Name: Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z filtrów leukodeplecyjnych i ich różnicowania w megakariocyty uwalniające płytki krwi. Protokół umożliwia badanie megakariopoezy in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.

Kontrolne próbki ludzkie pobrano od ochotniczych dawców krwi, którzy wyrazili pisemną świadomą zgodę i zostali zrekrutowani przez centrum transfuzjologii, w którym przeprowadzono badania (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Wszystkie procedury zostały zarejestrowane i zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (French Ministry of Higher Education and Research) pod numerem AC_2015_2371. Dawcy wyrazili zgodę w formularzu CODHECO nr AC- 2008 - 562 na wykorzystanie próbek do celów badawczych. Badania z udziałem ludzi przeprowadzono zgodnie z deklaracją helsińską.
1. Izolacja i selekcja komórek CD34+ (HP) z LRF
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników (dla jednego LRF)
	<ol>
		<li>Przygotować 25 mL przefiltrowanego buforu elucyjnego: 21,25 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), 2,5 mL kwasu cytrynianowo-dekstrozowego (ACD) oraz 1,25 mLydekomplementowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Przefiltrować przez filtr 0,22 µm i inkubować w 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 500 mL PBS z 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).</li>
		<li>Rozdzielić 25 mL medium do gradientu gęstości (DGM) (1,077 g/mL) do dwóch probówek o pojemności 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura płukania wstecznego LRF (Rysunek 1) 
	UWAGA: Ten krok wymaga sterylnej zgrzewarki do probówek, umożliwiającej sterylne połączenie rurek termoplastycznych.
	<ol>
		<li>Najpierw podłączyć LRF do pustego worka transferowego o pojemności 600 mL oraz LRF do zestawu rurek (Rysunek 1A). W komorze z laminarnym przepływem powietrza wstrzyknąć do pustego worka całkowitą objętość przefiltrowanego i przygotowanego buforu elucyjnego odpowiadającą liczbie przetwarzanych LRF (xLRF x 25 mL). Następnie, używając strzykawki 30 mL, delikatnie aspirując całą zawartość worka przez LRF, przeprowadzić płukanie wsteczne i przenieść komórki do nowej probówki 50 mL (Rysunek 1B).</li>
		<li>W celu sedymentacji erytrocytów, rozcieńczyć zawiesinę komórkową dwukrotnie Dekstranem 2% i dokładnie wymieszać, aby doprowadzić do agregacji erytrocytów. Odstawić na 30 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat leukodeplecji z użyciem LRF, połączenia drenów dla zestawu do pobierania i przenoszenia komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62499/62499fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Metody płukania wstecznego LRF. (A) Reprezentatywny schemat (i) sterylnego połączenia worka transferowego z LRF oraz (ii) zestawu drenów z LRF. (B) Reprezentatywny schemat połączenia strzykawek do pobierania komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62499/62499fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Izolacja PBMC
	<ol>
		<li>Po sedymentacji erytrocytów usunąć i przenieść nadsącz do probówki 50 mL i uzupełnić go PBS-EDTA 2 mM. Delikatnie nanieść nadsącz na wcześniej przygotowany DGM. Pozostawić nadsącz, aby łagodnie spływał, nie naruszając powierzchni gradientu gęstości. Wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min z wyłączonym hamulcem.</li>
		<li>Warstwę PBMC zebrać za pomocą jednorazowej pipety transferowej. Przenieść komórki z każdej probówki z DGM do nowej sterylnej probówki 50 mL. Napełnić każdą probówkę PBS-EDTA 2 mM i przemyć dwukrotnie w 50 mL PBS-EDTA 2 mM przy 200 x g przez 10 min w RT z włączonym hamulcem.</li>
		<li>Odpipetować i połączyć osad komórkowy z 50 mL PBS-EDTA 2 mM. 
		UWAGA: Istnieje możliwość przerwania procedury poprzez utrzymywanie zebranych komórek w mieszaniu w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie zawiesinę przefiltrować przez sitko komórkowe 40 µm w celu usunięcia powstałych agregatów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja komórek CD34+
	<ol>
		<li>Określić liczbę komórek i wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min z włączonym hamulcem.</li>
		<li>Całkowicie odessać nadsącz i resuspendować w odpowiedniej objętości PBS-EDTA 2 mM określonej przez producenta zestawu do selekcji CD34 (300 µL PBS-EDTA na 108 komórek). Dodać odczyn blokujący FcR oraz mikrokulki CD34 w odpowiednim stężeniu (50 µL na 108 komórek).</li>
		<li>Po 30 min w 4 °C przemyć zawiesinę komórkową i resuspendować w odpowiedniej objętości PBS-EDTA 2 mM określonej przez producenta zestawu do selekcji CD34 (500 µL na 108 komórek). 
		​UWAGA: Selekcję przeprowadza się na kolumnach sortujących dla przejścia maksymalnie 2 x 109 komórek na kolumnę.</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez mokrą kolumnę w magnesie. Przemyć dwukrotnie 3 mL PBS-EDTA 2 mM i eluować komórki 5 mL PBS-EDTA 2 mM. W celu zwiększenia czystości próbki konieczne jest drugie przejście na nowej kolumnie zgodnie z tą samą procedurą. 
		UWAGA: Oczekiwana liczba to 6,1 x 105 komórek/LRF (Ryc. 2A). Dla wyższych wartości LRF należy odpowiednio zwiększyć ilość odczynników i dostosować metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena czystości komórek CD34+
	<ol>
		<li>Do alikwoty 100 µL zawiesiny uzyskanej po selekcji CD34+ dodać 2 µL przeciwciała CD34-PE dla ludzi lub 2 µL IgG - PE (kontrola). Dobrze wymieszać i inkubować przez 15 min w 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 2 mL PBS, i wirować przy 400 x g przez 5 min. Całkowicie odessać nadsącz i resuspendować w 200 µL PBS.</li>
		<li>Czystość przeanalizować metodą cytometrii przepływowej, jak pokazano na Ryc. 2A oraz w sekcji Dyskusja. 
		​UWAGA: Oczekiwana czystość komórek CD34+ wynosi powyżej 90% (Ryc. 2Bii).</li>
		<li>Użyć komórek CD34+ bezpośrednio lub zamrozić do późniejszego wykorzystania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie komórek CD34+ 
	UWAGA: Zamrażanie komórek CD34+ odbywa się przy gęstości 106 komórek na mL.
	<ol>
		<li>Po określeniu liczby komórek CD34+ przygotować następujące media do kriokonserwacji: (1) 60% Stemspan + 40% FBS, (2) 40% Stemspan + 40% FBS + 20% dimetylosulfoksyd (DMSO) i schłodzić do 4 °C.</li>
		<li>Wirować komórki CD34+ przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min i resuspendować osad w zimnym roztworze 1, a następnie natychmiast dodać do zimnego roztworu 2 (v/v).</li>
		<li>Krioprobówki umieścić natychmiast w zamrażarce -80 °C na 24 h, a następnie przenieść do zbiornika z ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla i różnicowanie komórek CD34+ w celu uzyskania dojrzałych megakariocytów wytwarzających propłytki
UWAGA: Protokół hodowli komórkowej (Rysunek 3A), reprezentatywny schemat procedury hodowli komórkowej są szczegółowo opisane w tej sekcji.
<ol>
	<li>Rozmrażanie komórek CD34+ (jeśli wymagane)
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do rozmrażania: 13 mL PBS z 20% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min. Szybko przenieść krioprobówki do kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko jeden mały kryształek lodu. W komorze do hodowli biologicznych odpipetować całą zawartość i powoli przenieść do 13 mL uprzednio ogrzanego roztworu do rozmrażania.</li>
		<li>Określić liczbę komórek oraz ich żywotność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół hodowli, etap 1: od dnia 0 do dnia 7 
	UWAGA: Zazwyczaj hodowle prowadzi się w płytkach 24-dołkowych z 1 mL medium na dołek, przy gęstości 40 000 żywych komórek/mL, co odpowiada 20 000 żywych komórek/cm2. Przestrzeganie tej gęstości jest kluczowe w przypadku planowanego zwiększenia skali hodowli.
	<ol>
		<li>Przygotowanie medium wzrostowego: do bezserwatkowego medium do ekspansji komórek hematopoetycznych (uprzednio ogrzanego do 37 °C) dodać Penicylinę-Streptomycynę-Glutaminę (PSG) 1x, ludzką lipoproteinę o niskiej gęstości (hLDL) w stężeniu 20 µg/mL, koktajl cytokin do ekspansji megakariocytów 1x oraz Stemregenin 1 (SR1) w stężeniu 1 µM.</li>
		<li>Wysiew komórek: rozmrożone komórki CD34+ wirować przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dokładnie usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 1 mL medium hodowlanego, a następnie przeprowadzić liczenie komórek i ocenę żywotności, aby określić odpowiednią objętość do wysiewu komórek.</li>
		<li>Wirować komórki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min i resuspender osad w odpowiedniej objętości ciepłego medium wzrostowego. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół hodowli, etap 2: od dnia 7 do dnia 13 (Rycina 3B, reprezentatywne obrazy w dniu 13) 
	UWAGA: Zazwyczaj hodowle prowadzi się w płytkach 24-dołkowych z 1 mL medium na dołek, przy gęstości 50 000 żywych komórek/mL, co odpowiada 25 000 żywych komórek/cm². Przestrzeganie tej gęstości jest kluczowe w przypadku planowanego zwiększenia skali hodowli.
	<ol>
		<li>Przygotowanie medium do dojrzewania: do bezserwatkowego medium do ekspansji komórek hematopoetycznych (uprzednio ogrzanego do 37 °C) dodać PSG 1x, hLDL w stężeniu 20 µg/mL, TPO w stężeniu 50 ng/mL oraz SR1 w stężeniu 1 µM.</li>
		<li>Zbadać komórki pod mikroskopem. W dniu 7 komórki wykazują okrągły i jednorodny wygląd, wypełniając dołki lub kolby bez osiągania zbyt wysokiej konfluencji.</li>
		<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza ostrożnie przenieść komórki do probówki 15 mL. Przemyć dołki PBS. Następnie określić liczbę komórek oraz ich żywotność, aby obliczyć odpowiednią objętość do wysiewu komórek.</li>
		<li>Wirować komórki przy 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspender komórki w odpowiedniej objętości ciepłego medium obliczonej w poprzednim kroku. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 6 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwalnianie wyhodowanych płytek krwi w dniu 13
	<ol>
		<li>Do hodowli dodać 0,5 µM prostaglandyny I2 (PGI2) oraz 0,02 U/mL apirazy i wykonać pięciokrotne pipetowanie przy użyciu pipety 1 mL. 
		​UWAGA: Płytki krwi zostają teraz uwolnione do medium.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza cytometryczna (fenotypowanie MK i zliczanie hodowlanych płytek krwi)
UWAGA: Niniejszy protokół można zastosować do fenotypowania komórek w wybranych dniach hodowli. Pozwala on również na określenie liczby uwolnionych płytek krwi z hodowli (Rysunek 4A,B).
<ol>
	<li>Przygotowanie do analizy MK
	<ol>
		<li>Oznakuj cztery zestawy probótek do mikrocentryfugi w następujący sposób: komórki nieoznakowane jako kontrola, komórki + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488, komórki + 5 µL CD34 - PECy7, komórki + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 µL CD34 - PECy7. Użyj minimum 1.105 komórek na probówkę, nie przekraczając 1.106 komórek na probówkę. Do każdej probówki do cytometrii dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej oraz odpowiednie przeciwciała. Inkubuj w ciemności przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Następnie dodaj 2 mL PBS-EDTA 2 mM do każdej probówki i wiruj przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Podczas wirowania przygotuj roztwór PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycin-D (7AAD) (1/100), przewidując 300 µL roztworu na probówkę.</li>
		<li>Usuń nadsącz i zawiesić osad w 300 µL PBS-EDTA 2 mM z 7AAD. Przeanalizuj próbki w cytometrze przepływowym w ciągu 30 min. 
		UWAGA: Strategia analizy dla cytometrii przepływowej przedstawiona jest na Rysunku 3C oraz w sekcji Dyskusja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie probótek do analizy hodowanych płytek krwi
	<ol>
		<li>Oznakuj cztery zestawy probótek do mikrocentryfugi w następujący sposób: komórki nieoznakowane jako kontrola, komórki + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488, komórki + 20 µL CD42a - PE, komórki + 5 µL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 µL CD42a - PE. Po pięciokrotnym pipetowaniu w studience hodowlanej przenieś 300 µL zawiesiny do probówki do cytometrii zawierającej skalibrowaną liczbę kuleczek fluorescencyjnych.</li>
		<li>Dodaj przeciwciała i inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
		<li>Przeanalizuj próbki w cytometrze przepływowym w ciągu 30 min i ustaw akwizycję na przejście 5 000 kuleczek. 
		UWAGA: Strategia analizy dla cytometrii przepływowej przedstawiona jest na Rysunku 4B oraz w sekcji Dyskusja.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Deutsch, V. R., Tomer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+development+and+platelet+production%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte development and platelet production.</a> British Journal of Haematology. 134 (5), 453-466 (2006).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>de Sauvage, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+megakaryocytopoiesis+and+thrombopoiesis+by+the+c-Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stimulation of megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis by the c-Mpl ligand.</a> Nature. 369 (6481), 533-538 (1994).</li>
<li>Almomani, M. H., Mangla, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlmomani%2C+MH+%22StatPearls%22">StatPearls</a>. , (2020).</li>
<li>Strassel, C., Hechler, B., Bull, A., Gachet, C., Lanza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+mice+lacking+the+GPIb-V-IX+complex+question+the+role+of+this+receptor+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Studies of mice lacking the GPIb-V-IX complex question the role of this receptor in atherosclerosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (11), 1935-1938 (2009).</li>
<li>Delalat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+stem+cells+and+their+cotransplantation+with+or+without+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of human umbilical cord blood-derived CD34+ stem cells and their cotransplantation with or without mesenchymal stem cells.</a> Hematology. 14 (3), 125-132 (2009).</li>
<li>Yin, T., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niches+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The stem cell niches in bone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1195-1201 (2006).</li>
<li>Salunkhe, V., Papadopoulos, P., Gutiérrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+megakaryocytes+from+human+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Culture of megakaryocytes from human peripheral blood mononuclear cells.</a> Bio-protocol. 5 (21), 1639(2015).</li>
<li>Peytour, Y., Villacreces, A., Chevaleyre, J., Ivanovic, Z., Praloran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+leukoreduction+filters%3A+a+new+source+of+stem+cells+for+research%2C+cell+engineering+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Discarded leukoreduction filters: a new source of stem cells for research, cell engineering and therapy.</a> Stem Cell Research. 11 (2), 736-742 (2013).</li>
<li>Lapostolle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulating+hematopoietic+stem+cells+from+steady-state+blood+before+and+after+ex+vivo+culture+are+enriched+in+the+CD34%28%2B%29CD133%28%2B%29CXCR4%28low%29+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Repopulating hematopoietic stem cells from steady-state blood before and after ex vivo culture are enriched in the CD34(+)CD133(+)CXCR4(low) fraction.</a> Haematologica. 103 (10), 1604-1615 (2018).</li>
<li>Ivanovic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-blood+leuko-depletion+filters+as+a+source+of+CD+34%2B+progenitors+potentially+usable+in+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Whole-blood leuko-depletion filters as a source of CD 34+ progenitors potentially usable in cell therapy.</a> Transfusion. 46 (1), 118-125 (2006).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor-dependent+enrichment+of+a+megakaryocytic+precursor+with+a+high+potential+to+produce+proplatelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets.</a> Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).</li>
<li>Do Sacramento, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+platelets+derived+in+vitro+from+CD34%28%2B%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human platelets derived in vitro from CD34(+) cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 914(2020).</li>
<li>Blin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+the+platelet-generating+organ%3A+beyond+bone+marrow+biomimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of the platelet-generating organ: beyond bone marrow biomimetics.</a> Scientific Reports. 6, 21700(2016).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turbulence+activates+platelet+biogenesis+to+enable+clinical+scale+ex+vivo+production%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production.</a> Cell. 174 (3), 636-648 (2018).</li>
<li>Pallotta, I., Lovett, M., Kaplan, D. L., Balduini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+system+for+the+in+vitro+study+of+megakaryocytes+and+functional+platelet+production+using+silk-based+vascular+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional system for the in vitro study of megakaryocytes and functional platelet production using silk-based vascular tubes.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (12), 1223-1232 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę wytwarzania MK zdolnego do wydzielania propłytek krwi z HP pochodzącego z krwi i uwalniania płytek krwi z pożywki. HP są otrzymywane z LRF, produktu ubocznego banków krwi, używanego do usuwania zanieczyszczających leukocytów z komórkowych produktów krwiopochodnych i unikania działań niepożądanych. Chociaż ta metoda jest stosunkowo prosta, na szczególną uwagę zasługuje kilka punktów.
Osadzanie zawiesiny komórek na pożywce o gradiencie gęstości (etap 1.3.1) musi być p...

Płytki krwi pochodzą z wyspecjalizowanych dużych komórek poliploidalnych, megakariocytów (MK), które pochodzą ze stałego i precyzyjnie dostrojonego procesu produkcyjnego znanego jako megakariopoeza (MKP). Na szczycie tego procesu znajdują się hematopoetyczne komórki macierzyste, które w kontakcie ze środowiskiem szpiku kostnego (cytokiny, czynniki transkrypcyjne, nisza krwiotwórcze) będą zdolne do namnażania się i różnicowania w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HP) zdolne do zaangażowania się w szlak megakariocytarny, dając początek niedojrzałym MKs1. Pod wpływem różnych cytokin, a w szczególności trombopoetyny (TPO), która jest główną cytokiną MKP; MK przejdzie następnie dwa główne etapy dojrzewania: endomitozę i rozwój błon demarkacyjnych (DMS). Ten w pełni dojrzały MK pojawia się następnie w pobliżu naczynia sinusoidalnego, w którym może emitować cytoplazmatyczne rozszerzenia, propłytki, które zostaną uwolnione pod przepływem krwi, a następnie przekształcone w funkcjonalne płytki krwi2. Klonowanie TPO w 1994 roku3 przyczyniło się do rozwoju badań nad MKP poprzez przyspieszenie rozwoju technik hodowli in vitro, które umożliwiły różnicowanie HP i dojrzewanie MK.
Istnieje wiele patologii wpływających na płytki krwi, zarówno pod względem liczby płytek krwi (wzrost lub spadek), jak i funkcji4,5. Możliwość rekapitulacji MKP in vitro z ludzkiego HP może przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw tego procesu, a ostatecznie do leczenia pacjentów.
Różne źródła ludzkiego HP są odpowiednie: krew pępowinowa, szpik kostny i krew obwodowa6,7,8. Pobieranie HP z krwi obwodowej stwarza mniej problemów logistycznych i etycznych niż ich odzyskiwanie z krwi pępowinowej lub szpiku kostnego. HP można odzyskać z leukaferezy lub kożuchy koralowej, ale te źródła są drogie i nie zawsze dostępne w centrach krwiodawstwa. Inne protokoły, tańsze i łatwiejsze do wykonania, umożliwiają bezpośrednie odzyskiwanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) bez konieczności uprzedniej izolacji sterowanej CD344,8. Jednak czystość megakariocytów nie jest zadowalająca w przypadku tej metody i zaleca się wybór komórek CD34 + z PBMC w celu optymalnego różnicowania do MK. To skłoniło nas do wdrożenia oczyszczania HP z filtrów leukoredukcyjnych (LRF), rutynowo stosowanych w bankach krwi w celu usunięcia białych krwinek, a tym samym uniknięcia niepożądanych reakcji immunologicznych9. Rzeczywiście, od 1998 roku koncentraty płytek krwi są we Francji automatycznie leukodonezowane. Pod koniec tego procesu LRF są odrzucane, a wszystkie komórki zatrzymane w LRF są niszczone. Ogniwa w LRF są zatem łatwo dostępne bez dodatkowych kosztów. LRF mają zawartość komórkową zbliżoną do tej uzyskanej przez leukaferezę lub w kożuchach, zwłaszcza w składzie CD34+ HP, co czyni je niezwykle atrakcyjnym źródłem10. Wykazano już, że LRF jako ludzkie źródło HP zapewnia komórkom nienaruszone zdolności funkcjonalne11. To źródło ma tę zaletę, że jest obfite i niedrogie do badań laboratoryjnych. W tym kontekście w artykule opisano kolejno: i) ekstrakcję i selekcję CD34+ HP z LRF; ii) dwufazowa zoptymalizowana hodowla, która podsumowuje zaangażowanie HP w szlak megakariocytarny i dojrzewanie MK zdolnego do wydzielania propłytków; iii) metodę skutecznego uwalniania płytek krwi z tych MK; oraz iv) procedurę fenotypowania MK i hodowanych płytek krwi.

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>558819</td><td></td></tr><tr><td>ACD</td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD34-PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-081-002</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD34-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD41-Alexa Fluor 488</td><td>Biolegend</td><td>303724</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD42a-PE</td><td></td><td>559919Apyrase</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EFS-Alsace</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Tubes</td><td>BD Bioscience</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit UltraPure, człowiek&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-100-453</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.OR</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Compteur ADAM&nbsp;</td><td>DiagitalBio</td><td>NA</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Dutscher</td><td>55002</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Dekstran z leuconostoc spp&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31392-50g</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>DMSO Hybri-max&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15575-039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>616201</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Jednostka filtracyjna Steriflip PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscience</td><td>Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Human LDL</td><td>Stemcell technologies</td><td>#02698</td><td></td></tr><tr><td>ILOMEDYNA 0,1 mg/1 ml</td><td>Bayer</td><td>MA038EX</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady</td><td>Fenwal</td><td>R4R1401</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym&nbsp;</td><td>Holten</td><td>NA</td><td>Produkt archiwalny</td></tr><tr><td>LS Columms&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell</td><td>7861</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp;</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>PGi2</td><td>Sigma</td><td>P6188</td><td></td></tr><tr><td>Poches de transferts 600ml&nbsp;</td><td>Filtry wstępnej separacji Macopharma</td><td>VSE4001XA</td><td></td></tr><tr><td>(30&micro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemRegenin 1 (SR1)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#72344</td><td></td></tr><tr><td>Suplement rozszerzający StemSpan (100x)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#02696</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan-SFEM&nbsp;</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#09650</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Durapore 0,22&micro; m PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>SVF Hyclon&nbsp;</td><td>Termos naukowy</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 30 mL&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>SS*30ESE1</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe Millex 0,22&micro; M PVDF</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#02822</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.548.004 PP</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Probówki 15 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.001 PP</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr><tr><td>Kanaliki</td><td>B Braun</td><td>4055137</td><td>Lub równoważny materiał</td></tr></tbody></table>

komórki cd34 + pochodzące z filtrów leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Leukodepletion Filters-Derived CD34+ Cells As a Cell Source to Study Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation

Ekspansja in vitro i różnicowanie ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych w megakariocyty zdolne do wydłużania proplatetek i uwalniania płytek krwi pozwala na dogłębne badanie mechanizmów leżących u podstaw biogenezy płytek krwi. Dostępne protokoły hodowli opierają się głównie na krwiotwórczych wskaźnikach progenitorowych pochodzących ze szpiku kostnego lub krwi pępowinowej, co budzi szereg obaw etycznych, technicznych i ekonomicznych. Jeśli istnieją już dostępne protokoły pozyskiwania komórek CD34 z krwi obwodowej, ten manuskrypt proponuje prosty i zoptymalizowany protokół pozyskiwania komórek CD34 + z filtrów leukodeplecyjnych łatwo dostępnych w centrach krwiodawstwa. Komórki te są izolowane z filtrów leukodeplecyjnych stosowanych do przygotowywania produktów do transfuzji krwi, co odpowiada ośmiu pobranym krwiom. Te filtry są przeznaczone do wyrzucenia. Opisano szczegółową procedurę pobierania hematopoetycznych komórek progenitorowych zidentyfikowanych jako komórki CD34+ z tych filtrów. Szczegółowo opisano również metodę uzyskiwania dojrzałych megakariocytów wydłużających propłytki krwi przy jednoczesnym omówieniu ich ewolucji fenotypowej. Wreszcie, w protokole przedstawiono skalibrowaną metodę pipetowania, aby skutecznie uwalniać płytki krwi, które są morfologicznie i funkcjonalnie podobne do natywnych. Protokół ten może służyć jako podstawa do oceny związków farmakologicznych działających na różnych etapach procesu w celu przeanalizowania mechanizmów leżących u podstaw i zbliżenia się do wydajności płytek krwi in vivo.

Izolacja i selekcja komórek CD34+ z LRF 
Niniejsza metoda, opracowana na podstawie pracy Peytour i wsp.9, opisuje izolację i selekcję komórek CD34+ z odrzuconych LRF dostępnych w bankach krwi po leukoredukcji. Po procedurze przepłukiwania wstecznego zwykle odzyskuje się 1,03 x 109 ± 2,45 x 108 komórek/LRF (średnia±SEM; n = 155) przy żywotności 94,88 ± 0,10% (Rysunek 2A i). Po pozytywnej selekcji CD3...

Ten protokół szczegółowo opisuje wszystkie etapy związane z uzyskaniem hematopoetycznych progenitorów CD34+ pochodzących z leukofiltrów oraz ich różnicowaniem in vitro i dojrzewaniem do megakariocytów zawierających propłytki, które są w stanie uwalniać płytki krwi w pożywce hodowlanej. Ta procedura jest przydatna do dogłębnej analizy mechanizmów komórkowych i molekularnych kontrolujących megakariopoezę.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

The in vitro expansion and differentiation of human hematopoietic progenitors into megakaryocytes capable of elongating proplatelets and releasing ...

W protokole tym zaproponowano prostą metodę pozyskiwania ludzkich krwiotwórczych komórek progenitorowych i indukowania ich różnicowania w megakariocyty. Może służyć jako podstawa do lepszego zrozumienia megakariopoezy Ta technika wykorzystuje źródło, ale ma tę zaletę, że jest niedroga i obfita w badania laboratoryjne w hematopoezie. Metoda ta służy do lepszego zrozumienia megakariopoezy, aby komórka, która ma być wykorzystana w terapii, będzie musiała zostać przygotowana w warunkach GMP, co obecnie nie ma miejsca.Zrozumienie kroków, w tym zbierania PBMC, może być w pełni kompletne tylko dzięki wizualnej demonstracji. Przed rozpoczęciem eksperymentu podłącz filtr leukoredukcyjny do pustego worka transferowego o pojemności 600 mililitrów i do zestawu rurek. W komorze bezpieczeństwa biologicznego wstrzyknij 25 mililitrów przefiltrowanego buforu elucyjnego na filtr leukoredukcji do pustego worka i użyj 30-mililitrowej strzykawki, aby delikatnie zassać zawartość worka przez filtr.Przenieś zebrane czerwone krwinki do nowej 50-mililitrowej probówki i rozcieńczyć zawiesinę komórek o połowę 2% dekstranem. Dobrze wymieszaj, aby zebrać komórki krwi i pozwól komórkom osadzać się przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Gdy czerwone krwinki osiądą, przenieś supernatant do 50-mililitrowej probówki i napełnij probówkę dwumilimolowym roztworem PBS EDTA.Delikatnie nałożyć połowę supernatantu na 25 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w każdej z dwóch 50-mililitrowych probówek bez naruszania powierzchni gradientu i oddzielić komórki przez wirowanie w gradifikacji gęstości. Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść komórki z każdego interfejsu do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj komórki dwa razy w 50 mililitrach dwumilimolowego PBS EDTA na pranie.Po drugim praniu ponownie zawieś granulki w pojedynczej 50-mililitrowej objętości świeżego PBS EDTA do policzenia. Tutaj możliwe jest zatrzymanie zabiegu poprzez utrzymywanie pobranych komórek w mieszaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza w nocy. W celu wyboru komórek CD34 + określ liczbę komórek i zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad komórkowy w 300 mikrolitrach dwóch milimolowych PBS EDTA na 10 do ósmych komórek.Dodaj odpowiednią objętość odczynnika blokującego receptor FC i 50 mikrolitrów mikrokulek CD34 na 10 do ósmej komórki. Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyj komórki dwoma milimolowymi PBS EDTA i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach świeżego dwumilimolowego PBS EDTA, na 10 do ośmiu komórek. Nawilżyć i odpowiednio dobrać rozmiar kolumny magnetycznej za pomocą PBS EDTA, a następnie dodać próbkę do kolumny.Przemyć kolumnę dwa razy trzema mililitrami dwumilimolowego PBS EDTA na pranie. Przed wydostaniem się do komórek CD34 +, z dwiema pięciomililitrowymi objętościami dwóch milimolowych PBS EDTA na elucję. Aby ocenić czystość wybranych komórek z kulkami magnetycznymi, dodaj dwa mikrolitry odpowiedniego ludzkiego przeciwciała anty CD34 do 100 mikrolitrowej porcji izolowanych komórek i dobrze wymieszaj przed inkubacją przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po inkubacji umyć komórki w PBS i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach PBS w celu analizy czystości próbki komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Po zliczeniu zbierz komórki CD34 + przez odwirowanie i natychmiast ponownie zawieś osad w zimnym roztworze od jednego do gęstości od 10 do sześciu komórek na mililitr przed szybkim dodaniem zawiesiny komórek do zimnego roztworu drugiego. Następnie natychmiast umieść probówkę kriogeniczną w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 24 godziny przed przeniesieniem probówki kriogenicznej do przechowywania ciekłego azotu.W tym reprezentatywnym badaniu komórki odzyskano przez filtrację leukoredukcyjną, co wykazano z około 95% żywotnością. Po selekcji kulek magnetycznych uzyskano ponad 90% czystą populację komórek CD34+. Proliferacja komórek zwykle zmniejsza się po tygodniu hodowli, ale bez znaczących zmian w żywotności komórek.Do siódmego dnia komórki CD34 + powinny zacząć wyrażać CD41, specyficzny i wczesny marker lub odpowiedzialny za rozwój megakariocytów i płytek krwi. Do 10 dnia większość komórek w hodowli zwykle rozwija się w dojrzałe megakariocyty z ekspresją CD41. Do 13 dnia za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować wydłużanie i uwalnianie płytek krwi przez megakariocyty.Całkowitą liczbę CD41, CD42, 8 dodatnich płytek krwi uwolnionych do hodowli można następnie określić ilościowo za pomocą skalibrowanej liczby kulek fluorescencyjnych. Metoda ta toruje drogę do wzmocnienia mechanizmów leżących u podstaw megakariopoezy i zwiększenia wydajności płytek krwi w ujęciu wzrokowym. Nawet jeśli ta metoda wydaje się żmudna, jest bardzo prosta, wystarczy uzbroić się w cierpliwość i wcześniej przygotować wszystkie regiony.Chociaż nasze krytyczne obawy dotyczą megakariopoezy, otrzymujemy komórki CD42, które mogą być wykorzystywane w ponad szlakach krwiotwórczych.

leukodepletion-filters-derived-cd34-cells-as-cell-source-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisujemy tutaj izolację wykazujących ekspresję CD133 komórek macierzystych wątroby oraz nowotworowych komórek macierzystych z całej wątroby mysiej, co jest procesem wymagającym trawienia tkanki, wzbogacania frakcji komórkowej oraz izolacji metodą cytometrii przepływowej. Przedstawiamy metody zaawansowanej izolacji pojedynczych komórek oraz ekspansji klonalnej.

Izolacja komórek macierzystych wątroby CD133+ do ekspansji klonalnej

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Poznaj metodę izolacji komórek CD34+ z filtrów leukodeplecyjnych i ich różnicowania w megakariocyty uwalniające płytki krwi. Protokół umożliwia badanie megakariopoezy in vitro.

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi (Wideo) | JoVE Journal

Komórki CD34 + pochodzące z filtrów Leukodepletion jako źródło komórek do badania różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Przeglądaj więcej filmów