Name: Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę hodowli megakariocytów w hydrożelu metylocelulozy 3D, która poprawia dojrzewanie komórek i umożliwia badanie wpływu sztywności oraz uwięzienia mechanicznego na ich różnicowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fabienowi Pertuy i Alicii Aguilar, którzy początkowo opracowali tę technikę w laboratorium, a także Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg), którzy scharakteryzowali lepkosprężyste właściwości hydrożelu metylocelulozowego. Prace te były wspierane przez ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) oraz przez grant ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher jest stypendystką Fondation pour la Recherche Médicale (stypendium FRM nr FDT202012010422).

<ol><li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
<li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li>
<li>Shin, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li>
<li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+platelet+formation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li>
<li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li>
<li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin+from+beginning+to+end%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li>
<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatniej dekadzie mechanobiologia budziła coraz większe zainteresowanie w wielu dziedzinach biologii. Obecnie powszechnie uznaje się, że środowisko mechaniczne otaczające komórki odgrywa rolę w ich zachowaniu, co podkreśla znaczenie badania, w jaki sposób megakariocyty wyczuwają i reagują na zewnątrzkomórkowe sygnały mechaniczne. Dokładne zmierzenie sztywności tkanki szpiku kostnego in situ11 jest trudne, zwłaszcza jeśli weźmiemy pod uwagę krwiotwórczy szpik czerwony, ponieważ znajduje...

Komórki w ciele doświadczają złożonego mikrośrodowiska 3D i są poddawane wzajemnemu oddziaływaniu między chemicznymi i mechanofizycznymi sygnałami, w tym sztywnością tkanki i uwięzieniem przez sąsiednie komórki i otaczającą matrycę 1,2,3. Znaczenie sztywności i uwięzienia dla zachowania komórek zostało dostrzeżone dopiero w ostatnich dziesięcioleciach. W 2006 roku przełomowa praca Englera i in. 4 podkreśliła znaczenie środowiska mechanicznego dla różnicowania komórek. Autorzy wykazali, że zmienność sztywności substratów komórkowych skutkowała orientacją komórek macierzystych w kierunku różnych linii różnicowania. Od tego czasu wpływ sygnałów mechanicznych na los i zachowanie komórek staje się coraz bardziej znany i badany. Pomimo tego, że jest to jedna z najmiększych tkanek organizmu, szpik kostny ma organizację strukturalną 3D, która jest zamknięta wewnątrz kości. Sztywność szpiku, choć technicznie trudna do precyzyjnego zmierzenia, szacuje się na 15 do 300 Pa 5, 6. W zrębie komórki są ściśle ze sobą połączone. Ponadto większość z nich migruje w kierunku naczyń sinusoidalnych, aby dostać się do krążenia krwi. Warunki te stwarzają dodatkowe ograniczenia mechaniczne dla sąsiednich komórek, które muszą dostosować się do tych sił. Sygnały mechaniczne stanowią ważny parametr, którego wpływ na różnicowanie megakariocytów i tworzenie propłytek krwi został niedawno zbadany. Chociaż megakariocyty mogą różnicować się in vitro w tradycyjnej hodowli płynnej, nie osiągają stopnia dojrzałości obserwowanego in vivo, częściowo z powodu braku mechanicznych wskazówek ze środowiska 3D 7. Rosnące przodki osadzone w hydrożelu przynoszą mechaniczne wskazówki 3D, których brakuje w środowisku płynnym.
Hydrożele są szeroko stosowane od kilkudziesięciu lat w dziedzinie hematologii, zwłaszcza do hodowli komórek w testach tworzenia kolonii w celu ilościowego określenia komórek progenitorowych hematopoetycznych. Jednak takie hydrożele rzadko były używane do badania biologicznego wpływu środowiska mechanicznego 3D na dojrzewanie i różnicowanie komórek krwiotwórczych. W ciągu ostatnich kilku lat nasze laboratorium opracowało model hodowli 3D przy użyciu hydrożelu na bazie metylocelulozy 8. Ten niereaktywny żel fizyczny jest użytecznym narzędziem do naśladowania fizycznych ograniczeń natywnego środowiska megakariocytów. Otrzymuje się go z celulozy przez zastąpienie reszt hydroksylowych (-OH) grupami metoksydowymi (-OCH3). Zarówno stopień podstawienia metylu, jak i stężenie metylocelulozy decydują o sztywności hydrożelu po jego galaretowatości. Na etapie rozwoju tej techniki wykazano, że moduł Younga w zakresie od 30 do 60 Pa jest optymalną sztywnością żelu dla wzrostu megakariocytów 9.
Poniższy protokół opisuje metodę hodowli mysich megakariocytarnych progenitorów w hydrożelu metylocelulozowym 3D. Wcześniej wykazano, że w porównaniu ze standardową hodowlą płynną, ta hodowla hydrożelu zwiększa stopień poliploidyzacji megakariocytów, poprawia dojrzewanie i organizację wewnątrzkomórkową oraz zwiększa zdolność megakariocytów do wydłużania propłytek po ponownym zawieszeniu w płynnym podłożu <klasa sup = "xref">9. W niniejszym manuskrypcie szczegółowo opisano protokół izolacji komórek Lin szpiku kostnego myszy i ich osadzania w hydrożelu metylocelulozy do hodowli 3D, a także ilościowe określenie ich zdolności do wytwarzania propłytek i odzyskiwania komórek do dalszych analiz.

<table><tbody><tr><td>Igły o rozmiarze 18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>Igły o rozmiarze 21</td> Igły o rozmiarze <td>23 mm BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>Neeldes o rozmiarze 25 Naczynia</td> 4-dołkowe <td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific 144444</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+05S1</td><td></td></tr><tr><td>Cytoclips</td><td>Microm Microtech</td><td>F/CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Cytofunnels wyposażone w karty filtracyjne</td><td>Microm Microtech</td><td>F/JC304</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka cytospinowa</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>Sterylne Dulbecco' s buforowane fosforanami sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>Magnesy EasySep</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19856A</td><td>biotynylowane przeciwciała (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash; 4) i kulki magnetyczne pokryte streptawidyną</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Opieka zdrowotna Life Science</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki Luer lock 1 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>lub 309628 strzykawki od BD MEDICAL</td></tr><tr><td>Strzykawki Luer lock łączniki</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC 3%</td><td>R& Amp; Systemy D</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice powlekane polilizyną</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 &mu; g/ml streptomycyny i 29,2 mg/ml glutaminy</td></tr><tr><td>Surowica szczura</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana hirudyna</td><td>Transg&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka trombopoetyna (rhTPO)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>2822</td><td>10 000 jednostek/ml</td></tr><tr><td>Okrągłe dno 10 ml probówki z tworzywa sztucznego</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Rurki</td><td></td><td></td><td></td> polistyrenowe o okrągłym dnie 5 ml</tr></tbody></table>

hodowla megakariocytów w hydrożelu 3d na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Środowisko 3D prowadzące zarówno do zamknięcia, jak i ograniczeń mechanicznych jest coraz częściej uznawane za ważny czynnik determinujący hodowlę behavior. 3D komórek, dlatego opracowano go, aby lepiej podejść do sytuacji in vivo. Megakariocyty różnicują się z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w szpiku kostnym (BM). BM jest jedną z najmiększych tkanek ciała, ograniczoną wewnątrz kości. Ponieważ kość jest słabo rozciągliwa w skali komórkowej, megakariocyty są jednocześnie poddawane słabej sztywności i wysokiemu zamknięciu. Protokół ten przedstawia metodę odzyskiwania HSPC z ujemną linią myszy (Lin-) poprzez sortowanie immunomagnetyczne i różnicowanie ich w dojrzałe megakariocyty w pożywce 3D złożonej z metylocelulozy. Metyloceluloza nie reaguje na megakariocyty, a jej sztywność można dostosować do sztywności normalnego szpiku kostnego lub zwiększyć, aby naśladować patologiczny szpik zwłóknieniowy. Proces odzyskiwania megakariocytów do dalszych analiz komórkowych jest również szczegółowo opisany w protokole. Chociaż wydłużanie się płytek krwi jest zapobiegane w środowisku 3D, poniżej opisano, jak ponownie zawiesić megakariocyty w płynnym podłożu i określić ilościowo ich zdolność do wydłużania propłytek. Megakariocyty hodowane w hydrożelu 3D mają większą zdolność do tworzenia propłytek krwi w porównaniu z tymi hodowanymi w środowisku płynnym. Ta hodowla 3D pozwala i) różnicować progenitorów w kierunku megakariocytów osiągających wyższy stan dojrzewania, ii) podsumować fenotypy, które można zaobserwować in vivo, ale pozostają niezauważone w klasycznych kulturach płynnych, oraz iii) badać szlaki transdukcji indukowane przez mechaniczne sygnały dostarczane przez środowisko 3D.

Dane uzyskane przy użyciu tego protokołu zostały pierwotnie opublikowane w czasopiśmie Blood w 2016 roku9.
Zgodnie z protokołem, komórki zasiano w medium płynnym lub w hydrożelu metylocelulozowym. Komórki w medium płynnym osiadły na dnie dołka, w kontakcie ze sztywną plastikową powierzchnią, a niekiedy także z innymi komórkami. W przeciwieństwie do nich, komórki zatopione w hydrożelu metylocelulozowym są rozmieszczone w żelu jednorodnie i są odizolowane od sąsiednich ko...

Teraz uznaje się, że trójwymiarowe środowisko komórek może odgrywać ważną rolę w ich zachowaniu, dojrzewaniu i/lub różnicowaniu. Protokół ten opisuje trójwymiarowy model hodowli komórkowej przeznaczony do badania wpływu fizycznego zamknięcia i ograniczeń mechanicznych na megakariocyty.

Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Protokół ten pozwala na ocenę in vitro wpływu uwięzienia i średniej sztywności, na które narażone są natywne megakariocyty w szpiku kostnym, na ich zachowanie i dojrzewanie. Główną zaletą tej techniki jest uproszczony model, który eliminuje interakcje komórka-komórka i macierz komórkowa i skupia się na aspektach mechanicznych. Należy ściśle przestrzegać dobrej praktyki laboratoryjnej i sterylnych warunków pracy.Rzeczywiście, nawet niewielkie zanieczyszczenie hydrożelu może mieć dramatyczny wpływ na różnicowanie megakariocytów. Aby uzyskać pojedynczą studzienkę hodowli komórek hydrożelowych, zacznij od rozmrożenia dwóch jednomililitrowych podwielokrotności 3% metylocelulozy w temperaturze pokojowej, a następnie pokryj jednomililitrową strzykawkę Luer lock metylocelulozą, najpierw pobierając jeden mililitr, a następnie wydalając go całą. Następnie, za pomocą tej samej strzykawki i igły, pobierz 333 mikrolitry metylocelulozy ze świeżej porcji.Po ostrożnym wyjęciu igły za pomocą wysterylizowanych kleszczyków przykręcić łącznik Luer lock do końca strzykawki, a następnie przymocować do łącznika drugą niepowlekaną strzykawkę Luer lock o pojemności jednego mililitra. Równomiernie rozprowadzić metylocelulozę między dwiema strzykawkami i odłożyć je na bok. Następnie ponownie zawiesić wcześniej wyizolowane hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe linii myszy w skoncentrowanym pożywce hodowlanej o gęstości od jednego razy 10 do sześciu komórek na 167 mikrolitrów.Odłączyć jedną ze strzykawek od łącznika i odpipetować 167 mikrolitrów zawiesiny komórek bezpośrednio do łącznika, jednocześnie powoli pociągając tłok strzykawki, aby zrobić miejsce na zawiesinę ogniwa. Po dodaniu całej zawiesiny ogniw do łącznika, należy pociągnąć tłok dalej, aby wycofać zawiesinę ze złącza i ostrożnie ponownie podłączyć drugą strzykawkę, uważając, aby nie zgubić zawiesiny w gwincie. Aby homogenizować podłoże metylocelulozowe z zawiesiną komórek, należy powoli przesuwać tłoki w przód iw tył między dwiema strzykawkami 10 razy, a następnie pobrać całkowitą objętość do jednej strzykawki i odłączyć obie strzykawki, pozostawiając łącznik na pustej.Opróżnij zawartość strzykawki do jednego dołka czterodołkowej płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni w 5% dwutlenku węgla. Aby przeanalizować propłytki, w trzecim dniu hodowli ostrożnie przenieś wszystkie komórki z jednego dołka do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów DMEM z 1% PSG. Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując, aby całkowicie rozcieńczyć metylocelulozę, a następnie odwirować probówkę przez pięć minut w temperaturze 300 razy G w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze kompletnej pożywki hodowlanej i ponownie zasiać komórki w ilości 500 mikrolitrów na studzienkę czterodołkowej płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia, używając mikroskopu Brightfield z obiektywem 20X, losowo uzyskaj 10 obrazów na studzienkę, upewniając się, że nie ma zbyt wielu komórek w polu widzenia i przechwytując co najmniej pięć megakariocytów na pole.Korzystając z ImageJ, policz całkowitą liczbę megakariocytów i tych wydłużających propłytki na każdym obrazie, aby obliczyć odsetek megakariocytów wydłużających propłytki. Aby utrwalić komórki do przyszłych analiz, dodaj roztwór utrwalający na wierzch metylocelulozy, nie przerywając żelu. Po odczekaniu odpowiedniego czasu, w zależności od użytego utrwalacza, za pomocą pipety P1000 delikatnie odpipetować utrwalacz i żelować, aż metyloceluloza zostanie równomiernie rozcieńczona.Używając tej samej końcówki pipety, przenieś całą zawartość studzienki do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów DPBS i homogenizuj przez mieszanie. Odwirować mieszaninę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad megakariocytów w pożywce odpowiedniej do pożądanej analizy.Do trzeciego dnia hodowli megakariocyty w płynnym podłożu osadzają się na dnie studni i stykają się ze sztywną powierzchnią z tworzywa sztucznego, a także z innymi komórkami. Natomiast komórki osadzone w hydrożelu metylocelulozowym są jednorodnie rozmieszczone i odizolowane od sąsiednich komórek. Analiza średniej średnicy megakariocytów w różnych warunkach hodowli pokazuje, że 2% metylocelulozy nieznacznie zwiększa średnią średnicę megakariocytów w porównaniu z kulturą płynną.Jednak zwiększenie stężenia metylocelulozy o 0,5% upośledza różnicowanie megakariocytów, na co wskazuje mniejsza średnia średnica. Na reprezentatywnych obrazach transmisyjnej mikroskopii elektronowej błony wewnątrzcytoplazmatyczne w megakariocytach zróżnicowanych in vivo w szpiku kostnym wydają się być ściśle przeciwstawne do wyznaczonych obszarów cytoplazmatycznych. W hodowli płynnej błony mają przeważnie mały okrągły owalny wygląd lub wydłużone pęcherzyki bez rozgraniczenia terytoriów cytoplazmatycznych.Natomiast kultura 2% metylocelulozy ma ściśle przeciwstawne błony z graniczącymi terytoriami cytoplazmatycznymi przypominającymi strukturę in situ. W czwartym dniu hodowli megakariocyty wcześniej hodowane w hydrożelu wykazują zwiększone tworzenie propłytek krwi w porównaniu z tymi hodowanymi w płynnym podłożu. Średni odsetek propłytek wydłużających megakariocyty wynosi zwykle około 15 do 20% w przypadku płynnej hodowli wstępnej w porównaniu do 35 do 40% w przypadku wstępnej hodowli hydrożelu metylocelulozowego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby bardzo precyzyjnie pipetować odpowiednie objętości, ponieważ niewielka zmiana końcowego stężenia metylocelulozy może znacznie zmienić sztywność podłoża. Po dojrzewaniu komórek w hydrożelu, megakariocyty można odzyskać do analizy ploidalności i markerów komórkowych za pomocą cytometrii przepływowej lub utrwalić do mikroskopii elektronowej lub barwienia immunologicznego białka będącego przedmiotem zainteresowania.

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Ten protokół opisuje wytwarzanie 3D konstrukcji kostnych z wykorzystaniem ludzkich osteocytów osadzanych w żelach metacrylanowych żelatyny (GelMA) uzupełnionych o decelularyzowaną macierz pozakomórkową. Metoda ta jest nisko kosztowa, skalowalna i kompatybilna z podstawowym sprzętem laboratoryjnym, zapewniając platformę translacyjną do badania procesów chorobowych układu mięśniowo-szkieletowego.

Platforma hodowli kości 3D z wykorzystaniem ludzkich osteocytów i decellularyzowanej macierzy pozakomórkowej do modelowania chorób układu mięśniowo-szkieletowego

Poznaj metodę hodowli megakariocytów w hydrożelu metylocelulozy 3D, która poprawia dojrzewanie komórek i umożliwia badanie wpływu sztywności oraz uwięzienia mechanicznego na ich różnicowanie.

Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia (Wideo) | JoVE Journal

Hodowla megakariocytów w hydrożelu 3D na bazie metylocelulozy w celu poprawy dojrzewania komórek i zbadania wpływu sztywności i uwięzienia

Przeglądaj więcej filmów