Name: Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Poznaj kompleksowy protokół FASP z analizą DIA do mapowania proteomu moczu EPS w badaniach biomarkerów raka prostaty. Metoda zapewnia głębokie pokrycie proteomu i wysoką czułość.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 do MG) oraz przez POR Calabria FESR 2014-2020, działanie 1.2.2, "INNOPROST".

Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyczną Uniwersytetu Magna Graecia w Catanzaro, RP 41/2018. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów włączonych do badania.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Próbki moczu EPS odwirować w ciągu 2 godzin od pobrania przy 2 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Rozmrażanie próbki
<ol>
	<li>Przenieść próbkę z temperatury -80 °C do -20 °C na dzień przed mineralizacją.</li>
	<li>Przed przetworzeniem próbki należy przenieść próbkę przez 15–20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynnika do FASP
<ol>
	<li>Tego samego dnia należy przygotować następujące roztwory: bufor mocznikowy, 50 mM jodoacetamidu (IAA) w buforze mocznikowym, 50 mM wodorowęglan trietyloamonu i 500 mM ditiotreitol (DTT).</li>
	<li>Przygotować bufor mocznikowy (mocznik 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): dla 10 ml odważyć 4 800 mg mocznika i rozpuścić go w odpowiedniej ilości wody HPLC po dodaniu 1 ml 1 M Tris pH 8. Na każdą próbkę potrzebna jest objętość 800 μl mocznika.</li>
	<li>Przygotować 500 mM ditiotreitolu (DTT): rozpuścić 38,5 mg DTT w 500 μl wody HPLC. Na każdą próbkę potrzeba 66,7 μl naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
	<li>Przygotować 50 mM IAA w buforze mocznikowym: rozpuścić 9,25 mg IAA w 1 ml buforu mocznikowego. Na każdą próbkę potrzeba 50 μl IAA.</li>
	<li>Przygotować 50 mM wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB). Dodać 150 μl 1 M TEAB do 2,85 ml wody HPLC. Na każdą próbkę potrzeba 460 μl TEAB.</li>
	<li>Przygotować roztwór trypsyny (100 ng/μl) w wodzie HPLC. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrozić bezpośrednio przed użyciem. Na każdą próbkę potrzebne są 2 μl (200 ng).</li>
</ol>
4. Trawienie białka przez FASP
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 500 μl każdej próbki moczu EPS 66,7 μl 10% (w/v) dodecylosiarczanu sodu (SDS), 66,7 μl 500 mM DTT i 33,3 μl 1 M Tris pH 8 w celu rozpuszczenia białek i zmniejszenia wiązań dwusiarczkowych. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 95 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Dodać 300 μl rozcieńczonej próbki moczu EPS na jednostkę filtrującą (10 kDa) i odwirować przy 14 000 x g przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu mocznikowego do filtra i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut. Powtórz ten krok, a następnie odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu IAA i odwirować przy 6 000 x g przez 25 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu mocznikowego i odwirować przy 14 000 x g przez 20 minut. Powtórz ten krok, a następnie odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 200 μl 50 mM buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB) i odwirować przy 14 000 x g przez 20 minut. Powtórz ten krok.</li>
	<li>Przenieś jednostkę filtrującą do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Dodać 60 μl 50 mM buforu TEAB i 200 ng trypsyny i inkubować próbkę w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 °C przez noc. 
	UWAGA: Aby uniknąć parowania próbki podczas inkubacji przez noc, należy owinąć każdą jednostkę filtrującą warstwą folii aluminiowej, a następnie warstwą parafilmu.</li>
	<li>Po inkubacji trypsyny dodać 140 μl wody i odwirować fiolkę o sile 14 000 x g przez 25 minut, aby zebrać objętość trawienia (180-200 μl).</li>
</ol>
5. Przygotowanie odczynnika do oczyszczania SCX
<ol>
	<li>Przygotuj 1 ml wash1 (0,5% kwasu mrówkowego (FA) i 20% acetonitrylu (ACN)) w następujący sposób: dodać 50 μl 10% FA i 200 μL 100% ACN do 750 μL wody HLPC. Na każdą próbkę potrzeba 100 μl roztworu do płukania 1</li>.
	<li>Przygotować 1,5 ml roztworu do płukania 2 (0,5% FA i 80% ACN) w następujący sposób: dodać 75 μl 10% FA i 1,2 ml 100% ACN do 225 μl wody HPLC. Na każdą próbkę potrzeba 190 μl roztworu do płukania 2</li>.
	<li>Przygotować 100 μl roztworu eluującego (500 mM octanu amonu (AA) i 20% ACN): dodać 25 μL 2 M AA i 20 μL 100% ACN do 55 μL wody HPLC.</li>
	<li>Przygotuj etykietki etapu w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Zapakuj końcówkę pipety o pojemności 200 μl warstwą żywicy SCX za pomocą tępo zakończonej igły strzykawkowej (rys. 16). Włóż końcówkę StageTip do pokrywy mikrowirówki, która została wcześniej przebita w celu umieszczenia mikrokolumny.</li>
		<li>Załóż pokrywkę na mikrowirówkę o pojemności 2 ml, z której usunięto oryginalną pokrywkę. Właśnie zmontowane urządzenie odśrodkowe micro-SPE powinno pasować do wirówki stołowej. Ponieważ perforowane pokrywki są żmudne w przygotowaniu, można je używać wielokrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Oczyszczanie SCX
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 30 μl każdej próbki do 120 μl, stosując przemywanie 2.</li>
	<li>Kondycjonować końcówkę StageTip, dodając 50 μl roztworu do płukania 1 na wierzch żywicy ekstrakcyjnej i odwirowywać przy 400 x g przez 2 minuty. Ponieważ opór przepływu zależy od tego, jak mocno żywica ekstrakcyjna została upakowana w końcówce pipety, może być konieczne dostosowanie prędkości wirówki w celu uzyskania natężenia przepływu 20-30 μl/min. Staraj się nie pozostawiać końcówki suchej podczas ładowania i mycia próbki.</li>
	<li>Zrównoważyć końcówkę StageTip z 50 μl roztworu do płukania 2 i odwirować przy 400 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Załadować rozcieńczoną próbkę (120 μl) przy niższej prędkości wirowania.</li>
	<li>Przemyj końcówkę StageTip 50 μl roztworu do płukania 2 i odwiruj przy 400 x g przez 2 minuty. Powtórzyć z 50 μl prania 1, 
	UWAGA: Po tym umyciu żywica musi być całkowicie sucha.</li>
	<li>Mieszaninę peptydów elutu eluować za pomocą 7 μl roztworu eluatu (500 mM octanu amonu (AA) i 20% ACN) powoli, używając mniejszej prędkości wirowania.</li>
	<li>Dodać 27 μl 0,1% FA w celu rozcieńczenia AA i otrzymania próbki do wstępnego wstrzyknięcia LC-MS/MS. Końcowe rozcieńczenie do 34 μl spowoduje uzyskanie stosunku objętościowego 1:1 między moczem a roztworem peptydu (1 μl oczyszczonego trawienia będzie odpowiadał 1 μl oryginalnej próbki moczu).</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja białka za pomocą zewnętrznego wzorca za pomocą analizy DDA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Oznaczyć ilość białka w próbkach, wstrzykując 2 μl powstałego trawienia peptydów do LC-MS/MS i interpolując otrzymaną całkowitą powierzchnię peptydu za pomocą krzywej kalibracyjnej zbudowanej w następujący sposób:</li>
	<li>Przygotuj pięć różnych roztworów trawiących HeLa (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) przy użyciu wywaru do trawienia HeLa (100 μg/μL).</li>
	<li>Wstrzyknąć każdy roztwór Hela po dwa razy (2 μl).</li>
	<li>Ustawić metodę LC-MS/MS.
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 2 μl pięciu mieszanin peptydów HeLa i oddzielić peptydy przez gradient liniowy 75 minut przy natężeniu przepływu 230 nL/minutę na 15-centymetrową kolumnę o średnicy wewnętrznej 75 μm wypełnioną cząstkami krzemionki C18 o wielkości 3 μm. Użyj gradientu binarnego utworzonego przez fazę ruchomą A (0,1% FA, 2% ACN) i fazę ruchomą B (0,1% FA i 80% ACN).</li>
		<li>Przeprowadź elucję gradientową, zwiększając zawartość ruchomej fazy B z 6% do 42% w ciągu 60 minut i z 42% do 100% w ciągu dodatkowych 8 minut. Utrzymuj przez 5 minut 100% B, a następnie wróć do 0% B w ciągu dwóch minut.</li>
		<li>Działaj w trybie DDA metodą top-12 i ustaw pełny zakres skanowania MS na 350-1800 m/z, rozdzielczość 70 000, cel ACG 1e6 i maksymalny czas wtrysku 50 ms. Ustaw okno masy dla izolacji jonów prekursorowych na 1,6 m/z, rozdzielczość 35 000, cel ACG 1e5, maksymalny czas wtrysku 120 ms, fragmentację HCD na poziomie 25 NCE (znormalizowana energia zderzenia) i wykluczenie dynamiczne 15 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj surowe pliki, używając Sequest jako wyszukiwarki i sekwencji białka HUMAN Uniprot Complete jako bazy danych. W prezentowanych tu eksperymentach baza danych została pobrana w marcu 2016 r. i zawierała 42 013 sekwencji.
	<ol>
		<li>Użyj następujących ustawień: tolerancja MS 15 ppm, tolerancja MS/MS 0,02 Da, trypsyna jako enzym, ustawiając dwa pominięte miejsca rozszczepienia. Ustaw karbamidometylację lizyny, seryny, treoniny, tyrozyny (+57.021) i utlenianie metionin jako modyfikacje dynamiczne, a karbamidometylację cystein (+57.021) jako modyfikacje statyczne. Użyj wskaźnika odcięcia fałszywego wykrywania (FDR) do identyfikacji peptydów i białek do 0,01 i odfiltruj za pomocą perkolatora.</li>
		<li>Oblicz powierzchnię piku dla wszystkich sygnałów peptydowych MS1. Oblicz całkowitą powierzchnię peptydów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl mieszanin peptydowych otrzymanych z próbek moczu EPS przy użyciu tej samej metody LC-MS/MS, która jest stosowana w przypadku próbek HeLa i przeanalizować surowy plik przy użyciu tych samych parametrów, które są używane do przetwarzania danych HeLa.</li>
	<li>Oblicz całkowitą intensywność sygnałów peptydowych, sumując wartości powierzchni wszystkich zidentyfikowanych peptydów i interpolując zewnętrzną krzywą wzorcową. Zapewni to akceptowalne oszacowanie ilości peptydów obecnych w trawieniu białka EPS z moczem.</li>
</ol>
8. Przygotowanie odczynnika do protokołu C18 StageTip
<ol>
	<li>Przygotować 500 μl roztworu A (0,1% kwas trifluorooctowy (TFA), 50% ACN): dodać 250 μl 100% ACN i 10 μL 5% TFA do 240 μl wody HPLC.</li>
	<li>Przygotować 2 ml roztworu B (0,1% TFA): dodać 40 μl 5% TFA do 1960 μl wody HPLC.</li>
	<li>Przygotować 100 μl roztworu eluującego (0,1% FA, 50% ACN): dodać 1 μL 10% FA i 50 μL 100% ACN do 49 μL wody HPLC.</li>
	<li>Przygotuj etykietki etapu zgodnie z wcześniejszym opisem. W takim przypadku stosuje się dyski ekstrakcyjne C18.</li>
</ol>
9. Protokół SCX/C18 StageTip
UWAGA: Oczyszczanie EPS-moczu za pomocą protokołu C18 StageTip w celu usunięcia soli.
<ol>
	<li>Rozpocząć od 2 μg peptydów (określonych ilościowo przez wstępne wstrzyknięcie). Rozcieńczyć roztwór trawiący 4-krotnie w przemyciu 2 SCX i postępować zgodnie z powyższym opisem (w punkcie "Oczyszczanie SCX"). Eluować mieszaninę peptydów za pomocą 7 μl roztworu eluatu (500 mM octanu amonu (AA) i 20% ACN) powoli, stosując niższą prędkość wirowania (5 μl/min natężenie przepływu).</li>
	<li>Zakwasić eluat SCX 150 μl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu uzyskania pH niższego niż 3 i stężenia rozpuszczalnika organicznego poniżej 5%.</li>
	<li>Kondycjonować końcówkę C18 StageTip w 50 μl roztworu A i wirować przy 400 x g przez 2 minuty. Zrównoważyć C18 StageTip z 50 μl roztworu B i odwirować przy 400 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Powoli załaduj próbkę na końcówkę stolika, używając mniejszej prędkości wirowania.</li>
	<li>Przepłukać C18 StageTip 50 μl roztworu B i odwirować.</li>
	<li>Powoli eluować mieszaninę peptydów za pomocą 10 μl roztworu elucyjnego, używając mniejszej prędkości wirowania.</li>
	<li>Suszyć eluat (10 μl) w temperaturze 30 °C w wirówce próżniowej przez 3 minuty. Dodać 47 μL 0,1% FA. Oczekiwane stężenie peptydu wyniesie 40 ng / μL. Analizuj za pomocą LC-MS / MS w trybie DIA.</li>
</ol>
10. Analiza DIA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)
<ol>
	<li>Separacja nanoLC: Oddzielić mieszaninę peptydów za pomocą gradientu liniowego wynoszącego 140 minut przy natężeniu przepływu 230 nL/min na 15-centymetrowej kolumnie ID o średnicy 75 μm wypełnionej cząstkami krzemionki C18 o wielkości 3 μm.
	<ol>
		<li>Przeprowadź elucję gradientową przy natężeniu przepływu 230 nL/minutę i zwiększ zawartość ruchomej fazy B z 3% do 25% w ciągu 90 minut, następnie z 25% do 40% w 30 minut i wreszcie z 40% do 100% w 8 minut.</li>
		<li>Po 10 minutach w temperaturze 100% B należy zrównoważyć kolumnę z ruchomą fazą A przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parametry spektrometrii mas: przeprowadzić analizę DIA przy użyciu metody wykorzystującej następujący cykl skanowania: (i) pełne skanowanie MS o rozdzielczości 17 500 (cel AGC 1e6, maksymalny czas wstrzykiwania 50 ms), a następnie (ii) 20 okien o szerokości izolacji 20 m/z, zaczynając od m/z 350, (ii) 5 okien o szerokości izolacji 50 m/z i (iv) 1 okno o szerokości izolacji 200 m/z, kończąc zakres skanowania DIA na 1200 m/z. Wykonaj skany DIA w rozdzielczości 35 000 (cel AGC 5e5, maksymalny czas wstrzyknięcia 120 ms i 25 NCE).</li>
</ol>
11. Frakcjonowanie C18 w odwróconej fazie o wysokim pH do generowania bibliotek
UWAGA: Zbierz reprezentatywne próbki moczu EPS w ilości większej niż 10 μg w celu zbudowania zależnej od danych biblioteki do analizy DIA według następującej procedury:
<ol>
	<li>Zakwasić mieszaninę peptydów (11 μg) o 0,2% TFA i załadować otrzymany roztwór na końcówkę C18 StageTip wypełnioną dwiema warstwami dysków ekstrakcyjnych, aby zapewnić większą pojemność. Oszacowaliśmy, że ładowność pojedynczego dysku mikro (z igły strzykawkowej o rozmiarze 16) mieści się w zakresie 5-10 μg.</li>
	<li>Kondycjonować i równoważyć fazę stacjonarną, jak to już opisano dla oczyszczania C18.</li>
	<li>Frakcjonowanie peptydów przeprowadzić przez stopniową elucję (n=10) z odwróconej fazy C18 o wysokim pH przy użyciu roztworów elucyjnych zawierających 0,2% wodorotlenku amonu, 10 mM TEAB i zwiększających stężenia v/v ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%).</li>
	<li>Przeanalizować 10 frakcji przy użyciu tych samych parametrów chromatograficznych metody DIA. Uruchomić spektrometr mas w trybie DDA, korzystając z ustawień przyjętych wcześniej dla analizy wstępnej (patrz "Kwantyfikacja białek za pomocą wzorca zewnętrznego przy użyciu analizy DDA").</li>
</ol>
12. Analiza danych
<ol>
	<li>Wygeneruj bibliotekę spektralną, importując wyniki identyfikacji białek uzyskane z eksperymentów DDA LC-MS/MS frakcjonowania C18 w odwróconej fazie w oprogramowaniu dedykowanym do analizy DIA.</li>
	<li>Ustaw minimalną i maksymalną liczbę jonów fragmentacyjnych używanych do identyfikacji i kwantyfikacji odpowiednio na 3 i 6. Przefiltruj uzyskane wyniki według wartości Q równej 0,01.</li>
	<li>Zaimportuj pliki RAW DIA i skojarz z każdym plikiem RAW ten sam plik FASTA, który został użyty do utworzenia biblioteki spektralnej.</li>
	<li>Ustaw minimalną i maksymalną liczbę unikalnych peptydów używanych do oznaczania ilościowego białek odpowiednio na 1 i 10.</li>
	<li>Oblicz intensywność dla każdego białka, sumując powierzchnię piku jonów fragmentacyjnych.</li>
	<li>Wygeneruj matrycę z intensywnością ilościowo oznaczonych białek w każdej próbce.</li>
</ol>

<ol><li>Hüttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+quantification+of+cancer-associated+proteins+in+body+fluids+using+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.</a> Sci Transl Med. 4 (142), 10(2013).</li>
<li>Roobol, M. J., Carlsson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+stratification+in+prostate+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">Risk stratification in prostate cancer screening.</a> Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).</li>
<li>Principe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+prostate-enriched+proteins+by+in-depth+proteomic+analyses+of+expressed+prostatic+secretions+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine.</a> Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+proteomics+identifies+liquid-biopsy+signatures+for+extracapsular+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer.</a> Nature Communications. 7, 1-10 (2016).</li>
<li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+collection+and+protein+properties+of+expressed+prostatic+secretions+as+a+source+for+biomarkers+of+prostatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease.</a> Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).</li>
<li>Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometry+based+clinical+proteomics%3A+Applications+to+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research.</a> Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).</li>
<li>Berger, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MStern+blotting-high+throughput+polyvinylidene+fluoride+%28PVDF%29+membrane-based+proteomic+sample+preparation+for+96-well+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).</li>
<li>Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+trapping+%28STrap%29+sample+preparation+method+for+bottom-up+proteomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.</a> Proteomics. 14 (9), 1006(2014).</li>
<li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).</li>
<li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal%2C+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Proteomics%3A+Evaluation+of+Different+Sample+Preparation+Workflows+for+Quantitative%2C+Reproducible%2C+and+Improved+Depth+of+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+and+annotation+of+human+normal+urinary+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Wiśniewski, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Filter+Aided+Sample+Preparation+%28FASP%29+and+Multienzyme+Digestion+FASP+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+sample+preparation+in+96-well+filter+plates+for+quantitative+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics.</a> Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).</li>
<li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+data+extraction+of+the+MS%2FMS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition%3A+A+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Hüttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+protein+maps+for+biomarker+discovery+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).</li>
<li>Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+LC-MS%2FMS+analysis%3A+Implication+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments.</a> Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).</li>
<li>Muntel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+Urinary+Protein+Biomarker+Discovery+by+Data-Independent+Acquisition+on+a+Quadrupole-Orbitrap+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Differentially+Expressed+Proteins+in+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions+of+Men+with+Organ-confined+Versus+Extracapsular+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).</li>
<li>Decramer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+in+clinical+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Urine in clinical proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).</li>
<li>Thongboonkerd, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+points+in+urinary+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Practical points in urinary proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).</li>
<li>Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+new+biomarkers+of+renal+diseases+through+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics.</a> Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).</li>
<li>Drake, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Depth+Proteomic+Analyses+of+Direct+Expressed+Prostatic+Secretions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono strategię analizy próbek moczu EPS. Protokół FASP jest idealnym wyborem dla proteomiki układu moczowego, ponieważ umożliwia zagęszczenie próbki przed trawieniem enzymatycznym. W rzeczywistości, korzystając z tego przepływu pracy, kilkaset mikrolitrów moczu można załadować na jeden filtr i przetworzyć. Co więcej, trawienie na filtrze zapewnia względną swobodę w wyborze warunków denaturacji. W naszej pracy denaturację białek uzyskuje się poprzez rozcieńczenie próbek moczu w buforze zawierającym Tris, SDS i DTT (stężenie końcowe: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Białka są skutecznie denaturowane natychmiast po rozmrożeniu próbki, aby uniknąć niepożądanej degradacji przez aktywne proteazy. Oryginalny protokół FASP został ulepszony poprzez zwiększenie objętości prań ze 100 μL do 200 μL. W ten sposób uzyskuje się lepsze usuwanie pozostałości, zwłaszcza detergentów z filtra.
Po mineralizacji enzymatycznej przeprowadza się ocenę białka za pomocą wzorca zewnętrznego przy użyciu szybkiego LC-MS/MS, metoda zależna od danych przed ostatnimi etapami protokołu, które obejmują podwójne oczyszczanie StageTip i analizę LC-MS/MS w trybie DIA, na równym materiale wyjściowym dla wszystkich próbek (2 μg).
Wszechstronność FASP jest związana z podejściem DIA, czułą metodą zapewniającą niską liczbę brakujących wartości17. W naszej pracy zidentyfikowano i określono ilościowo 2387 białek, co umożliwiło narysowanie szczegółowego profilu proteomicznego EPS-moczu. Identyfikacja i kwantyfikacja białek 2387 była możliwa dzięki wytworzeniu bogatej biblioteki spektralnej, uzyskanej przez odwrócone frakcjonowanie peptydów o wysokim pH oraz naszej metodzie DIA, skierowanej na szeroki zakres prekursorów m/z . Ten proces pracy zidentyfikował ponad 80% białek znalezionych wcześniej w bezpośredniej analizie EPS, wykazując, że znaczna część proteomu EPS-moczu rzeczywiście pochodzi z ekspresji wydzielin gruczołu krokowego, a zatem jest bogatym źródłem białek specyficznych dla tkanki prostaty26.
Podsumowując, nasz eksperymentalny projekt łączy wszechstronność FASP z czułością DIA, aby uzyskać bogatą mapę proteomu moczu. Strategia ta jest zalecana do analizy próbek moczu EPS, ale jej zastosowanie można rozszerzyć na ogólną proteomikę moczu, a nawet na inne typy próbek.

Ciągła ewolucja technologii proteomicznych może mieć znaczący wpływ na pomoc w diagnozowaniu chorób i przewidywaniu odpowiedzi na leczenie, dostarczając wysokiej rozdzielczości map kluczowych efektorów molekularnych obecnych w szerokiej gamie próbek, takich jak tkanki i płyny biologiczne. Z analitycznego punktu widzenia mocz ma kilka zalet, takich jak łatwość zbierania i duża stabilność proteomu w stosunku do innych biopłynów1. Analiza proteomiczna moczu jest szczególnie interesująca w badaniach nad odkrywaniem biomarkerów w nowotworach urologicznych, ponieważ umożliwia nieinwazyjne pobieranie próbek w pobliżu tkanek będących przedmiotem zainteresowania2. W szczególności próbką, która wydaje się być obiecująca do badania patologii związanych z prostatą, jest EPS-urine3,4 (tj. próbka moczu pobrana po cyfrowym badaniu odbytnicy (DRE)). Ta ostatnia operacja przed pobraniem próbki wzbogaca mocz w białka specyficzne dla prostaty. EPS-urine jest dobrym kandydatem do badania zaburzeń związanych z gruczołem krokowym5, w tym raka prostaty (PCa), ponieważ poprzez DRE białka wydzielane przez guz mogą być wlewane do próbki moczu, zwiększając szansę na wykrycie białek specyficznych dla tkanki nowotworowej.
Kluczową rolę w umożliwieniu wykrywania i kwantyfikacji potencjalnych biomarkerów białkowych odgrywa spektrometria mas (MS). W ciągu ostatnich dwóch dekad oparte na MS protokoły analizy proteomicznej pozwoliły na wykrycie coraz większej liczby białek w jednym przebiegu LC-MS/MS dzięki ciągłym ulepszeniom w oprzyrządowaniu MS i oprogramowaniu do analizy danych6.
Przygotowanie próbki proteomicznej opartej na MS zazwyczaj obejmuje enzymatyczne trawienie mieszanki białek, co można osiągnąć za pomocą wielu różnych protokołów, takich jak: trawienie w roztworze, MStern blotting7, pułapkowanie zawiesiny (S-trap)8, przygotowanie próbki wzmocnionej fazą stałą (SP3)9, trawienie w StageTip10 i przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP)11. Wszystkie protokoły mogą być stosowane w proteomice układu moczowego, nawet jeśli wyniki mogą się różnić w zależności od liczby zidentyfikowanych białek i peptydów oraz pod względem odtwarzalności12.
W tej pracy nasza uwaga skupiła się na analizie EPS-moczu za pomocą protokołu FASP. Protokół FASP został pierwotnie zaprojektowany do analizy białek wyekstrahowanych z tkanek i kultur komórkowych, ale jego zastosowanie zostało następnie rozszerzone na analizę innych typów próbek, takich jak urine13. Jeśli chodzi o proste trawienie w roztworze, FASP jest bardziej elastycznym podejściem proteomicznym14, ponieważ dzięki skutecznemu usuwaniu detergentów i innych zanieczyszczeń, takich jak sole, z mieszanki białkowej przed mineralizacją enzymatyczną15, pozwala na wybór optymalnych warunków solubilizacji białek. Ponadto dodatkową cechą FASP jest to, że zapewnia on środki do zatężania próbki. Jest to szczególnie interesujące w przypadku analizy proteomicznej moczu, ponieważ pozwala na rozpoczęcie od stosunkowo dużych objętości próbek (setki mikrolitrów). W świetle potencjału protokołu FASP, kilka badań skupiło się na automatyzacji przepływu pracy, w celu zmniejszenia zmienności eksperymentalnej i równoległego przetwarzania zwiększonej liczby próbek16.
W naszym przepływie pracy, FASP jest poprzedzany akwizycją LC-MS/MS w analizie niezależnej od danych (DIA), co zapewnia wysokie pokrycie proteomem, dobrą precyzję ilościową i niską częstość występowania brakujących wartości. Podejście DIA jest czułą metodą, w której wszystkie jony są wybierane do zdarzeń MS/MS, w przeciwieństwie do tego, co dzieje się w analizie zależnej od danych (DDA), gdzie fragmentowane są tylko jony o największej intensywności. Spektrometr mas, pracujący w trybie DIA, wykonuje cykle skanowania o różnej szerokości izolacji, obejmujące cały zakres prekursorów m/z. Takie podejście pozwala na powtarzalne wykrywanie dużej liczby peptydów w jednostce czasu, zapewniając migawkę proteomiczną sample17. Co więcej, dane generowane przez DIA mają jeszcze jedną interesującą cechę: możliwość analizy a posteriori18. Dane DIA są bardziej złożone niż te uzyskane przez DDA, ponieważ widma MS/MS w DIA wynikają z koizolacji kilku jonów prekursorowych w każdym oknie m/z19. Rozplątanie złożonych widm MS/MS na odrębne i specyficzne sygnały peptydowe odbywa się dzięki zastosowaniu dwóch podstawowych elementów: biblioteki spektralnej oraz dedykowanego oprogramowania do analizy danych. Biblioteka spektralna jest generowana w eksperymencie zależnym od danych, zwykle obejmującym frakcjonowanie peptydów w celu maksymalizacji pokrycia proteomu, który dostarcza listę tysięcy eksperymentalnie określonych jonów prekursorowych i widm MS/MS peptydów wykrywalnych w rozważanej próbce. Zamiast tego oprogramowanie do analizy danych wykorzystuje informacje zawarte w bibliotece spektralnej do interpretacji danych DIA poprzez generowanie specyficznych wyekstrahowanych chromatogramów jonowych, które umożliwiają wykrywanie peptydów i kwantyfikację. Podczas gdy bezbiblioteczna analiza danych DIA jest teraz możliwa, DIA oparta na bibliotece nadal zapewnia lepsze wyniki pod względem pokrycia proteomu20.
Opisany tutaj protokół przygotowania próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) składa się z następujących kroków: etap wirowania (w celu usunięcia resztek komórek), trawienie FASP, oczyszczanie StageTip21, kwantyfikacja białek i analiza DIA. Protokół ten został opracowany do analizy moczu EPS w kontekście odkrywania biomarkerów raka prostaty, ale może być stosowany do analizy proteomicznej dowolnej próbki moczu.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris HCL pH 8,0</td><td>Lonza</td><td>51238</td><td></td></tr><tr><td>2-jodoacetamid do syntezy</td><td>Merck</td><td>8047440100</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl do HPLC LC-MS klasa</td><td>VWR</td><td>83640.290</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fluka</td><td>9690</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma</td><td>30501</td><td></td></tr><tr><td>wzorzec objętościowy wodorotlenku amonu, Roztwór 5N w wodzie</td><td>Merck</td><td>318612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Amresco</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Empore Kation 47 mm Dyski ekstrakcyjne</td><td>Mikrokolumna</td><td>2251</td><td></td></tr><tr><td>Empore Disk C18</td><td>Varian</td><td>12145004</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy optima Fisher</td><td>Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Hela Protein Digest Standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Microcon-10kDa z membraną Ultracel-10</td><td>MERCK</td><td>MRCPRT010</td><td></td></tr><tr><td>roztworem dodecylosiarczanu sodu</td><td>Merck</td><td>71736-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wodorowęglanu tietyloamonu</td><td>Merck</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Merck</td><td>T6567-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Merck</td><td>U6504-500G</td><td></td></tr><tr><td>Klasa gradientu wody HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W/0106/17</td><td></td></tr><tr><td>Proteom Discoverer 1,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut 14.0</td><td>Biognosys</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profil proteomiczny eps-moczu poprzez trawienie fasp i analizę niezależną od danych

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Protokół próbkowania wspomaganego filtrem (FASP) jest szeroko stosowany do przygotowania próbek proteomicznych, ponieważ pozwala na zagęszczenie rozcieńczonych próbek i jest kompatybilny z szeroką gamą detergentów. Oddolne procesy proteomiczne, takie jak FASP, w coraz większym stopniu opierają się na metodach LC-MS/MS wykonywanych w trybie analizy niezależnej od danych (DIA), metodzie skanowania, która umożliwia głębokie pokrycie proteomu i niską częstość występowania brakujących wartości. 
W tym raporcie przedstawimy szczegóły przepływu pracy, który łączy protokół FASP, podwójny etap oczyszczania StageTip i LC-MS/MS w trybie DIA do mapowania proteomu moczu. Jako próbkę modelową przeanalizowaliśmy wydzielinę z ekspresji gruczołu krokowego (EPS) - mocz, próbkę pobraną po cyfrowym badaniu odbytniczym (DRE), która jest przedmiotem zainteresowania w badaniach nad odkrywaniem biomarkerów raka prostaty.

Niniejszy protokół analizy proteomicznej moczu obejmuje następujące etapy: trawienie metodą FASP, szacowanie ilości białka za pomocą kalibracji standardem zewnętrznym, podwójne oczyszczanie za pomocą StageTip (SCX i C18) oraz analizę LC-MS/MS w trybie DIA.
Po trawieniu białek przeprowadzono wstępne wtryskiwki po oczyszczeniu otrzymanych peptydów za pomocą StageTip SCX. Surowe pliki LC-MS/MS przetworzono w celu uzyskania liczby zidentyfikowanych peptydów, liczby zidentyfikowanych białek oraz pola powierzchni wykrytych peptydów. Całkowita powierzchnia, otrzymana poprzez zsumowanie wszystkich zidentyfikowanych peptydów, została wykorzystana do oszacowania zawartości białek poprzez interpolację względem standardu zewnętrznego: trawionego białka HeLa wtryskiwanego w pięciu różnych ilościach (odpowiednio 2, 5, 15, 50, 150 ng). Ilość białka dla sześciu próbek analizowanych w niniejszym badaniu różniła się w zależności od próbki, wykazując średnią wartość 78 ng/µL.
Po oznaczeniu ilości białka, 2 µg strawionych białek z każdej próbki są oczyszczane poprzez sekwencyjne zastosowanie SCX i C18 StageTip przed analizą DIA. Biblioteka spektralna do przeszukiwania danych DIA jest tworzona po frakcjonowaniu w układzie odwróconej fazy przy wysokim pH oraz analizie DDA LC-MS/MS reprezentatywnej próbki (np. puli próbek). Stosując opisane powyżej parametry, zidentyfikowaliśmy i ilościowo określiliśmy łącznie 2387 grup białek w sześciu analizowanych próbkach moczu EPS (Tabela uzupełniająca 1 oraz Rycina 4).
W celu jakościowej oceny istotności listy zidentyfikowanych i zmierzonych białek, otrzymaną macierz porównano z listą 624 białek uprzednio zidentyfikowanych w bezpośrednim EPS22, próbce pobranej za pomocą bardziej inwazyjnej procedury, która okazała się źródłem interesujących potencjalnych biomarkerów raka prostaty. Łącznie 508 spośród 624 białek zostało pomyślnie wykrytych w EPS-moczu przy użyciu naszego protokołu FASP/DIA.
<img alt="Przygotowanie próbek i proteomika: wirowanie, FASP, SCX, oczyszczanie C18, spektrometria mas DIA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat analizy proteomicznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu dla roztworu HeLa; protokół FASP, analiza DDA, oczyszczanie SCX, kwantyfikacja białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przedstawienie projektu eksperymentalnego dla kwantyfikacji białek w oparciu o standard zewnętrzny (trawienie HeLa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat frakcjonowania i oczyszczania próbek; analiza LC-MS/MS dla biblioteki spektralnej i danych DIA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kluczowe etapy analizy DIA: (i) opracowanie biblioteki spektralnej poprzez frakcjonowanie w układzie przeciwprądowym przy wysokim pH oraz analizę DDA, (ii) analiza próbek z zastosowaniem podejścia DIA, (iii) analiza danych programem Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Krzywa obfitości białek; ranga vs. stężenie; wykres; analiza danych proteomicznych; białka ludzkie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62512/62512fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wykres rankingowy dla wykrytych białek z moczu EPS. Oznakowano kilka wybranych wyników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/62512fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Reprezentatywna tabela ilościowo określonych białek w sześciu próbkach moczu EPS w programie Spectronaut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62512/Supplementary%20Table%201.xls" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół trawienia na filtrze ze szczegółowymi informacjami na temat: trawienie białek, oczyszczanie peptydów i analiza pozyskiwania niezależnie od danych. Strategia ta jest stosowana do analizy ekspresji wydzielin gruczołu krokowego - próbek moczu i umożliwia wysokie pokrycie proteomem oraz profilowanie proteomu moczu bez znaczników o niskiej brakującej wartości.

Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...

Protokół FASP jest interesującym podejściem do proteomiki moczu ze względu na jego kompatybilność z silnie denaturującymi oraz ze względu na jego zdolność do koncentrowania próbki na filtrze, co ma kluczowe znaczenie dla rozcieńczonych próbek białek. Protokół FASP w połączeniu ze spektrometrią mas z analizą niezależną od danych pozwala nam osiągnąć głębokie pokrycie proteomu w moczu EPS, czyli moczu pobranym po cyfrowym badaniu doodbytniczym. Obecnie stosujemy metodę, którą wkrótce zobaczysz w celu odkrycia biomarkerów raka prostaty.Zabieg pokażą Licia Prestagiacomo, Paola Morelli i Caterina Gabriele. Próbki moczu EPS odwirować w ciągu dwóch godzin od pobrania przez 10 minut w temperaturze 2,100 RCF w temperaturze pokojowej. Następnie przechowuj supernatanty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.Rzuć próbki na lód lub w temperaturze czterech stopni. Aby przyspieszyć procedurę, można przenieść próbki z minus 80 do minus 20 w dniu poprzedzającym trawienie. Jako roztwory podstawowe będziesz potrzebować 500 milimolowych DTT, 10% SDS, jednego molowego bufora Tris o pH ośmiu.Rozcieńczyć 500 mikrolitrów każdej próbki moczu EPS 67 mikrolitrami SDS, 67 mikrolitrami DTT i 33 mikrolitrami buforu Tris. Inkubować w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut, delikatnie wstrząsając. Zamontuj filtr odśrodkowy z odciętą masą cząsteczkową 10 000 daltonów.Następnie dodaj 300 mikrolitrów rozcieńczonej próbki moczu EPS do filtra. Wirować przy 14 000 g przez około 20 minut. Możesz tymczasowo przerwać procedurę po około 15 minutach, aby sprawdzić, czy filtracja przebiega płynnie.Kontynuuj, aż cały roztwór przejdzie przez filtr. Następnie dodać 200 mikrolitrów buforu mocznikowego i odwirować przy 14 000 g przez 15 minut. Powtórz ten krok po raz drugi.Gdy przepływ ma się zetknąć z filtrem, opróżnij kolekcję Eppendorf, odpipetowując przepływ. Białka są bezpieczne na filtrze. W przypadku alkilowania cysteiny należy przygotować roztwór jodoacetamidu bezpośrednio przed użyciem.Odważyć około 10 miligramów jodoacetamidu w fiolce z numerem Eppendorf i rozpuścić w buforze mocznikowym w stężeniu 9,25 miligrama na ml lub w ujęciu molowym 50 milimolów. Dodać 50 mikrolitrów roztworu jodoacetamidu do każdego filtra i odwirować przy 6 000 g przez 25 minut. Niższa prędkość wirowania sprawi, że filtry nie będą pracować na sucho.Po alkilowaniu białek przemyć filtry dwoma kolejnymi podwielokrotnościami buforu mocznikowego o pojemności 200 mikrolitrów i odwirować przy 14 000 g przez 20 minut. Odrzuć przepływ. Dodać 200 mikrolitrów 50-milimolowego buforu wodorowęglanu etyloamonu i odwirować przy 14 000 g przez 20 minut.Powtórz ten krok. Po całkowitym zakończeniu ostatniego płukania wodorowęglanem przenieś jednostkę filtrującą do nowej probówki zbiorczej. Następnie dodaj 60 mikrolitrów 50-milimolowego buforu TEAB.Dodaj jeden mikrolitr roztworu trypsyny o stężeniu 200 nanogramów na mikrolitr trypsyny. Alternatywnie można przygotować bufor do wytrawiania dla wszystkich próbek w fiolce Eppendorf i rozprowadzić 61 mikrolitrów buforu mineralizacyjnego do każdego filtra. Jeśli używasz ThermoMixera, aby uniknąć parowania próbki podczas inkubacji przez noc, owiń każdą jednostkę filtrującą warstwą folii aluminiowej, a następnie warstwą parafilmu.Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni przez noc. Następnego ranka przenieś filtry do wirówki stołowej na bardzo krótkie wirowanie. Po odwirowaniu otwórz pokrywki Eppendorf i dodaj 140 mikrolitrów wody.Odwirować fiolki o stężeniu 14 000 g przez 25 minut w celu zebrania peptydów. Zebrana objętość powinna wynosić około 190 mikrolitrów. W celu usunięcia śladów SDS z trawienia zaleca się silne oczyszczanie peptydów metodą kationowymienności przed LC-MS-MS.Przygotuj uchwyty na mikrokolumny, przekłuwając pokrywy Eppendorf ostrym narzędziem, takim jak pęseta lub nożyczki. Uchwyt pomieści mikrokolumnę podczas wirowania. Ponieważ ich przygotowanie jest żmudne, uchwyty mogą być używane wielokrotnie.Za pomocą środka i igły usuń płytkę nazębną z odpowiedniej tarczy ekstrakcyjnej. Krążki ekstrakcyjne to miękkie materiały polimerowe zawierające cząstki sorbentu. W tym przypadku sorbent składa się z cząstek o silnych właściwościach kationowymiennych.Umieść płytkę nazębną w końcówce pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Za pomocą tłoka popchnij korek w kierunku końca końcówki. Mały krążek należy mocno docisnąć, ale unikając nadmiernej siły.Włóż końcówkę do uchwytu i zmontuj mikrokolumnę wirową za pomocą dwumililitrowej fiolki Eppendorf, z której usunięto oryginalną pokrywkę. Zatyczka z igły o rozmiarze 16 będzie miała pojemność około pięciu mikrogramów peptydów. Kondycjonować mikrokolumnę przez dwa kolejne płukania.Odpowiednia prędkość będzie zależeć od tego, jak mocno wciśniesz krążek w końcówkę pipety. Dążyć do osiągnięcia natężenia przepływu rzędu 20 do 30 mikrolitrów na minutę. Staraj się, aby końcówka nie wyschła podczas prania i podczas ładowania próbki.Rozcieńczyć próbkę pięciokrotnie w drugim roztworze do przemywania i załadować wyniki do roztworu z mniejszą prędkością. Dąż do natężenia przepływu około 15 do 20 mikrolitrów na minutę. W razie potrzeby wyrzuć przepływ.Zmyj resztki detergentów. Następnie pozostaw dysk do wyschnięcia przed elucjącją. Przenieść mikrokolumnę do czystej probówki Eppendorfa 1,5 i natychmiast dodać eluent.Będzie to siedem mikrolitrów 500-milimolowego roztworu octanu amonu zawierającego 20% acetonitrylu. Rozcieńczyć eluat 27 mikrolitrami 0,1% kwasu mrówkowego w celu obniżenia procentowej zawartości rozpuszczalnika organicznego, a następnie wstrzyknąć dwa mikrolitry otrzymanego roztworu do LC-MS-MS z detekcją w trybie zależnym od danych. Szczegółowe informacje na temat konfiguracji LC-MS używanej w tym protokole zostaną podane w dalszej części filmu.Po przeszukaniu bazy danych i integracji błędów peptydów oblicz całkowity obszar piku. Następnie porównaj go z zewnętrzną krzywą wzorcową, aby oszacować stężenie peptydów w trawieniu FASP. Po oszacowaniu ilości peptydów należy oczyścić nową porcję trawienia FASP odpowiadającą dwóm mikrogramom peptydów przez dwa kolejne oczyszczania StageTip, jak opisano tutaj.Konfiguracja LC-MS stosowana w tym protokole opiera się na bezpośrednim wstrzyknięciu do kolumny analitycznej. Jeśli używasz systemu z kolumną zalewkowania, możesz uniknąć etapu oczyszczania C18 w trybie offline. Należy pamiętać o użyciu dedykowanych igieł i tłoków do każdego materiału chromatograficznego.Po wyluzowaniu peptydów z końcówki C18 Stage za pomocą 10 mikrolitrów eluentu, częściowo odparuj eluat w wirówce próżniowej przez kilka minut, starając się uniknąć pełnego odparowania. Następnie dodaj 47 mikrolitrów 0,1% kwasu mrówkowego i umieść powstały roztwór w fiolce HPLC do analizy LC-MS. Zastosowany tutaj system opiera się na bezpośrednim ładowaniu próbki na kolumnę bez użycia kolumny pułapkowej.Kolumny analityczne są produkowane we własnym zakresie poprzez pociągnięcie kapilary o średnicy wewnętrznej 75 mikrometrów po usunięciu kawałka powłoki poliamidowej. Powstałą końcówkę można delikatnie ukształtować za pomocą ceramicznego frezu. Kapilarę umieszcza się następnie w bombie pakującej i wypełnia 50 miligramami na ml zawiesiny izopropanolu C18 o wielkości trzech mikrometrów cząstek fazy stacjonarnej.Potrzebne jest ciśnienie gazu od 10 do 20 barów azotu lub helu. Można użyć alternatywnych lub komercyjnych kolumn chromatograficznych pracujących z natężeniem przepływu poniżej mikrolitra na minutę. Zamontuj kolumnę na trójniku.Pozostałe dwa końce są podłączone do zasilacza wysokiego napięcia i do pętli HPLC. Oceń optymalne napięcie natrysku, uruchamiając system z przepływem izokratycznym. Następnie rozpocznij analizę.Rozdzielić peptydy w dwugodzinnym gradieniu chromatograficznym, jak pokazano. Akwizycja danych będzie składać się z szybkiego, pełnego skanowania MS Service, a następnie 26 skanów MS-MS w oknach prekursorów o zmiennej szerokości. Począwszy od szerokości 20 m/z, dla pierwszych 20 okien, które pokryją m/z zakres od 350 do 750 Thompson.Następnie przejście do szerokości 50 m/z dla kolejnych pięciu okien i zakończenie pojedynczym skanem MS-MS o szerokości izolacji 200 Thompsona. Węższe szerokości odpowiadają za bardziej zaludniony obszar widma pod względem obecności prekursorów peptydów. Do analizy DIA potrzebna będzie biblioteka spektralna.Aby wygenerować bibliotekę spektralną, można wykonać kilka eksperymentów zależnych od danych na tym samym systemie LC-MS-MS, którego używano do akwizycji DIA przy użyciu tego samego gradientu chromatograficznego. Frakcjonowanie próbek zwiększy pokrycie proteomu. Końcówki etapowe mogą być używane do frakcjonowania próbek.Silna wymiana kationowa i podstawowa faza odwrócona to dwie ważne alternatywy. Zacznij od 10 mikrogramów z puli kilku transtramentów FASP. Zakwasić próbkę przy użyciu końcowego stężenia 0,2% TFA.Załaduj peptydy na końcówki C18 Stage o dużej pojemności. Używaj wielu krążków w przypadku dużych ilości peptydów. W przypadku 10 mikrogramów materiału zalecane są dwa krążki.Przeprowadzić oczyszczanie C18 zgodnie z wcześniejszym opisem. Przygotować kilka fiolek do pobrania eluatu. Tyle, ile ułamków.W tym przypadku 10 frakcji jest wytwarzanych przez stopniową elucję. Po ostatnim praniu dodaj 20 mikrolitrów pierwszego eluentu. 0,2% wodorotlenek amonu, 10 milimolowy TEAB, 4% acetonitryl.Po całkowitym elucji pierwszej frakcji w pierwszym wstrzykiwaczu Eppendorf, przenieś końcówkę Stage Tip do następnej fiolki zbiorczej. Rozcieńczyć w krokach co 20 mikrolitrów, używając jako eluentu, 0,2% wodorotlenku amonu, 10 milimolowego TEAB, a następnie zwiększając ilość acetonitrylu. Po frakcjonowaniu próbki i przeprowadzeniu eksperymentów zależnych od danych dla każdej frakcji, wygeneruj bibliotekę spektralną, przeszukując bazę danych MS-MS.Biblioteka zostanie następnie zaimportowana do oprogramowania zdolnego do analizy danych DIA w celu kwantyfikacji białek w oparciu o co najmniej jeden unikalny peptyd przypisany przez co najmniej trzy przejścia. Spodziewaj się, że pokryjesz szeroki zakres proteomu moczu. Rysunek ten przedstawia identyfikację i kwantyfikację białek w całym zakresie obfitości, obejmującym pięć rzędów wielkości.Przedstawiony tutaj przepływ pracy łączy w sobie przewagę koncentracji i wszechstronność protokołu FASP z czułością trybu skanowania DIA. Ta kombinacja zapewnia bogatą mapę proteomu moczu. Ponieważ nasza konfiguracja analizy nie obejmuje użycia kolumny pułapkowej, skrót FASP został oczyszczony zarówno przez silną wymianę kationów, jak i końcówki etapów z odwróconą fazą.Krok wskazówek etapowych z odwróconą fazą można pominąć, gdy kolumna zalewkowania jest połączona bezpośrednio z kolumną analityczną. Korzystanie z tego przepływu pracy jest zalecane do analizy próbek moczu EPS, ale jego zastosowanie można rozszerzyć na proteomikę moczu w ogóle.

proteomic-profile-eps-urine-through-fasp-digestion-data-independent

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Archiwalne próbki kliniczne z utrwalonego formaliny i zatopionej w parafinie (FFPE) są cennym materiałem do badania chorób. W tym miejscu demonstrujemy proces przygotowania próbki, który pozwala na dogłębną analizę proteomiczną mikrowypreparowanej tkanki FFPE.

Przygotowanie próbki proteomicznej z tkanki utrwalonej formaliną i zatopionej w parafinie

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Tutaj tworzymy metodę proteomiczną opartą na spektrometrii mas, używając izolowanych obszarów zainteresowania w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki. Protokół ten służy do analizy proteomu z określonych obszarów tkanek w zarchiwizowanych odcinkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie.

Uproszczone podejście do proteomiki opartej na spektrometrii mas z wykorzystaniem wybranych regionów tkanek

Dane proteomiczne oparte na spektrometrii mas są dostępne w otwartych bazach danych i dostępne za pomocą bezpłatnych narzędzi. Biorąc pod uwagę złożoność przeszukiwania i opisywania baz danych, wielu biologom brakuje wiedzy, aby wykorzystać te zestawy danych. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik dotyczący korzystania z bezpłatnych narzędzi do podstawowego wyszukiwania danych proteomicznych.

Poruszanie się po danych proteomicznych opartych na spektrometrii mas przy użyciu bezpłatnych narzędzi obliczeniowych

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj kompleksowy protokół FASP z analizą DIA do mapowania proteomu moczu EPS w badaniach biomarkerów raka prostaty. Metoda zapewnia głębokie pokrycie proteomu i wysoką czułość.

Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych

Przeglądaj więcej filmów