji integracyjnej i nieintegracyjnej. W tej części wyjaśniono protokół integracji do indukcji komórek produkujących insulinę z ludzkiej komórki macierzystej miazgi zębowej. Protokół indukcji służy bowiem do mieszania naturalnego procesu rozwoju trzustki.Aby uzyskać naturalne i funkcjonalne komórki produkujące insulinę. Do generowania komórek produkujących insulinę z mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak komórki macierzyste miazgi zębowej, stosuje się wieloetapowy protokół indukcji. Mezenchymalne komórki macierzyste są używane odpowiednio w słowie ostateczna endoderma, endoderma trzustki, endokrynna trzustkowa, a następnie komórki beta-komórkowe trzustki lub komórki produkujące insulinę.Aby indukować komórki, jako protokó

in-vitro-induction-human-dental-pulp-stem-cells-toward-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i propagacji ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej w celu oceny ekspresji białka prionowego podczas procesu różnicowania neuronów.

Izolacja, propagacja i ekspresja białek prionowych podczas różnicowania neuronalnego ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.

Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Poznaj metody indukcji komórek macierzystych miazgi zębowej w kierunku komórek trzustkowych in vitro. Protokoły integracyjny i nieintegracyjny pozwalają uzyskać funkcjonalne komórki produkujące insulinę.

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Przeglądaj więcej filmów