Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

W protokole tym zaproponowano prostą metodę pozyskiwania ludzkich krwiotwórczych komórek progenitorowych i indukowania ich różnicowania w megakariocyty. Może służyć jako podstawa do lepszego zrozumienia megakariopoezy Ta technika wykorzystuje źródło, ale ma tę zaletę, że jest niedroga i obfita w badania laboratoryjne w hematopoezie. Metoda ta służy do lepszego zrozumienia megakariopoezy, aby komórka, która ma być wykorzystana w terapii, będzie musiała zostać przygotowana w warunkach GMP, co obecnie nie ma miejsca.

Zrozumienie kroków, w tym zbierania PBMC, może być w pełni kompletne tylko dzięki wizualnej demonstracji. Przed rozpoczęciem eksperymentu podłącz filtr leukoredukcyjny do pustego worka transferowego o pojemności 600 mililitrów i do zestawu rurek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wstrzyknij 25 mililitrów przefiltrowanego buforu elucyjnego na filtr leukoredukcji do pustego worka i użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie zassać zawartość worka przez filtr.

Przenieś zebrane czerwone krwinki do nowej 50-mililitrowej probówki i rozcieńczyć zawiesinę komórek o połowę 2% dekstranem. Dobrze wymieszaj, aby zebrać komórki krwi i pozwól komórkom osadzać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Gdy czerwone krwinki osiądą, przenieś supernatant do 50-mililitrowej probówki i napełnij probówkę dwumilimolowym roztworem PBS EDTA.

Delikatnie nałożyć połowę supernatantu na 25 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w każdej z dwóch 50-mililitrowych probówek bez naruszania powierzchni gradientu i oddzielić komórki przez wirowanie w gradifikacji gęstości. Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść komórki z każdego interfejsu do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj komórki dwa razy w 50 mililitrach dwumilimolowego PBS EDTA na pranie.

Po drugim praniu ponownie zawieś granulki w pojedynczej 50-mililitrowej objętości świeżego PBS EDTA do policzenia. Tutaj możliwe jest zatrzymanie zabiegu poprzez utrzymywanie pobranych komórek w mieszaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza w nocy. W celu wyboru komórek CD34 + określ liczbę komórek i zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad komórkowy w 300 mikrolitrach dwóch milimolowych PBS EDTA na 10 do ósmych komórek.

Dodaj odpowiednią objętość odczynnika blokującego receptor FC i 50 mikrolitrów mikrokulek CD34 na 10 do ósmej komórki. Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki dwoma milimolowymi PBS EDTA i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego dwumilimolowego PBS EDTA, na 10 do ośmiu komórek. Nawilżyć i odpowiednio dobrać rozmiar kolumny magnetycznej za pomocą PBS EDTA, a następnie dodać próbkę do kolumny.

Przemyć kolumnę dwa razy trzema mililitrami dwumilimolowego PBS EDTA na pranie. Przed wydostaniem się do komórek CD34 +, z dwiema pięciomililitrowymi objętościami dwóch milimolowych PBS EDTA na elucję. Aby ocenić czystość wybranych komórek z kulkami magnetycznymi, dodaj dwa mikrolitry odpowiedniego ludzkiego przeciwciała anty CD34 do 100 mikrolitrowej porcji izolowanych komórek i dobrze wymieszaj przed inkubacją przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji umyć komórki w PBS i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS w celu analizy czystości próbki komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Po zliczeniu zbierz komórki CD34 + przez odwirowanie i natychmiast ponownie zawieś osad w zimnym roztworze od jednego do gęstości od 10 do sześciu komórek na mililitr przed szybkim dodaniem zawiesiny komórek do zimnego roztworu drugiego. Następnie natychmiast umieść probówkę kriogeniczną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 24 godziny przed przeniesieniem probówki kriogenicznej do przechowywania ciekłego azotu.

W tym reprezentatywnym badaniu komórki odzyskano przez filtrację leukoredukcyjną, co wykazano z około 95% żywotnością. Po selekcji kulek magnetycznych uzyskano ponad 90% czystą populację komórek CD34+. Proliferacja komórek zwykle zmniejsza się po tygodniu hodowli, ale bez znaczących zmian w żywotności komórek.

Do siódmego dnia komórki CD34 + powinny zacząć wyrażać CD41, specyficzny i wczesny marker lub odpowiedzialny za rozwój megakariocytów i płytek krwi. Do 10 dnia większość komórek w hodowli zwykle rozwija się w dojrzałe megakariocyty z ekspresją CD41. Do 13 dnia za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować wydłużanie i uwalnianie płytek krwi przez megakariocyty.

Całkowitą liczbę CD41, CD42, 8 dodatnich płytek krwi uwolnionych do hodowli można następnie określić ilościowo za pomocą skalibrowanej liczby kulek fluorescencyjnych. Metoda ta toruje drogę do wzmocnienia mechanizmów leżących u podstaw megakariopoezy i zwiększenia wydajności płytek krwi w ujęciu wzrokowym. Nawet jeśli ta metoda wydaje się żmudna, jest bardzo prosta, wystarczy uzbroić się w cierpliwość i wcześniej przygotować wszystkie regiony.

Chociaż nasze krytyczne obawy dotyczą megakariopoezy, otrzymujemy komórki CD42, które mogą być wykorzystywane w ponad szlakach krwiotwórczych.