Name: Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj izolację pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z myszego modelu raka piersi. Ta metoda umożliwia badanie celowanych nanocząstek w mikrośrodowisku nowotworowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) w ramach projektu IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. SM docenia Centrum Badań Klinicznych Pediatrii "Romeo i Enrica Invernizzi", które popiera jej stanowisko. AB dziękuje AIRC (projekt ID. 20172) i Uniwersytetowi w Mediolanie za stypendium badawcze. Staże podoktorskie i doktoranckie LS i MS są wspierane przez Uniwersytet w Mediolanie.

<ol><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Velaei, K., Samadi, N., Barazvan, B., Soleimani Rad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment-mediated+chemoresistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment-mediated chemoresistance in breast cancer.</a> Breast. 30, 92-100 (2016).</li>
<li>Cheng, J. D., Weiner, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+and+their+microenvironments%3A+tilling+the+soil.+Commentary+re%3A+A.+M.+Scott+et+al.%2C+A+Phase+I+dose-escalation+study+of+sibrotuzumab+in+patients+with+advanced+or+metastatic+fibroblast+activation+protein-positive+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumors and their microenvironments: tilling the soil. Commentary re: A. M. Scott et al., A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer.</a> Clinical Cancer Research. 9 (5), 1690-1695 (2003).</li>
<li>Hui, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment%3A+Sanctuary+of+the+devil%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil.</a> Cancer Letters. 368 (1), 7-13 (2015).</li>
<li>Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment at a glance.</a> Journal of Cell Science. 125, 5591-5596 (2012).</li>
<li>Chen, X., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+foes+to+friends%3A+targeting+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Turning foes to friends: targeting cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Review. Drug Discovery. 18 (2), 99-115 (2019).</li>
<li>Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+associated+fibroblasts+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).</li>
<li>LeBleu, V. S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peek+into+cancer-associated+fibroblasts%3A+origins%2C+functions+and+translational+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A peek into cancer-associated fibroblasts: origins, functions and translational impact.</a> Disease Models & Mechanisms. 11, (2018).</li>
<li>Li, X. -Y., Hu, S. -Q., Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-associated+fibroblasts+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The cancer-associated fibroblasts and drug resistance.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 19 (11), 2112-2119 (2015).</li>
<li>Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts%3A+a+multifaceted+driver+of+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts: a multifaceted driver of breast cancer progression.</a> Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).</li>
<li>Truffi, M., Sorrentino, L., Corsi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in the tumor microenvironment.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 15-29 (2020).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity+and+immunosuppressive+environment+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity and immunosuppressive environment in human breast cancer.</a> Cancer Cell. 33 (3), 463-479 (2018).</li>
<li>Ishii, G., Ochiai, A., Neri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblast+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional heterogeneity of cancer-associated fibroblast within the tumor microenvironment.</a> Advances Drug Delivery Reviews. 99, Part B 186-196 (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+tumor+microenvironment+with+emerging+nanotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Remodeling the tumor microenvironment with emerging nanotherapeutics.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 39 (1), 59-74 (2018).</li>
<li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-strategies+to+target+breast+cancer-associated+fibroblasts%3A+rearranging+the+tumor+microenvironment+to+achieve+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nano-strategies to target breast cancer-associated fibroblasts: rearranging the tumor microenvironment to achieve antitumor efficacy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1263(2019).</li>
<li>Tong, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+Targeting+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines Targeting the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Journal. 21 (4), 314-321 (2015).</li>
<li>Kaps, L., Schuppan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+associated+fibroblasts+in+liver+fibrosis+and+liver+cancer+using+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer associated fibroblasts in liver fibrosis and liver cancer using nanocarriers.</a> Cells. 9 (9), 2027(2020).</li>
<li>Miao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor-associated+fibroblasts+for+therapeutic+delivery+in+desmoplastic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor-associated fibroblasts for therapeutic delivery in desmoplastic tumors.</a> Cancer Research. 77 (3), 719-731 (2017).</li>
<li>Kelly, T., Huang, Y., Simms, A. E., Mazur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+activation+protein-%CE%B1%3A+a+key+modulator+of+the+microenvironment+in+multiple+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast activation protein-α: a key modulator of the microenvironment in multiple pathologies.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 297, 83-116 (2012).</li>
<li>Brennen, W. N., Isaacs, J. T., Denmeade, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationale+behind+targeting+fibroblast+activation+protein-expressing+carcinoma-associated+fibroblasts+as+a+novel+chemotherapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Rationale behind targeting fibroblast activation protein-expressing carcinoma-associated fibroblasts as a novel chemotherapeutic strategy.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 11 (2), 257-266 (2012).</li>
<li>Juillerat-Jeanneret, L., Tafelmeyer, P., Golshayan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+activation+protein-%CE%B1+in+fibrogenic+disorders+and+cancer%3A+more+than+a+prolyl-specific+peptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Fibroblast activation protein-α in fibrogenic disorders and cancer: more than a prolyl-specific peptidase.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21, 977-991 (2017).</li>
<li>Falvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+targeting+melanoma+with+cisplatin+encapsulated+in+protein-cage+nanoparticles+based+on+human+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: targeting melanoma with cisplatin encapsulated in protein-cage nanoparticles based on human ferritin.</a> Nanoscale. 5 (24), 12278-12285 (2013).</li>
<li>Truffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+nanocages%3A+A+biological+platform+for+drug+delivery%2C+imaging+and+theranostics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Ferritin nanocages: A biological platform for drug delivery, imaging and theranostics in cancer.</a> Pharmacological Research. 107, 57-65 (2016).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+magnetic+resonance+imaging+and+staining+of+cancer+cells+using+ferrimagnetic+H-ferritin+nanoparticles+with+increasing+core+size%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced magnetic resonance imaging and staining of cancer cells using ferrimagnetic H-ferritin nanoparticles with increasing core size.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 2619-2634 (2015).</li>
<li>Heger, Z., Skalickova, S., Zitka, O., Adam, V., Kizek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoferritin+applications+in+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Apoferritin applications in nanomedicine.</a> Nanomedicine. 9 (14), 2233-2245 (2014).</li>
<li>Mazzucchelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometronomic+treatment+of+4T1+breast+cancer+with+nanocaged+doxorubicin+prevents+drug+resistance+and+circumvents+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Nanometronomic treatment of 4T1 breast cancer with nanocaged doxorubicin prevents drug resistance and circumvents cardiotoxicity.</a> Oncotarget. 8 (5), 8383-8396 (2017).</li>
<li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer-associated+fibroblasts+by+dual-responsive+lipid-albumin+nanoparticles+to+enhance+drug+perfusion+for+pancreatic+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer-associated fibroblasts by dual-responsive lipid-albumin nanoparticles to enhance drug perfusion for pancreatic tumor therapy.</a> Journal of Controlled Release. 321, 564-575 (2020).</li>
<li>Mertens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+deleting+cancer-associated+fibroblasts+in+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of deleting cancer-associated fibroblasts in cholangiocarcinoma.</a> Cancer Research. 73 (2), 897-907 (2013).</li>
<li>Kovács, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+nanoparticles+suppress+metastasis+and+modify+the+tumour-supportive+activity+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Core-shell nanoparticles suppress metastasis and modify the tumour-supportive activity of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Nanobiotechnology. 18, 18(2020).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4425(2013).</li>
<li>Sitia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+cancer-associated+fibroblasts+by+engineered+H-ferritin+nanocages+loaded+with+navitoclax%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of cancer-associated fibroblasts by engineered H-ferritin nanocages loaded with navitoclax.</a> Cells. 10 (2), 328(2021).</li>
<li>Bellini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocages+for+self-triggered+nuclear+delivery+of+DNA-targeted+chemotherapeutics+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in cancer cells.</a> Journal of Controlled Release. 196, 184-196 (2014).</li>
<li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nature Reviews Cancer. 20, 174-186 (2020).</li>
<li>Dvořánková, B., Lacina, L., Smetana, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+fibroblasts+and+their+cancer-associated+counterparts+%28CAFs%29+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal fibroblasts and their cancer-associated counterparts (CAFs) for biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 393-406 (2018).</li>
<li>Calvo, F., Hooper, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+immortalization+of+fibroblasts+from+different+tumoral+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation and immortalization of fibroblasts from different tumoral stages.</a> Bio-protocol. 4 (7), 1097(2014).</li>
<li>Sha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cancer-associated+fibroblasts+and+its+promotion+to+the+progression+of+intrahepatic+cholangiocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of cancer-associated fibroblasts and its promotion to the progression of intrahepatic cholangiocarcinoma.</a> Cancer Medicine. 7 (9), 4665-4677 (2018).</li>
<li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li>
<li>Zhen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanocage+mediated+fibroblast-activation+protein+targeted+photoimmunotherapy+to+enhance+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+tumor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Protein nanocage mediated fibroblast-activation protein targeted photoimmunotherapy to enhance cytotoxic T cell infiltration and tumor control.</a> Nano Letters. 17 (2), 862-869 (2017).</li>
<li>Ji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+assembly+integration+of+fibroblast-targeting+and+cell-penetration+features+for+enhanced+antitumor+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+Materials%22%5BJournal%5D)">Peptide assembly integration of fibroblast-targeting and cell-penetration features for enhanced antitumor drug delivery.</a> Advances Materials. 27 (11), 1865-1873 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CAF stają się kluczowymi graczami w przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej, promowaniu progresji przerzutów i ograniczaniu dostępu leku do miejsca guza34. Jednak ze względu na ich heterogeniczność, ich role są nadal kontrowersyjne - niektóre CAF są rakotwórcze, podczas gdy niektóre inne podtypy wydają się odgrywać rolę supresyjną nowotworu. W tym kontekście, ich izolacja może być niezwykle interesująca, aby rzucić więcej światła na ich szeroko dyskutowaną rolę w progresji raka, co będzie miało ważne implikacje kliniczne12,31. Co więcej, udana ekstrakcja CAF z ludzkich i przedklinicznych mysich modeli nowotworów ułatwiłaby również opracowanie nowych leków ukierunkowanych na CAF. W artykule przedstawiono metodę skutecznego izolowania i hodowli pierwotnych CAF z syngenicznego modelu przedklinicznego raka piersi. Opierając się na doświadczeniu, trzy etapy eksperymentalne mają największy wpływ na powodzenie protokołu.
Pierwszym z nich jest szybkie działanie, aby uniknąć agregacji zawiesin komórkowych związanych z ryzykiem krzepnięcia w kolumnie i spowolnienia wypływu komórek: w rzeczywistości, gdy komórki, które przeszły przez kolumnę, były zgrupowane razem, prawdopodobieństwo nieoptymalnego procesu izolacji wzrosło, a końcowe kultury zawierały "zanieczyszczające" klony komórek. Drugi polega na łączeniu komórek z różnych nowotworów po pasażu zubożenia, aby zagwarantować wystarczającą liczbę komórek do przejścia w końcowym etapie wzbogacania. Ostatnią krytyczną kwestią jest posiewanie wyekstrahowanych komórek w dużej gęstości komórek, najprawdopodobniej zaczynając od pojedynczego dołka 24-dołkowej płytki, aby przyspieszyć wzrost komórek i ekspansję kolonii do 4-5 pasaży. Jeśli komórki zostały zasiane w niskiej gęstości, rozszerzały się na wolnej powierzchni i szybko przestawały się replikować.
W kilku badaniach opisano już metody ekstrakcji CAF zarówno pochodzenia ludzkiego, jak i mysiego, w celu zbadania ich roli w promowaniu rozwoju i inwazyjności raka. Zrobiono to w wielu typach nowotworów, w tym raku piersi, czerniaku, raku dróg żółciowych i gruczolakoraka trzustki 35,36,37,38. Jednak ze względu na brak specyficznych markerów CAF i ich niejednorodność, wyniki tych procesów są nadal nieoptymalne.
W tym przypadku wyizolowane komórki wykorzystano do walidacji zdolności nanokage HFn do kierowania na CAF funkcjonalizowanych ugrupowaniami celującymi anty-FAP. Zastosowanie pierwotnych kultur CAF było istotną zaletą, pozwalającą na walidację nanostrategii ex vivo za pomocą znacznie prostszego i bardziej opłacalnego eksperymentu wiązania niż przeprowadzanie go bezpośrednio in vivo w tej wstępnej fazie optymalizacji nanoleków.
W tym sensie badania ex vivo CAF mogą poprzedzać doświadczenia in vivo na zwierzętach, umożliwiając badania przesiewowe i selekcję najbardziej obiecujących nanocząstek w celu optymalnego ukierunkowania CAF. Prezentowany tu model CAF może być również wykorzystany do wstępnych badań skuteczności, przy ładowaniu nanocząstek aktywnymi lekami. Zwierzęta zostaną wykorzystane dopiero później do oceny biodystrybucji, farmakokinetyki i badań skuteczności.
Opracowywanych jest kilka nanoleków ukierunkowanych na CAF, takich jak nanokage ferrytyny do terapii fotodynamicznej w raku piersi oraz cząstki oparte na peptydach do dostarczania doksorubicyny w modelach raka prostaty39,40. Jednak niewiele badań koncentrowało się na izolacji CAF jako platform komórkowych do optymalizacji nanoleków.
Ten protokół ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, jest to czasochłonny protokół, wymagający przygotowania i zakupu kilku odczynników i materiałów. Po drugie, ze względu na niedobór CAF w guzie piersi 4T1, ich wydajność jest niska. Eksperymenty z nanocząstkami powinny być planowane i przeprowadzane tak szybko, jak tylko zostanie osiągnięta wymagana liczba komórek, ponieważ pierwotne CAF ulegają starzeniu i nie mogą być utrzymywane w hodowli przez długi czas. Podsumowując, ta metoda izolacji, hodowli i charakterystyki CAF może być potężnym narzędziem przyspieszającym rozwój nowych celowanych nanoleków w walce z rakiem.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci stało się jasne, że zabijanie komórek nowotworowych zwykle nie wystarcza do wyeliminowania nowotworu, ponieważ mikrośrodowisko guza może spowodować nawrót nowotworu i wywołać opór terapeutyczny1,2. Pojawił się wtedy nowy paradygmat: celowanie w zrąb guza, aby pozbawić guz czynników wspierających, a tym samym zwiększyć skuteczność chemioterapeutyków3,4,5. W szczególności fibroblasty związane z rakiem (CAF) są interesującym celem zrębu w wielu guzach litych6,7. CAF to bardzo niejednorodna grupa komórek, która oddziałuje z komórkami rakowymi i komórkami układu odpornościowego poprzez wydzielanie czynników wzrostu, cytokin i chemokin; budować i przebudowywać macierz zewnątrzkomórkową; i włącz tworzenie przerzutów8,9,10,11,12. W zależności od typu nowotworu, CAF wykazują funkcje pronowotworowe, podczas gdy inne podtypy CAF wydają się mieć funkcje supresyjne nowotworu13,14. Aby lepiej wyjaśnić tę dychotomię, ważna jest dokładna charakterystyka CAF z guzów pierwotnych i przerzutowych.
W tym kontekście, rozwijająca się dziedzina badań skupiła się na rozwoju nanowymiarowych środków przeznaczonych do zwalczania i/lub niszczenia CAF poprzez dostarczanie aktywnych cząsteczek i leków zdolnych do przebudowy mikrośrodowiska guza15,16,17,18. Zaprojektowano kilka rodzajów nanocząstek, aby osiągnąć ablację CAF za pomocą leków cytotoksycznych, indukować terapię fotodynamiczną ukierunkowaną na CAF lub przeprogramować CAF poprzez przywrócenie ich do stanu spoczynku lub indukowanie ekspresji ligandów indukowanej apoptozą związaną z TNF, która indukuje apoptozę sąsiednich komórek rakowych16,19. Co więcej, potencjał wielu nanocząstek do aktywnego ukierunkowania na określone markery biologiczne daje nadzieję na wybór podzbiorów CAF do celu. Chociaż jego bezwzględna specyficzność dla CAF jest nadal kwestionowana, białko aktywujące fibroblasty (FAP) jest jednym z najbardziej obiecujących celów pronowotworowego zrębu i jest wykorzystywane do sterowania dostarczaniem nanoleków, torując w ten sposób drogę do rozwoju nanoterapii ukierunkowanych na CAF20,21,22.
Ten artykuł opisuje izolację pierwotnych CAF z syngenicznego modelu mysiego raka piersi i opisuje ich użycie w badaniu zdolności celowania nanocząsteczek zaprojektowanych do rozpoznawania markera CAF, FAP. Nanokage ferrytynowe są używane jako potencjalne nanosystemy do opracowania metody, ponieważ ich specyfika dostarczania może być kształtowana przez ekspozycję powierzchniową ugrupowań docelowych23,24. Co więcej, udało się udowodnić, że ferrytyny są doskonałymi biokompatybilnymi wahadłowcami do zastosowań przeciwnowotworowych, wywołując szybką akumulację ładunku w masie guza25,26,27. Do tej pory badania przedkliniczne nanosystemów ukierunkowanych na CAF obejmowały testy in vitro na liniach komórkowych fibroblastów stymulowanych w hodowli transformującym czynnikiem wzrostu-beta w celu indukowania aktywacji komórek i ekspresji niektórych cech immunofenotypowych CAFs28,29. Ta metoda jest zwykle stosowana do unieśmiertelnionych linii komórkowych (takich jak NIH3T3, LX-2) i jest dość szybka i prosta, dając aktywowane komórki w ciągu kilku godzin lub dni. Ograniczeniem jest to, że chociaż stymulacja in vitro indukuje ekspresję niektórych genów przypisywanych aktywowanym miofibroblastom, nie może całkowicie podsumować wszystkich cech biologicznych prawdziwych CAF, zwłaszcza ich heterogeniczności in vivo.
Inna strategia polega na ekstrakcji pierwotnych CAFów z próbek nowotworów ludzkich lub myszy30,31. Gwarantuje to, że aktywacja CAF zachodzi w kontekście fizjologicznym i że zachowana jest heterogeniczność subpopulacji CAF. Zgodnie z celem badania, CAF mogą pochodzić z różnych źródeł, co daje możliwość zbadania najbardziej wiarygodnego stanu. Opisany tutaj protokół byłby cenny dla naukowców, którzy chcą przeprowadzić wstępną ocenę funkcjonalności nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w CAF z mysiego modelu raka piersi. Wyizolowane CAF byłyby przydatne do badań przesiewowych tych nanocząstek, które są wystarczająco obiecujące, aby przejść do oceny in vivo w zwierzęcych modelach raka. Będzie to miało znaczenie podczas pierwszych etapów produkcji nanocząstek, prowadząc nanotechnologów w kierunku udoskonalenia projektowania nanocząstek, głównie biorąc pod uwagę strategię immobilizacji ligandów w celu uzyskania optymalnych właściwości docelowych.

<table><tbody><tr><td>ACK Bufor Lysing</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Przechowywać w temperaturze od +15&deg; do +30&deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-ludzkie</td><td>Nauka immunologiczna</td><td>IS-20022</td><td>Chronić przed światłem.</td></tr><tr><td>Fragment anty-FAP Fab (3F2)</td><td>Creative Biolabs</td><td>TAB-024WM-F(E)</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c myszy</td><td>Charles River</td><td>028BALB/C</td><td>7-tygodniowe samice myszy</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-796</td><td>Przeciwciało fluorescencyjne sprzężone z FITC; klon REA 737; Przechowywać w bezpiecznym miejscu pod wpływem światła w temperaturze 2&ndash; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD90.2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-960</td><td>Przeciwciało fluorescencyjne sprzężone z PE; klon 30-H12; Przechowywać w bezpiecznym miejscu pod wpływem światła w temperaturze 2&ndash; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Sitka komórkowe 70 i mikro; m</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX</td> Konfiguracja lasera <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>B4-R2-V0</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td>zawiera 10 ml mikrokulek do usuwania martwych komórek; 25 ml 20 razy; Wiążący roztwór buforowy zapasowy. Przechowywać w bezpiecznym miejscu pod wpływem światła o temperaturze 2&minus; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Odczynnik do 760504 D-Luciferin</td><td>Caliper</td><td></td><td>do obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>DMEM Wysoka glukoza bez L-glutaminy&nbsp; z pirogronianem sodu</td><td>Euroklon</td><td>ECB7501L</td><td>Ciepły w 37 & stopniach; C w łaźni wodnej przed użyciem.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia, bez Euroklonu magnezu</td><td></td><td>ECB4004L</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Euroclone</td><td></td><td>ECS0180L Przed użyciem podgrzać w temperaturze 56 &; C przez 30 minut, aby zabić wszystkie białka dopełniacza.</td></tr><tr><td>Izomer istothiocyjanianu fluoresceiny I (FITC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Przechowywać chronić przed światłem w temperaturze 2&ndash; 8 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td>Stosuje się je w połączeniu z dysocjatorem gentleMACS.</td></tr><tr><td>Dysocjator GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Dwie próbki mogą być przetwarzane równolegle. Opracowano specjalne protokoły dla różnych tkanek.</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Euroclone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12&nbsp; bez L-Glutaminy</td><td>Euroclone</td><td>ECB7502L</td><td>Ciepły w 37 &deg; C w łaźni wodnej przed użyciem.</td></tr><tr><td>System obrazowania IVIS Lumina II</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>Ten system obrazowania jest łatwy w użyciu zarówno do obrazowania fluorescencyjnego, jak i bioluminescencyjnego in vivo. Wyposażony w oprogramowanie Living Image do analizy</td></tr><tr><td>kolumn LD</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td>Składa się z ferromagnetycznych kulek, zaprojektowanych do rygorystycznego zubożania niechcianych komórek. Przed użyciem ustaw wymaganą liczbę kolumn na magnetycznej jednostce separacji i zrównoważ ją buforem</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td>200 mM Mikroskop</td></tr><tr><td>świetlny/fluorescencyjny wyposażony w kamerę</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModuł</td><td>odwróconego mikroskopu do żywych komórek z kamerą</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka separacji MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>Przed użyciem umieść magnes na odpowiednim stojaku.</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do przechowywania tkanek MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>Składa się z kulek ferromagnetycznych, przeznaczonych do pozytywnej selekcji komórek. Umieść wymaganą liczbę kolumn na magnetycznej jednostce separacji i zrównoważ ją buforem przed użyciem.</td></tr><tr><td>Środek usuwający mykoplazmę</td><td>Euroclone</td><td>ECMC210A</td><td>Rozcieńczyć w pożywce hodowlanej w stosunku 1:100.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Invitrogen</td><td>A10235</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Euroklon</td><td>ECB3054D</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Euroklon</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki homopolimer apoferrytyny H (HFn)&nbsp;</td><td>Molirom</td><td>MLR-P018</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez L-glutaminy</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>ciepły w temperaturze 37 stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji fibroblastów związanych z nowotworem</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-474</td><td>Zawiera 1 ml koktajlu zubożającego fibroblasty niezwiązane z nowotworem, mysz; 1 ml mikrogranulek CD90.2 (fibroblastów związanych z nowotworem), mysz. Przechowywać w chronić przed światłem w temperaturze 2-8 & C.</td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji nowotworów</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-730</td><td>Zawiera liofilizowane enzymy (D, R, A) i bufor A; enzymy należy rozpuścić zgodnie z instrukcjami producenta, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4%</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>rozcieńczyć w stosunku 1:1 próbką zawiesiny komórek przed zliczeniem komórek</td></tr><tr><td>TrypLE select</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>stosować w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Ciepły w 37 &stopni; C w łaźni wodnej przed użyciem</td></tr><tr><td>Kolba T75 Primo TC</td><td>Euroclone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Kolumny odsalające</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>7K MWCO, 2 ml</td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Biosigma</td><td>CL15.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Euroclone</td><td>ET5015B</td><td></td></tr><tr><td>4T1-luc2</td><td>Suwmiarka</td><td></td><td>Linia komórkowa raka gruczołu sutkowego myszy stabilnie transfekowana genem lucyferazy świetlika</td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>Euroclone</td><td>ET5050B</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Fibroblasty związane z rakiem (CAF) są kluczowymi aktorami w kontekście mikrośrodowiska guza. Pomimo zmniejszenia liczby w porównaniu z komórkami nowotworowymi, CAF regulują progresję guza i zapewniają ochronę przed odpornością przeciwnowotworową. Pojawiające się strategie przeciwnowotworowe mają na celu przemodelowanie mikrośrodowiska guza poprzez ablację pronowotworowych CAF lub przeprogramowanie funkcji CAF i ich statusu aktywacji. Obiecującym podejściem jest opracowanie nanowymiarowych środków dostarczających, które są w stanie celować w CAF, umożliwiając w ten sposób specyficzne dostarczanie leków i aktywnych cząsteczek. W tym kontekście model komórkowy CAF może stanowić użyteczne narzędzie do badań przesiewowych in vitro i wstępnych badań nad takimi nanopreparatami.
To badanie opisuje izolację i hodowlę pierwotnych CAF z syngenicznego mysiego modelu 4T1 potrójnie ujemnego raka piersi. Kulki magnetyczne użyto w 2-etapowym procesie separacji w celu ekstrakcji CAF ze zdysocjowanych guzów. Kontrolę immunofenotypowania przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po każdym pasażu w celu weryfikacji wydajności procesu. Wyizolowane CAF mogą być wykorzystywane do badania zdolności celowania różnych nanopreparatów zaprojektowanych do zwalczania mikrośrodowiska guza. Znakowane fluorescencyjnie nanokaże H-ferrytyny wykorzystano jako potencjalne nanocząstki do opracowania metody. Nanocząstki, zarówno nieosłonięte, jak i sprzężone z ligandem celującym, analizowano pod kątem ich wiązania z CAF. Wyniki sugerują, że ekstrakcja ex vivo CAF piersi może być użytecznym systemem do testowania i walidacji nanocząstek pod kątem specyficznego celowania w rakotwórcze CAF.

In vivo konfiguracja modelu dla optymalnej izolacji CAF 
Wstrzyknięcie 105 komórek 4T1-luc do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego samic myszy BALB/c prowadzi do powstania mierzalnej masy guza w 5. dniu po implantacji. Wzrost guza monitorowano przez miesiąc po implantacji, mierząc jego objętość za pomocą suwmiarki oraz żywotność komórek nowotworowych za pomocą BLI. Aby wyznaczyć odpowiedni przedział czasowy do uśmiercenia zwierząt w celu izolacji CAF, poszukiwano optymalnego kompromisu pomiędzy większym rozmiarem guza i sygnałem BLI a pojawiającą się owrzodzeniem i nekrozą guza (Rycina 1). Ponieważ rdzeń nekrotyczny pojawia się 20 dni po implantacji i powiększa się w 25. i 30. dniu (co dokumentują obrazy BLI na Rycina 1C), 20. dzień wyznaczono jako punkt czasowy pozwalający zoptymalizować odzysk komórek po procesie izolacji. Nawet po ostrożnym usunięciu wszystkich widocznych obszarów nekrozy podczas pierwszych etapów obróbki guza ex vivo, na koniec dysocjacji do pojedynczych komórek stwierdzono wysoki odsetek martwych komórek (Tabela 1). Ze względu na to, że odsetek ten może mieć znaczenie, zwłaszcza wraz ze wzrostem rozmiaru guza, usuwanie martwych komórek jest zawsze niezbędne podczas pracy z modelem 4T1.
Optymalizacja procedury izolacji, hodowli i charakterystyki CAF-ów 
Do wyizolowania populacji CAF-ów (CD90.2+ CD45-) z panelu zebranych żywych komórek wymagane są dwa dodatkowe przejścia: usuwanie fibroblastów niepowiązanych z nowotworem oraz wzbogacanie fibroblastów powiązanych z nowotworem (Rycina 2). Koktajl kulek do deplekcji skutecznie usuwa komórki CD45+ (stanowiące odpowiednio 67,35% i 0,69% wszystkich komórek przed i po deplekcji, Tabela 2) i był zawsze stosowany do przetwarzania jednego guza w każdej kolumnie. Jak pokazano w Tabeli 1, liczba eluowanych komórek spadła średnio z 3 × 106 do 1 × 105 po etapie deplekcji. Ze względu na ten gwałtowny spadek całkowitej liczby komórek, zaleca się łączenie komórek zebranych z co najmniej 2, a maksymalnie 4 guzów w jednej probówce przed przejściem do etapu wzbogacania. Dzięki temu uzyskano odpowiednią liczbę komórek do inkubacji z kulkami do fibroblastów powiązanych z nowotworem, a następnie przepuszczono je przez jedną kolumnę separacyjną, aby uzyskać końcową średnią 93% komórek CD90.2+ CD45- (Tabela 2).
Po wysianiu na płytki do hodowli tkankowej, odzyskane komórki przytwierdziły się do plastiku i wykazały dużą, wrzecionowatą morfologię typową dla fibroblastów (Rycina 3A,B), która różniła się od morfologii komórek nowotworowych 4T1 (Rycina 3D). Brak łączenia guzów po ich rozdrobieniu powoduje, że wydajność komórkowa przy użyciu mikrokuleczek z fibroblastami związanymi z guzem jest zbyt niska, aby ustanowić hodowlę. W innych przypadkach, gdy czas i temperatura inkubacji z mikrokuleczkami nie są ściśle przestrzegane, może dojść do nieswoistego wiązania. W takich sytuacjach etapy wzbogacania były mniej wydajne, a wraz z CAF CD90.2+ odzyskano wyższy procent komórek CD90.2- CD45+ oraz CD90.2- CD45- (odpowiednio 5,97 ± 1,5 i 16,75 ± 1,1) (Rycina 4 i Tabela 3). Komórki zanieczyszczające te prawdopodobnie odpowiadały za obecność w hodowli małych klonów o innej morfologii (Rycina 4B, czarne groty strzałek), które rosły szybciej niż CAF i zdominowały pierwotną hodowlę CAF (Rycina 4C). Te suboptymalne wyniki potwierdziły znaczenie stałego sprawdzania ekspresji zarówno CD90.2, jak i CD45, a także morfologii komórek na koniec procesu wzbogacania oraz podczas wzrostu komórek w hodowli.
Wykorzystanie wyizolowanych komórek do oceny potencjału nanoleków inżynieryjnych w celowaniu w CAF 
Świeżo wyizolowane CAF mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, od badań podstawowych po badania farmakologiczne. Celem tej grupy jest opracowanie nanoklatek HFn, które mogą specyficznie celować w CAF. HFn funkcjonalizowano specyficznym fragmentem przeciwciała anty-FAP (HFn-FAP) przy dwóch różnych stosunkach białka do przeciwciała (niższym 1:1 oraz wyższym 1:5), a następnie przetestowano ich wiązanie z CAF. Ponieważ FAP służy jako biomarker powierzchniowy pro-tumorogennych CAF, kluczowe było sprawdzenie ekspresji FAP w wyizolowanych CAF (Rysunek 3C). Ekspresję FAP monitorowano przez 5 pasaży w hodowli, aby potwierdzić, że pierwotna hodowla CAF zachowała swoje pierwotne cechy.
Stwierdzono, że funkcjonalizacja HFn za pomocą FAP przyczynia się do znaczącego przesunięcia w stronę celowania w CAF w porównaniu do gołego HFn, a mniejsza ilość przeciwciał (1:1) była wystarczająca do zaobserwowania tego efektu (Rycina 5A). Nie zaobserwowano tego jednak w przypadku komórek guza 4T1 wykorzystanych do stworzenia modelu nowotworowego in vivo, w którym gołe HFn wykazały silniejsze wiązanie niż HFn funkcjonalizowane (Rycina 5B). Wynikało to najprawdopodobniej z braku nadekspresji FAP w komórkach 4T1 oraz preferencyjnej interakcji HFn z TfR1, który reguluje wychwyt HFn przez komórki, co było szeroko raportowane przez tę grupę27,33. Wyniki te potwierdzają użyteczność stosowania pierwotnych kultur CAF piersi do wstępnego przesiewu zdolności celowania nanocząsteczek zaprojektowanych do zwalczania mikrośrodowiska guza.
<img alt="Analiza wzrostu guza; Wykresy objętości, BLI; Obrazowanie luminescencyjne myszy w ciągu 30 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ustanowienie modelu guza 4T1. Komórki (105 komórek/mysz) wstrzyknięto do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. Wzrost guza monitorowano w dniach 5, 10, 15, 20, 25 i 30 po implantacji (A) poprzez pomiar objętości guza suwmiarką oraz (B) za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Objętości guza i BLI wyrażono odpowiednio w mm3 i liczbach impulsów (counts). Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM (n=6). (C) Reprezentatywne obrazy BLI uzyskane w dniach 5, 10, 15, 20, 25 i 30 po implantacji komórek potwierdzają wzrost guza do 25. dnia, kiedy wydaje się, że osiąga on plateau. W ostatnim punkcie czasowym analizy (30 dni) BLI nie wzrasta w porównaniu z 25. dniem. Od 20. dnia w centralnej części guza zaczynają pojawiać się obszary martwicy i owrzodzenia. Skala kolorów: Min = 1 194, Max = 20 462. Skróty: BLI = obrazowanie bioluminescencyjne; SEM = standardowy błąd średniej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment sortowania komórek; obejmuje przygotowanie próbek komórek, probówki do wirowania i wyniki cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przygotowanie próbek guza i charakterystyka cytometryczna wyizolowanych CAF. Guzy wycięto i rozdrobiono na (A) małe fragmenty o wielkości około 1–2 mm przy użyciu skalpela; (B) zawiesina pojedynczych komórek po trawieniu tkanki i mechanicznym rozbiciu wyciętego guza; (C) osad komórkowy otrzymany po lizie erytrocytów; (D) analiza cytometrii przepływowej ekspresji CD45 i CD90.2 w komórkach uzyskanych po usunięciu erytrocytów i martwych komórek, (E) po usunięciu fibroblastów niezwiązanych z nowotworem oraz (F) po wzbogaceniu o fibroblasty związane z nowotworem, gdzie większość komórek to CD90.2+ CD45- (niebieski prostokąt). Skróty: CAFs = fibroblasty związane z nowotworem; CD = cluster of differentiation; PE-A = obszar fikoerytryny; FITC-A = obszary izotiocyjanianu fluoresceiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza mikroskopowa komórek i cytometria przepływowa; obrazy mikroskopowe i histogram intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza morfologiczna CAFów oraz ekspresja FAP. (A, B) Morfologię CAF-ów sprawdzano podczas wszystkich pasaży hodowli za pomocą mikroskopii optycznej (różne stopnie konfluencji w pasażu 2 i pasażu 5) i porównano z (D) komórkami nowotworowymi 4T1; paski skali = 10 µm. (C) Ekspresję białka aktywacji fibroblastów (FAP) oceniano metodą cytometrii przepływowej na koniec procesu izolacji w zebranych komórkach CD90.2+ CD45-, aby potwierdzić ich charakterystykę molekularną. Próg fluorescencji ustawiono na niebarwionych komórkach kontrolnych (wykres czerwony), aby określić średnią intensywność fluorescencji oraz odsetek komórek pozytywnych (FAP+) wśród komórek barwionych przeciwciałami (wykres niebieski). Skróty: CAFs = fibroblasty związane z nowotworem; FAP = białko aktywacji fibroblastów; CD = cluster of differentiation; MFI = średnia intensywność fluorescencji; Ab = przeciwciało; FITC-A = obszar izotiocyjanianu fluoresceiny; FAP+ = komórki FAP-dodatnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej, obrazy mikroskopowe; analiza komórek, markery CD90/CD45, wykres kropkowy FITC-A vs PE-A." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykład suboptymalnego procesu izolacji CAF.** (A) Ocena cytometrią przepływową po końcowym etapie izolacji wykazała obecność zanieczyszczających komórek CD90.2- CD45+ oraz CD90.2- CD45-. (B) Komórki te są widoczne jako klony o małej, okrągłej morfologii po wysianiu (czarne groty strzałek i wstawka w lewym dolnym rogu panelu), które (C) przeważyły nad CAF po trzecim pasażu w hodowli. Paski skali = 10 µm. Skróty: CAF = fibroblast związany z nowotworem; CD = cluster of differentiation; PE-A = obszar phycoerytryny; FITC-A = obszary izotiocyjanianu fluoresceiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wiązanie CAF i 4T1 HFn-FAP vs HFn, przedstawiający wyniki różnicy krotności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62504/62504fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Wiązanie nanoklatek HFn na CAF i 4T1. Nanoklatki HFn zostały znakowane fluorescencyjnie FITC, funkcjonalizowane fragmentem przeciwciała anty-FAP (HFn-FAP) przy dwóch różnych stosunkach białko-przeciwciało (1:1 i 1:5) i inkubowane z (A) docelowymi CAF oraz (B) komórkami 4T1 w temperaturze 4 °C przez 2 h. Wiązanie oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Wiązanie HFn-FAP z CAF jest znacząco zwiększone przy obu stężeniach fragmentu przeciwciała, wykazując trzykrotny wzrost w porównaniu do gołego HFn. (B) W przeciwieństwie do tego, w komórkach 4T1 zaobserwowano znacząco wyższe wiązanie gołego HFn, gdzie wiązanie nie jest wzmocnione przez rozpoznawanie FAP. Wyniki przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe z trzech niezależnych eksperymentów. *** p = 0.0003; °° p = 0.0021 ; °°° p = 0.0008. Skróty: CAF = fibroblasty związane z nowotworem; FAP = białko aktywacji fibroblastów; HFn = rekombinowany wariant ciężkiego łańcucha ludzkiej ferrytyny stosowany jako goła nanocząsteczka lub koniugat; HFN-FAP = nanocząsteczki HFn funkcjonalizowane częścią zmienną przeciwciała anty-FAP, przygotowane w dwóch molowych stosunkach HFn:Fab@FAP, 1:1 i 1:5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62504/62504fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Liczba komórek (średnia ± SD)</td>
			<td>Całkowita wydajność ekstrakcji (na pasaż)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wycięty guz (po usunięciu erytrocytów)</td>
			<td>1,27 x 108 ± 9,81 x 107</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> Wycięty guz (po usunięciu martwych komórek)</td>
			<td>3,01 x 106 ± 9,61 x 105</td>
			<td>2.38%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koktajl po deplecji</td>
			<td>1,15 x 105 ± 4,95 x 104</td>
			<td>0.11% (3.82%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Po wzbogaceniu</td>
			<td>3,00 x 104 ± 1,2 x 104</td>
			<td>0.027% (26.09%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Całkowita liczba komórek po każdym etapie izolacji fibroblastów związanych z nowotworem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rozkład komórek (%)</td>
			<td>CD90.2+ CD45-</td>
			<td>CD90.2+ CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45+</td>
			<td>CD90.2- CD45-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wycięty guz (po usunięciu martwych komórek)</td>
			<td>1.81 ± 0.98</td>
			<td>10.78 ± 4.51</td>
			<td>56.57 ± 14.05</td>
			<td>28.20 ± 17.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koktajl po wyczerpaniu</td>
			<td>69.33 ± 16.75</td>
			<td>0.14 ± 0.13</td>
			<td>0.55 ± 0.63</td>
			<td>39.89 ± 30.31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Po wzbogaceniu</td>
			<td>93.14 ± 3.3</td>
			<td>0.09  ± 0.1</td>
			<td> 0.09 ± 0.08</td>
			<td>6.69 ± 3.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Rozkład komórek według ekspresji CD90.2 i CD45 po każdym pasażu izolacji fibroblastów związanych z rakiem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Rozkład komórek (%)</td>
			<td >CD90.2+ CD45-</td>
			<td >CD90.2+ CD45+</td>
			<td >CD90.2- CD45+</td>
			<td >CD90.2- CD45-</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Po wzbogaceniu (bez łączenia próbek)</td>
			<td >75.80 ± 2.9</td>
			<td >1.49 ± 0.4 </td >
			<td >5.97 ± 1.5</td>
			<td >16.75 ± 1.1</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 3: Ekspresja CD90.2 i CD45 komórek zebranych po suboptymalnym eksperymencie izolacji fibroblastów związanych z nowotworem.

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

Protokół ten umożliwia pomyślne wyizolowanie i hodowlę pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z raka piersi Murin w celu przeprowadzenia badań przesiewowych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza. Pierwotne CAF stanowią najbardziej wiarygodny i fizjologiczny model do badań in vitro zrębu guza. W tym protokole opisujemy, jak osiągnąć optymalną wydajność.Na początek przygotuj mieszankę trawiącą do dysocjacji guza i namocz od trzech do pięciu milimetrowych fragmentów guza w roztworze po szczelnym zamknięciu probówki. Odwróć rurkę do góry nogami, sprawdzając, czy wszystkie kawałki guza znajdują się na dnie rurki w kierunku nasadki. Następnie podłącz rurkę do dysocjatora mechanicznego w odpowiedniej obudowie i uruchom program dysocjacji specjalnie zaprojektowany dla trudnych guzów.Po serii odłącz probówkę i umieść ją do góry nogami, aby inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, delikatnie wstrząsając. Następnie ponownie podłącz rurkę do dysocjatora w odpowiedniej obudowie i dwukrotnie uruchom program dysocjacji dla trudnych guzów, upewniając się, że pod koniec procedury nie pozostały żadne duże kawałki tkanki. Przefiltruj próbkę przez sitko o średnicy 40 mikronów w probówce o pojemności 50 mililitrów.Następnie umyj filtr 10 mililitrami pożywki RPMI 1640 i odwiruj. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad w buforze PBE, składającym się z PBS, 0,5% BSA i dwóch milimolowych EDTA, a następnie policz komórki za pomocą błękitu trypanowego. Napraw bufor wiążący do usuwania martwych komórek, rozcieńczając 20-krotny roztwór podstawowy buforu wiążącego sterylną wodą podwójnie destylowaną.Przemyć komórki pięcioma mililitrami buforu wiążącego 1X i wirówką. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy z 0,1 mililitra mikrogranulek do usuwania martwych komórek do 10 do siódmych komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Podczas inkubacji przygotuj stojak magnetyczny pod maską i zawieś na nim ferromagnetyczne kolumny separacyjne, końcówkami skierowanymi w dół.Zrównoważyć kolumny 0,5 mililitra zimnego buforu wiążącego i poczekać, aż roztwór przepłynie. Po inkubacji dodać 400 mikrolitrów zimnego buforu wiążącego do zawiesiny kulki i komórek. Załaduj całą objętość na kolumnę i zbierz ścieki do 15-mililitrowej probówki.Przemyć kolumnę czterokrotnie 0,5 mililitra zimnego buforu wiążącego i zebrać cały ściek w tej samej probówce. W celu wyczerpania fibroblastów niezwiązanych z rakiem, przefiltruj zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek o średnicy 70 mikronów zwilżonego PBS i odwiruj komórki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach zimnego bufora PBE.Dodaj 20 mikrolitrów koktajlu zubożającego fibroblasty niezwiązanego z nowotworem. Dobrze wymieszaj i inkubuj próbkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności. Podczas inkubacji z kulkami przygotuj ferromagnetyczne kolumny zubożające na stojaku magnetycznym.Zrównoważ kolumny dwoma mililitrami zimnego buforu PBE i poczekaj, aż roztwór przepłynie. Po inkubacji dodać 400 mikrolitrów buforu do zawiesiny kulki i komórek. Załaduj całą objętość na kolumnę i zbierz ścieki do 15-mililitrowej probówki.Przemyć kolumnę dwukrotnie dwoma mililitrami PBE. Zbierz wszystkie ścieki do tej samej probówki i odwiruj ścieki. W celu pozytywnej selekcji fibroblastów związanych z rakiem, ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach zimnego buforu PBE.Następnie w 20 mikrolitrach mikrogranulek fibroblastów związanych z nowotworem i inkubować próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności. Podczas inkubacji należy przygotować ferromagnetyczne kolumny separacyjne na stojaku magnetycznym i zrównoważyć je z 0,5 mililitra zimnego bufora PBE. Po inkubacji dodać 400 mikrolitrów PBE do zawiesiny kulki i komórek.Załaduj całą objętość na kolumnę i pozwól, aby nieoznakowane komórki przepłynęły do 15-mililitrowej probówki. Umyj kolumnę trzykrotnie 0,5 mililitra buforu PBE i zbierz całkowite ścieki w tej samej rurce. Zdejmij kolumnę z magnesu i umieść ją w tubie o pojemności 1,5 mililitra.Dodaj jeden mililitr PBE do kolumny i natychmiast wciśnij tłok do kolumny, aby wypłukać komórki. Po odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości DMEM i wysiać komórki na płytce do hodowli tkankowej. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem i umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby komórki przylegały i rosły.Wstrzyknięcie komórek lucyferazy 4T1 do poduszeczki tłuszczowej sutka samic myszy doprowadziło do wzrostu wykrywalnej masy guza pięć dni po implantacji. Aby znaleźć okno ofiary, które jest odpowiednie do izolacji CAF, poszukiwano optymalnego kompromisu między większą wielkością guza i obrazowaniem bioluminescencyjnym z jednej strony, a pojawiającym się owrzodzeniem i martwicą guza z drugiej. Dzień 20 został ustalony jako punkt czasowy optymalizacji regeneracji komórek po procesie izolacji.Potrzebne były jeszcze dwa pasaże, aby wyizolować populację CAF z panelu zebranych żywotnych komórek, zubożenie fibroblastów niezwiązanych z nowotworem i wzbogacenie fibroblastów związanych z nowotworem. Komórki CAF wykazywały dużą morfologię w kształcie wrzeciona, typową dla fibroblastów, i różniły się od komórek nowotworowych 4T1. Ekspresja FAP obserwowana w pięciu fragmentach potwierdza, że pierwotna hodowla CAF zachowała swoje pierwotne cechy.Gdy czas trwania i temperatura inkubacji z mikrogranulkami nie były utrzymane, wśród izolowanych kultur znaleziono klony o różnej morfologii. Te zanieczyszczone komórki rosły szybciej i przeważały nad pierwotną hodowlą CAF. Wiązanie CAF z ludzkim ferrytynowym nanolekiem funkcjonalizowanym ferrytyną Hfn-FAP wzrosło trzykrotnie przy stężeniach fragmentów przeciwciał jeden do jednego i od jednego do pięciu w porównaniu z gołym HFN.Wręcz przeciwnie, w przypadku komórek nowotworowych 4T1 nagi HFN wykazywał silniejsze wiązanie niż funkcjonalizowany HFN. Aby zwiększyć zanieczyszczenie plonów izolowanego CAF, utrzymuj w niskiej temperaturze, przestrzegaj czasu inkubacji z kulkami i wyciągnij do czterech guzów na kolumnę przed ostatnim etapem wzbogacania. Wyizolowane CAF mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych kilku potencjalnych nanoleków pod względem wiązania, wychwytu i skuteczności farmakologicznej przed przystąpieniem do przedklinicznych eksperymentów in vivo.Izolacja CAF pozwoliła nam sprawdzić, czy nanocząstki mogą być wykorzystane do celowania w mikrośrodowisko guza. W ten sposób toruje się drogę do nowych terapii celowanych działających w synergii z chemioterapią.

isolation-primary-cancer-associated-fibroblasts-from-syngeneic-murine

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Celem tego protokołu jest badanie nowotworów piersi. Dzięki tej technice guzy sutka myszy są usuwane, a komórki pierwotne są przygotowywane z guzów. Dołączony jest protokół ekstrakcji płuc do badania przerzutów do płuc. Ponadto dołączono inny protokół analizy fibroblastów embrionalnych myszy z zarodka myszy.

Guz pierwotny i izolacja komórek MEF w celu zbadania przerzutów do płuc

Neutrofile odgrywają ważną rolę nie tylko w obronie gospodarza przed atakującymi mikroorganizmami, ale są również zaangażowane w immunologiczny nadzór nad komórkami nowotworowymi. W tym miejscu opisano techniki związane z izolacją neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych oraz metody monitorowania funkcji przeciwnowotworowych neutrofili in vitro i in vivo.

Izolacja i charakterystyka neutrofili o właściwościach przeciwnowotworowych

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Wprowadzamy mysi ortotopowy model raka piersi i model radykalnej mastektomii z technologią bioluminescencji, aby określić ilościowo obciążenie guza, aby naśladować postęp ludzkiego raka piersi.

Generowanie mysiego ortotopowego modelu raka piersi z przerzutami i wykonywanie radykalnej mastektomii u myszy

Dostępny jest protokół jednoczesnego wstrzykiwania komórek rakowych i fibroblastów oraz monitorowania wzrostu guza w czasie. Protokół ten można wykorzystać do zrozumienia molekularnych podstaw roli fibroblastów jako regulatorów wzrostu guza.

Mysi model do badania roli fibroblastów związanych z rakiem we wzroście guza

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Protokół ten przedstawia metody hodowli, manipulowania i analizowania mysich CAF, w tym testy funkcjonalne in vitro/in vivo , transkryptomikę i analizę obliczeniową. Ponadto opisano w nim platformę internetową opracowaną w celu analizy publicznie dostępnych transkryptomów mikrowypreparowanych składników zrębu i nabłonka z kolekcji ludzkich nowotworów raka piersi.

Fibroblasty związane z rakiem z guzów sutka myszy jako narzędzia do badań molekularnych i obliczeniowych

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Poznaj izolację pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z myszego modelu raka piersi. Ta metoda umożliwia badanie celowanych nanocząstek w mikrośrodowisku nowotworowym.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Przeglądaj więcej filmów