Dynamika tworzenia propłytek świeżych eksplantatów szpiku kostnego myszy
20 maja 2021
Tutaj szczegółowo opisujemy metodę eksplantacji szpiku kostnego, od przygotowania próbki do analizy mikroskopowej, aby ocenić zdolność megakariocytów, które zróżnicowały się w swoim środowisku fizjologicznym, do tworzenia propłytek.
Ogólnym celem tej procedury jest śledzenie w czasie rzeczywistym powstawania propłytek z mysich megakariocytów, które dojrzewały w swoim naturalnym środowisku. Ta metoda ma tę zaletę, że jest prosta, powtarzalna i szybka. Można przeanalizować wiele megakariocytów i uwidocznić tworzenie się propłytek krwi w ciągu zaledwie sześciu godzin, zamiast czekać na pierwszy dzień hodowli, jak w przypadku megakariocytów myszy in vitro.
Ciekawym zastosowaniem tej metody jest możliwość zbadania efektu leczenia farmakologicznego lub mutacji genetycznej, szczególnie w etapie wydłużania się propłytek. Tutaj nie ma ingerencji w proces różnicowania, jak w przypadku hodowli in vitro. Ten film pomaga zapewnić te kluczowe etapy płukania i cięcia szpiku kostnego.
Wyjaśniono również, jak klasyfikować morfologię i megakariocyty, co jest bardzo przydatne do charakteryzowania defektów w chorobie trombofilowej. Na początek podgrzej bufor Tyrode'a do 37 stopni Celsjusza i włącz komorę grzewczą mikroskopu, aby podnieść temperaturę do 37 stopni Celsjusza. Przygotuj wszystkie niezbędne narzędzia, takie jak timer, komory inkubacyjne, pięciomililitrowe strzykawki o rozmiarze 21, kleszcze, żyletka, pipety Pasteura, szkiełka podstawowe i 15-mililitrowa probówka wirówkowa.
Przepłukać szpik kostny dwoma mililitrami buforu Tyrode'a, wprowadzając igłę o rozmiarze 21 do otworu kości udowej po stronie kolana i powoli naciskaj tłok, aby pobrać nienaruszony cylinder szpiku. Użyj trzyminutowej plastikowej pipety, aby ostrożnie i delikatnie przenieść nienaruszony szpik kostny na szklane szkiełko. Odetnij końce szpiku, które mogły zostać ściśnięte w czasie spłukiwania.
Następnie wytnij cienkie przekroje poprzeczne o grubości 0,5 milimetra za pomocą ostrej żyletki, aby uniknąć uszkodzenia megakariocytów. Za pomocą plastikowej pipety zbierz 10 odcinków do jednomililitrowej probówki zawierającej bufor Tyrode. Ostrożnie przenieś sekcje do komory inkubacyjnej o średnicy 13 milimetrów.
Odessać bufor i dostosować objętość do 30 mikrolitrów buforu Tyrode'a uzupełnionego 5% serum myszy. Ustaw sekcje w pewnej odległości. Uszczelnij komorę samoprzylepną szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 55 milimetrów, nachylając szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
Umieść komorę w komorze grzewczej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Uruchom chronometr i przeprowadzaj eksperyment przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, nagrywaj filmy, aby nagrać transformację megakariocytów. Po 30 minutach komórki szpiku stopniowo migrują na obrzeża eksplantatu, tworząc monowarstwę.
Po godzinie inkubacji megakariocyty można zidentyfikować po ich dużych rozmiarach i polizrazikowych jądrach. Liczba megakariocytów wzrasta po trzech godzinach inkubacji, a niektóre mają długie przedłużenia. Narysuj mapę, aby zlokalizować każdą sekcję w komorze inkubacyjnej.
Po godzinie zidentyfikuj widoczne megakariocyty, które są gigantycznymi polipłatowymi komórkami na obrzeżach każdej sekcji, i narysuj ich położenie na rysunku. Powtórz tę procedurę po trzech i sześciu godzinach. Megakariocyty są liczone ręcznie i klasyfikowane zgodnie z ich morfologią po trzech i sześciu godzinach od zamknięcia komory inkubacyjnej.
Są klasyfikowane jako małe, duże z grubym zamiarem i wydłużające się proplateczki. Za pomocą mapowania można śledzić ich ewolucję w czasie. Wyniki są wyrażone jako procent każdej klasy w każdym czasie obserwacji.
Klasycznie połowa megakariocytów widocznych na obrzeżach wydłuża propłytki krwi po sześciu godzinach w przypadku szpiku kostnego myszy typu dzikiego. Losy okrągłych megakariocytów śledzono poprzez przechwytywanie sekwencyjnych obrazów w czasie, aby zobrazować, w jaki sposób tworzą one propłytki. Ważną rzeczą, o której należy pamiętać podczas próby tej procedury, jest utrzymywanie eksplantatów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania eksperymentu.
Inna temperatura może zmienić wyniki. Co ciekawe, protokół eksplantatu może być stosowany po introwertycznych eksperymentach mikroskopowych. W końcu megakariocyty w eksplantatach szpiku kostnego będą naturalnie fluorescencyjne, a ich zachowanie będzie można łatwo zbadać.
Umożliwia to łączenie różnych metod leczenia na tych samych zwierzętach, a tym samym zmniejszenie liczby myszy. Podsumowując, metoda eksplantatu jest szybka, prosta i dostarcza wielu informacji na temat zdolności naturalnych megakariocytów do zewnętrznych propłytek. Uzyskane wyniki jakościowe i ilościowe są kluczem do naszego zrozumienia choroby trombofilowej.
w kontekście fizjologicznym lub patologicznym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybką i powtarzalną metodę hodowli eksplantów do wizualizacji tworzenia propłytkow z megakariocytów mysich, dojrzałych w ich natywnym środowisku szpiku kostnego. Protokół ten umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym oraz analizę ilościową wydłużania się propłytkow, dostarczając wiedzy na temat zachowania megakariocytów w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hematologia
- Biologia komórki
- Mikroskopia
Wprowadzenie
- Megakariopoeza kończy się formowaniem protopłytek z dojrzałych megakariocytów.
- Tradycyjne systemy hodowli in vitro mogą nie odzwierciedlać wiernie procesów różnicowania i dojrzewania in vivo.
- Konwencjonalne metody hodowli mogą prowadzić do powstawania artefaktów i błędnych interpretacji.
- Badanie megakariocytów w ich naturalnym środowisku jest kluczowe dla zrozumienia chorób trombofilnych.
Cel badania
- Aby przedstawić metodę obserwacji powstawania propłytek z natywnych megakariocytów w czasie rzeczywistym.
- Aby umożliwić jakościową i ilościową ocenę morfologii megakariocytów oraz wydłużania się propłytek.
- Aby ułatwić badanie mutacji genetycznych i terapii farmakologicznych wpływających specyficznie na proces powstawania propłytek.
Zastosowane metody
- Pobieranie świeżego szpiku kostnego z kości udowych myszy poprzez płukanie buforem Tyrode'a.
- Krojenie szpiku w poprzeczne sekcje o grubości 0,5 mm i inkubowanie w temperaturze 37°C w buforze fizjologicznym z surowicą mysią.
- Umieszczanie sekcji w komorze inkubacyjnej pod mikroskopem odwróconym wyposażonym w kamerę wideo.
- Ręczne mapowanie, liczenie i klasyfikacja morfologiczna megakariocytów w wielu punktach czasowych (1, 3 i 6 godzin).
Główne wyniki
- Megakariocyty stają się widoczne na obwodzie eksplantu i mogą być obserwowane przez okres do 6 godzin.
- Komórki wykazują dynamiczne zmiany morfologiczne, w tym formy sferyczne, grube wypustki oraz rozległe rozgałęzienia propłytek.
- Około połowa megakariocytów wytwarza propłytki w ciągu 6 godzin, w porównaniu do 4 dni w standardowej hodowli.
- Metoda ta umożliwia zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zachowania megakariocytów oraz procesu powstawania propłytek.
Wnioski
- Metoda eksplantu jest prosta, szybka i powtarzalna w badaniu tworzenia propłytek w natywnych megakariocytach.
- Pozwala ona uniknąć artefaktów związanych z różnicowaniem in vitro i umożliwia bezpośrednią ocenę interwencji farmakologicznych lub genetycznych.
- Podejście to pogłębia zrozumienie funkcji megakariocytów oraz mechanizmów chorób trombofilnych w kontekstach fizjologicznych i patologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośrednia wizualizacja powstawania proplateletów z natywnych eksplantów szpiku kostnego myszy wypełnia krytyczną lukę w modelowaniu późnych etapów megakaryopoezy na potrzeby walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego. Metoda ta umożliwia szybką, ilościową ocenę funkcji megakariocytów pod wpływem perturbacji fizjologicznych i farmakologicznych, co zwiększa wiarygodność przewidywań w badaniach nad trombopoezą. Jej powtarzalność i szybkość ułatwiają podejmowanie solidnych decyzji procesowych w programach odkrywania leków i badaniach przedklinicznych skoncentrowanych na hematologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z produkcją płytek krwi oraz biologią megakariocytów.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez izolację etapu wydłużania proplatetek w kontekście tkanki natywnej.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie wpływu na procesy dojrzewania i wydłużania.
- Dostarcza ilościowych wyników niezbędnych do segregacji portfolio i wczesnego podejmowania decyzji go/no-go.
Przesiew i opracowywanie testu
- Przygotowuje walidowane, fizjologicznie istotne systemy eksplantów do przesiewania związków.
- Zapewnia odtwarzalne, ilościowe wyniki tworzenia protopłytki w ciągu sześciu godzin.
- Umożliwia standaryzację klasyfikacji morfologicznej i mapowania w celu opracowania analizy.
- Wspiera wiarygodną ocenę czynników farmakologicznych bez zakłócających artefaktów różnicowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi w badaniach nad zaburzeniami trombofilnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednią ocenę interwencji genetycznych i farmakologicznych.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną w translacyjnych badaniach biomarkerów tworzenia płytek krwi.
- Wspiera optymalizację ryzyka w rozwoju projektów z obszaru hematologii.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda z eksplantatem wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając szybką, ilościową analizę funkcji megakariocytów oraz odpowiedzi na leki w naturalnym kontekście tkankowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla późnych etapów megakariopoezy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne systemy eksplantów z ilościowymi wynikami morfologicznymi.
- Analityka: Umożliwia ręczne mapowanie, klasyfikację i statystyczne porównanie wydłużania się propłytek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z istotnością in vivo dla modeli chorób trombofilnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, zestandaryzowaną platformę do powtarzalnych badań farmakologicznych i genetycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad biologią płytek krwi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybkie, powtarzalne i zestandaryzowane wyniki dla przepływów pracy międzyzespołowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową w programach hematologicznych we wczesnej fazie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów ukierunkowanych na trombopoezę.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w pracy z szpikiem kostnym oraz w mikroskopii żywych komórek.
- Wymaga dostępu do mikroskopu odwróconego z funkcją rejestracji wideo oraz inkubacji z kontrolą temperatury.
- Wymaga standaryzacji protokołów klasyfikacji morfologicznej i mapowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do badań mutantów genetycznych oraz interwencji farmakologicznych w modelach mysich.
- Wrażliwość na temperaturę oraz manualna klasyfikacja mogą ograniczać przepustowość w przypadku przesiewów na dużą skalę.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:22
Preparation of the Experimental Set Up
1:51
Bone Marrow Sectioning and Placement into the Incubation Chamber
3:13
Real-Time Observation of Marrow Explants and Quantification of the Proplatelet-Extending Megakaryocytes
4:02
Results: Morphological Assessment of Megakaryocytes in Explants
4:45
Conclusion
