Name: Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę eksplantatu szpiku kostnego myszy do obserwacji tworzenia propłytek megakariocytów w czasie rzeczywistym. Protokół umożliwia analizę jakościową i ilościową w ciągu sześciu godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 i ANR-18-CE14-0037.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z europejskimi standardami 2010/63/UE oraz Komitetem CREMEAS ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Strasburgu (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 1.
	<ol>
		<li>W przypadku Stock I należy rozpuścić każdy proszek osobno. Upewnij się, że osmolarność preparatu jest wyższa niż 295 mOsm/L. Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden rok.</li>
		<li>Do przygotowania buforu Tyrode'a przygotować roztwór zgodnie z opisem w tabeli 1, dostosować objętość do 100 ml wodą destylowaną i dodać 0,1 g bezwodnej sacharozy D (+). Dostosuj do pH 7,3 za pomocą 1 N HCl w razie potrzeby i osmolarności do 295 mOsm/L. Aby zapobiec rozwojowi bakterii, dodaj penicylinę G w końcowym stężeniu 10 U/ml i siarczan streptomycyny w końcowym stężeniu 0,29 mg/ml. Przefiltruj końcowy roztwór przez pory 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zestawu eksperymentalnego
<ol>
	<li>W dniu eksperymentu należy ogrzać bufor Tyrode'a do temperatury 37 °C i włączyć komorę grzewczą mikroskopu, aby doprowadzić temperaturę do 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj wszystkie niezbędne narzędzia, takie jak minutnik, komory inkubacyjne, strzykawki 5 ml, 21 G, kleszcze, żyletka, pipety Pasteura, szkiełka podstawowe i probówka wirówkowa o pojemności 15 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
</ol>
3. Izolacja szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Eutanazja myszy C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy. Powinno to być zrobione szybko przez kompetentną i wykwalifikowaną osobę.</li>
	<li>Aby uniknąć zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przed usunięciem kości udowych namocz ciało myszy w 70% (v/v) etanolu. Do preparacji należy użyć narzędzi zdezynfekowanych w 70% etanolu. Zbierz dwie kości udowe i oczyść je, usuwając wszelkie przylegające tkanki. Po szybkim zanurzeniu w etanolu umieścić je w 15 ml probówce wirówkowej zawierającej 2 ml buforu Tyrode.</li>
	<li>Odetnij nasady za pomocą ostrej żyletki i przepłucz szpik kostny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej 2 ml buforem Tyrdode. Aby to osiągnąć, wprowadź igłę 21 G do otworu kości udowej (po stronie kolana) i powoli naciskaj tłok, aby pobrać nienaruszony cylinder szpiku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B, C). Sesja pobierania szpiku powinna być jak najkrótsza (poniżej 10 minut).</li>
</ol>
4. Cięcie szpiku kostnego i umieszczanie go w komorze inkubacyjnej
<ol>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety o pojemności 3 ml ostrożnie i delikatnie przenieś nienaruszony szpik kostny na szklane szkiełko. Ważne jest, aby próbki były pokryte buforem, aby zapobiec wysychaniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). 
	UWAGA: Unikaj przepływu rozpływowego, aby zminimalizować ścinania, które mogłyby dysocjować tkankę.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym (10x) odetnij końce szpiku, które mogły zostać ściśnięte w czasie płukania. Następnie wytnij przekroje poprzeczne ostrą żyletką. Skrawki powinny być wystarczająco cienkie, aby umożliwić szczegółową obserwację, ale upewnij się, że megakariocyty nie zostaną uszkodzone przez kompresję (zwykle grubość około 0,5 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E,F). 
	UWAGA: Sekcje wykonuje się ostrą żyletką i pod lupą, aby dostosować ich grubość do około 0,5 mm. Wybierane są tylko przekroje o jednolitej grubości. Procedura ta nie jest skomplikowana, ale jej standaryzacja wymaga pewnego doświadczenia.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety zbierz 10 skrawków do probówki o pojemności 1 ml zawierającej bufor Tyrode'a (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Ostrożnie przenieś sekcje do komory inkubacyjnej o średnicy 13 mm (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1H).</li>
	<li>Odessać bufor i dostosować objętość do 30 μl buforu Tyrode'a uzupełnionego 5 % surowicą mysią. 
	UWAGA: Na tym etapie można dodać środki farmakologiczne, aby ocenić ich wpływ na tworzenie propłytek.</li>
	<li>Ustaw sekcje w pewnej odległości. Uszczelnić komorę samoprzylepną szkiełkiem nakrywkowym o wymiarze 22 x 55 mm. Nachyl szkiełko nakrywkowe podczas przyklejania, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Umieścić komorę w komorze grzewczej w temperaturze 37 °C. Od tego momentu uruchamiany jest chronometr (T= 0 h). Eksperyment trwa 6 godzin w temperaturze 37 °C (T= 6 h).</li>
</ol>
5. Obserwacja eksplantatów szpiku w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym (obiektyw 40x do powiększenia) sprzężonego z kamerą wideo, aby obserwować eksplantaty szpiku kostnego. Pozwól komórkom inkubować przez 30 minut przed rozpoczęciem obserwacji. Podczas obserwacji konieczne jest dostosowanie ostrości, ponieważ megakariocyty się poruszają. 
	UWAGA: Możliwe są inne tryby obserwacji (np. DIC, fluorescencja przy użyciu myszy, których megakariocyty wyrażają endogenny marker fluorescencyjny), ale mikroskopia z kontrastem fazowym jest optymalna, aby wyraźnie uwidocznić długie i cienkie rozszerzenia megakariocytów, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację. Po 30 minutach komórki szpiku stopniowo migrują na obrzeża eksplantatu, tworząc monowarstwę. Po 1 godzinie inkubacji megakariocyty można zidentyfikować po ich dużych rozmiarach i polizbulizowanych jądrach (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1J,K). Po 3 godzinach inkubacji liczba megakariocytów wzrasta, a niektóre mają długie przedłużenia.</li>
	<li>Twórz filmy, aby rejestrować transformację megakariocytów.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja megakariocytów wydłużających propłytki
<ol>
	<li>Narysuj mapę, aby zlokalizować każdą sekcję w komorze inkubacyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1K).</li>
	<li>Po 1 godzinie zidentyfikuj widoczne megakariocyty (tj. gigantyczne polizbulowane komórki) na obrzeżach każdej sekcji i nanieś ich położenie na rysunek. Powtórz tę procedurę po 3 i 6 godzinach 
	UWAGA: Na podstawie rysunku można łatwo zlokalizować każdy megakariocyt w czasie i przeanalizować ewolucję ich morfologii (np. rozmiar, deformację, wydłużenie propłytek itp.). Inną możliwością jest użycie specjalnego oprogramowania nawigacyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym artykule opisano prostą i tanią metodę in vitro do oceny skuteczności megakariocytów w przedłużaniu propłytek, które narosły w szpiku kostnym. Model eksplantatu szpiku kostnego dla myszy ma cztery główne zalety. Po pierwsze, nie są wymagane żadne zaawansowane umiejętności techniczne. Po drugie, czas potrzebny do uzyskania propłytek wydłużających megakariocyty jest dość krótki, tylko 6 godzin w przypadku metody eksplantacyjnej, w porównaniu do minimum 4 dni w przypadku konwencjonalnej metody hodowli rozpocz...

Technika eksplantacji szpiku kostnego została po raz pierwszy opracowana przez Thiéry'ego i Bessisa w 1956 roku, aby opisać tworzenie się rdzeni cytoplazmatycznych megakariocytów szczura jako początkowe zdarzenie w tworzeniu płytek krwi1. Korzystając z kontrastu fazowego i technik kinematograficznych, autorzy ci scharakteryzowali transformację dojrzałych okrągłych megakariocytów w "podobne do kałamarnic" komórki małopłytkowe, z cytoplazmatycznymi przedłużeniami wykazującymi dynamiczne ruchy wydłużania i kurczenia się. Ramiona te stają się stopniowo cieńsze, aż staną się nitkowate z małymi obrzękami wzdłuż ramion i na końcach. Te typowe wydłużenia megakariocytów, uzyskane in vitro i w płynnych pożywkach, mają pewne podobieństwa do płytek krwi obserwowanych w utrwalonym szpiku kostnym, gdzie megakariocyty wystają długimi przedłużeniami przez ściany sinusoidy do krążenia krwi2,3. Odkrycie i sklonowanie TPO w 1994 roku pozwoliło na różnicowanie megakariocytów w hodowli zdolnych do tworzenia rozszerzeń propłytkowych przypominających te opisane w eksplantatach szpiku kostnego4,5,6. Jednak dojrzewanie megakariocytów jest znacznie mniej efektywne w warunkach hodowli, w szczególności rozległa sieć błon wewnętrznych megakariocytów dojrzałych w szpiku kostnym jest słabo rozwinięta w hodowanych megakariocytach, co utrudnia badania nad mechanizmami biogenezy płytek krwi7,8.
Szczegółowo opisujemy tutaj model eksplantacji szpiku kostnego, oparty na Thiéry i Bessis, aby śledzić w czasie rzeczywistym tworzenie propłytek u mysich megakariocytów, które osiągnęły pełną dojrzałość w swoim naturalnym środowisku, omijając w ten sposób możliwe artefakty in vitro i błędne interpretacje. Wyniki uzyskane na dorosłych myszach typu dzikiego przedstawiono w celu zilustrowania zdolności megakariocytów do wydłużania propłytek, ich morfologii i złożoności propłytek. Wprowadzamy również strategię szybkiego ilościowego określania w celu walidacji jakości, aby zapewnić dokładność i solidność danych podczas procesu rejestracji megakariocytów. Przedstawiony tutaj protokół jest najnowszą wersją metody opublikowaną wcześniej jako rozdział książki9.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 5 ml Igły</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>o rozmiarze 21 BD</td><td>Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Komory inkubacyjne Coverwall</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70324-02</td><td>Głębokość: 0,2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td>Dostosowane pH do 7,5</td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej</td><td>Leki zatwierdzone przez VIALEBEX</td><td>: n&deg; 3400956446995</td><td>20% (200 mg / ml -100 mL)</td></tr> <tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>ze szkła nakrywkowego Micro Cover</td> Sciences <td>72200-40</td><td>Mikroskop</td></tr> <tr><td></td><td>22 mm x 55 mmLeica Microsystems SA, Westlar, Niemcy</td><td>DMI8 - 514341</td><td>kamera mikroskopowa z obiektywem powietrznym</td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Niemcy</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>rozdzielczość obrazu: 4,2 megapiksela</td></tr><tr><td>Serum dla myszy</td><td>BioWest</td><td>S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 &mu; g/ml streptomycyny i 29,2 mg/ml glutaminy</td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza D (+)</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Ostatni etap megakariopoezy prowadzi do cytoplazmatycznych rozszerzeń dojrzałych megakariocytów, tak zwanych propłytków. Wiele odkryto na temat tworzenia propłytek krwi przy użyciu megakariocytów różnicowanych in vitro; Istnieje jednak coraz więcej dowodów na to, że konwencjonalne systemy hodowli nie odwzorowują wiernie procesu różnicowania/dojrzewania, który zachodzi w szpiku kostnym. W tym manuskrypcie prezentujemy metodę eksplantatu opisaną po raz pierwszy w 1956 roku przez Thiéry'ego i Bessisa w celu wizualizacji megakariocytów, które dojrzały w swoim naturalnym środowisku, omijając w ten sposób potencjalne artefakty i błędne interpretacje. Świeże szpiki kostne pobiera się przez płukanie kości udowych myszy, kroi się je na odcinki o przekroju 0,5 mm i umieszcza w komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C zawierającej bufor fizjologiczny. Megakariocyty stają się stopniowo widoczne na obrzeżach eksplantatu i są obserwowane do 6 godzin pod odwróconym mikroskopem sprzężonym z kamerą wideo. Z biegiem czasu megakariocyty zmieniają swój kształt, przy czym niektóre komórki mają formę kulistą, a inne rozwijają grube przedłużenia lub wydłużają wiele cienkich płytek z rozległymi rozgałęzieniami. Prowadzone są zarówno badania jakościowe, jak i ilościowe. Ta metoda ma tę zaletę, że jest prosta, powtarzalna i szybka, ponieważ obecne są liczne megakariocyty, a klasycznie połowa z nich tworzy propłytki w ciągu 6 godzin w porównaniu do 4 dni w przypadku megakariocytów hodowanych myszy. Oprócz badania zmutowanych myszy, ciekawym zastosowaniem tej metody jest prosta ocena czynników farmakologicznych w procesie wydłużania propłytek, bez ingerencji w proces różnicowania, który może zachodzić w kulturach.

Wyniki jakościowe. Na początku eksperymentu wszystkie komórki są zagregowane w przekroju szpiku kostnego. Po 30 min komórki stają się wyraźnie widoczne na obrzeżach eksplantów. Megakariocyty można wówczas rozpoznać po ich dużym rozmiarze, a następnie można badać ich ewolucję w czasie (rozmiar, kształt, dynamikę, wydłużanie proplaćeczek i uwalnianie płytek krwi) (Rycina 2A). Małe megakariocyty mają średnicę od 20 do 30 µm i ich jądra są wielokilobulate, natomiast dojrzałe, ok...

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę eksplantacji szpiku kostnego, od przygotowania próbki do analizy mikroskopowej, aby ocenić zdolność megakariocytów, które zróżnicowały się w swoim środowisku fizjologicznym, do tworzenia propłytek.

Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie w czasie rzeczywistym powstawania propłytek z mysich megakariocytów, które dojrzewały w swoim naturalnym środowisku. Ta metoda ma tę zaletę, że jest prosta, powtarzalna i szybka. Można przeanalizować wiele megakariocytów i uwidocznić tworzenie się propłytek krwi w ciągu zaledwie sześciu godzin, zamiast czekać na pierwszy dzień hodowli, jak w przypadku megakariocytów myszy in vitro.Ciekawym zastosowaniem tej metody jest możliwość zbadania efektu leczenia farmakologicznego lub mutacji genetycznej, szczególnie w etapie wydłużania się propłytek. Tutaj nie ma ingerencji w proces różnicowania, jak w przypadku hodowli in vitro. Ten film pomaga zapewnić te kluczowe etapy płukania i cięcia szpiku kostnego.Wyjaśniono również, jak klasyfikować morfologię i megakariocyty, co jest bardzo przydatne do charakteryzowania defektów w chorobie trombofilowej. Na początek podgrzej bufor Tyrode'a do 37 stopni Celsjusza i włącz komorę grzewczą mikroskopu, aby podnieść temperaturę do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj wszystkie niezbędne narzędzia, takie jak timer, komory inkubacyjne, pięciomililitrowe strzykawki o rozmiarze 21, kleszcze, żyletka, pipety Pasteura, szkiełka podstawowe i 15-mililitrowa probówka wirówkowa.Przepłukać szpik kostny dwoma mililitrami buforu Tyrode'a, wprowadzając igłę o rozmiarze 21 do otworu kości udowej po stronie kolana i powoli naciskaj tłok, aby pobrać nienaruszony cylinder szpiku. Użyj trzyminutowej plastikowej pipety, aby ostrożnie i delikatnie przenieść nienaruszony szpik kostny na szklane szkiełko. Odetnij końce szpiku, które mogły zostać ściśnięte w czasie spłukiwania.Następnie wytnij cienkie przekroje poprzeczne o grubości 0,5 milimetra za pomocą ostrej żyletki, aby uniknąć uszkodzenia megakariocytów. Za pomocą plastikowej pipety zbierz 10 odcinków do jednomililitrowej probówki zawierającej bufor Tyrode. Ostrożnie przenieś sekcje do komory inkubacyjnej o średnicy 13 milimetrów.Odessać bufor i dostosować objętość do 30 mikrolitrów buforu Tyrode'a uzupełnionego 5% serum myszy. Ustaw sekcje w pewnej odległości. Uszczelnij komorę samoprzylepną szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 55 milimetrów, nachylając szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.Umieść komorę w komorze grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Uruchom chronometr i przeprowadzaj eksperyment przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, nagrywaj filmy, aby nagrać transformację megakariocytów. Po 30 minutach komórki szpiku stopniowo migrują na obrzeża eksplantatu, tworząc monowarstwę.Po godzinie inkubacji megakariocyty można zidentyfikować po ich dużych rozmiarach i polizrazikowych jądrach. Liczba megakariocytów wzrasta po trzech godzinach inkubacji, a niektóre mają długie przedłużenia. Narysuj mapę, aby zlokalizować każdą sekcję w komorze inkubacyjnej.Po godzinie zidentyfikuj widoczne megakariocyty, które są gigantycznymi polipłatowymi komórkami na obrzeżach każdej sekcji, i narysuj ich położenie na rysunku. Powtórz tę procedurę po trzech i sześciu godzinach. Megakariocyty są liczone ręcznie i klasyfikowane zgodnie z ich morfologią po trzech i sześciu godzinach od zamknięcia komory inkubacyjnej.Są klasyfikowane jako małe, duże z grubym zamiarem i wydłużające się proplateczki. Za pomocą mapowania można śledzić ich ewolucję w czasie. Wyniki są wyrażone jako procent każdej klasy w każdym czasie obserwacji.Klasycznie połowa megakariocytów widocznych na obrzeżach wydłuża propłytki krwi po sześciu godzinach w przypadku szpiku kostnego myszy typu dzikiego. Losy okrągłych megakariocytów śledzono poprzez przechwytywanie sekwencyjnych obrazów w czasie, aby zobrazować, w jaki sposób tworzą one propłytki. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest utrzymywanie eksplantatów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania eksperymentu.Inna temperatura może zmienić wyniki. Co ciekawe, protokół eksplantatu może być stosowany po introwertycznych eksperymentach mikroskopowych. W końcu megakariocyty w eksplantatach szpiku kostnego będą naturalnie fluorescencyjne, a ich zachowanie będzie można łatwo zbadać.Umożliwia to łączenie różnych metod leczenia na tych samych zwierzętach, a tym samym zmniejszenie liczby myszy. Podsumowując, metoda eksplantatu jest szybka, prosta i dostarcza wielu informacji na temat zdolności naturalnych megakariocytów do zewnętrznych propłytek. Uzyskane wyniki jakościowe i ilościowe są kluczem do naszego zrozumienia choroby trombofilowej.w kontekście fizjologicznym lub patologicznym.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

W tym filmie pokazujemy aktywację makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w odpowiedzi na bakteryjny lipopolisacharyd i dożylną immunoglobulinę.

Aktywacja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy w odpowiedzi na przeciwciała

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Ten manuskrypt opisuje protokół izolacji i hodowli osteoklastów in vitro ze szpiku kostnego myszy oraz badania roli ssaczo-mechanistycznego celu kompleksu rapamycyny 1 w tworzeniu osteoklastów.

Test hodowli osteoklastów szpiku kostnego myszy oparty na RANKL w celu zbadania roli mTORC1 w tworzeniu osteoklastów

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy łatwy do wdrożenia, ustandaryzowany, mikrofizjologiczny system, który odzwierciedla złożoność struktury ludzkiego szpiku kostnego in vivo, dostarczając odpowiedniego modelu do precyzyjnego badania szerokiego zakresu normalnych i patologicznych zdarzeń.

Model 3D ludzkiego szpiku kostnego do badania dynamiki i interakcji między komórkami rezydentnymi w kontekście fizjologicznym lub nowotworowym

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Poznaj metodę eksplantatu szpiku kostnego myszy do obserwacji tworzenia propłytek megakariocytów w czasie rzeczywistym. Protokół umożliwia analizę jakościową i ilościową w ciągu sześciu godzin.

Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy

Przeglądaj więcej filmów