Name: Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę oceny biokompatybilności atramentów biologicznych z nanocelulozą krystaliczną i agarozą w hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Protokół umożliwia szybkie badanie cytotoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy firmie Alberta Innovates za dostarczenie CNC oraz Kenowi Harrisowi i Jae-Young Cho za ich techniczne porady podczas przygotowywania matrycy CNC/agarozy/D-mannitolu. Dziękujemy również Benowi Hoffmanowi, Heather Winchell i Nicole Diamantides za ich porady techniczne i wsparcie w konfiguracji i kalibracji biodrukarki 3D INKREDIBLE+.

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Drury, J. L., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Scaffold+design+variables+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.</a> Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for tissue engineering.</a> Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).</li>
<li>Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalib%2C+N+%22Handbook+of+Ecomaterials%22">Handbook of Ecomaterials</a>. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).</li>
<li>Alonso-Lerma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+performance+crystalline+nanocellulose+using+an+ancestral+endoglucanase%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Materials%22%5BJournal%5D)">High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase.</a> Communications Materials. 1 (1), 57(2020).</li>
<li>Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+nanocellulose-reinforced+PVA+hydrogel+with+human+corneal+epithelial+cells+for+ophthalmic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Functional+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications.</a> Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35(2019).</li>
<li>Fey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nanocellulose+as+novel+carrier+for+intestinal+epithelial+cells+in+drug+delivery+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies.</a> Materials Science and Engineering: C. 109, 110613(2020).</li>
<li>Ojansivu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood-based+nanocellulose+and+bioactive+glass+modified+gelatin-alginate+bioinks+for+3D+bioprinting+of+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells.</a> Biofabrication. 11 (3), 035010(2019).</li>
<li>Jonsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+networks+on+nanocellulose+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Neuronal networks on nanocellulose scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).</li>
<li>Samulin Erdem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+nanocrystals+modulate+alveolar+macrophage+phenotype+and+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function.</a> Biomaterials. 203, 31-42 (2019).</li>
<li>Menas, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+vs+crystalline+nanocellulose+pulmonary+epithelial+cell+responses%3A+Cytotoxicity+or+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation.</a> Chemosphere. 171, 671-680 (2017).</li>
<li>Halova, I., Draberova, L., Draber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+chemotaxis+chemoattractants+and+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).</li>
<li>Groll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+definition+of+bioinks+and+their+distinction+from+biomaterial+inks%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks.</a> Biofabrication. 11 (1), 013001(2019).</li>
<li>Schwab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printability+and+shape+fidelity+of+bioinks+in+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting.</a> Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).</li>
<li>Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+molecular+design+criteria+for+3D+printable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels.</a> Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).</li>
<li>Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+viable+and+non-viable+cells+using+propidium+iodide+in+two+color+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence.</a> Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).</li>
<li>Usov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+nanocellulose+chirality+and+structure-properties+relationship+at+the+single+fibril+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level.</a> Nature Communications. 6 (1), 7564(2015).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez National Research Council Canada i Alberta Innovates.

Wytwarzanie tkanek biomimetycznych 3D wymaga udanego połączenia biotuszu, który naśladuje składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, ze składnikami komórkowymi w celu stworzenia fizjologicznych analogów tkanek in vivo . Wymaga to użycia komórek pierwotnych, a nie komórek przekształconych, podczas wytwarzania fizjologicznych tkanek biomimetycznych. Pierwotne komórki immunologiczne, takie jak komórki tuczne, są jednak szczególnie podatne na działanie cytotoksyczne i zmiany fenotypowe, które mogą być wywołane przez sam...

Niedawne zainteresowanie systemami hodowli 3D i biodrukiem 3D skupiło uwagę na hydrożelach i kompozytach hydrożelowych. Kompozyty te służą jako lepkie, ale porowate biomimetyki i mogą składać się z do 99% zawartości wody w masie, co jest porównywalne z tkankami biologicznymi1,2,3. Te cechy kompozytów hydrożelowych umożliwiają tym samym wzrost komórek bez wpływu na ich żywotność i funkcję. Jednym z takich kompozytów jest krystaliczna nanoceluloza (CNC), która została wykorzystana jako materiał wzmacniający w kompozytach hydrożelowych, rusztowaniach komórkowych przy opracowywaniu implantów biomateriałowych oraz w dwuwymiarowych (2D) i 3D hodowlach komórkowych in vitro4,5. W większości matryce złożone z CNC nie są jawnie cytotoksyczne dla ludzkich komórek nabłonka rogówki6, komórki nabłonka jelitowego7, mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego ludzkiego8, lub komórki podobne do neuronów9. Jednak aktywność metaboliczna i proliferacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego zmniejsza się w korelacji ze zwiększoną lepkością kompozytów nanocelulozowych na bazie drewna, co sugeruje, że skład matrycy musi być dokładnie przetestowany pod kątem jej szkodliwego wpływu na funkcje komórek8.
Podobnie, CNC może wywołać reakcje zapalne w makrofagach po internalizacji, co może mieć poważne konsekwencje w systemach hodowli komórek odpornościowych 3D10,11. W rzeczywistości dostępnych jest bardzo niewiele danych na temat tego, w jaki sposób CNC może wpływać na inne odpowiedzi komórek odpornościowych, w szczególności alergiczne reakcje zapalne, które są inicjowane przez komórki tuczne. Komórki tuczne to granulowane leukocyty, które wyrażają receptor IgE o wysokim powinowactwie, FceRI, odpowiedzialny za aktywację odpowiedzi zapalnych na alergeny. Ich proliferacja i różnicowanie są zależne od czynnika komórek macierzystych (SCF), który wiąże receptor tyrozyny, Kit. Komórki tuczne pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego, które dostają się do krążenia, a następnie migrują obwodowo, aby rozproszyć się we wszystkich tkankach ludzkich12. Ponieważ komórki tuczne funkcjonują w środowisku tkankowym 3D, są idealnym kandydatem na komórki odpornościowe do badania procesów immunologicznych w modelach tkanek 3D in vitro. Jednak do tej pory nie ma realnego modelu tkanki 3D in vitro zawierającego komórki tuczne.
Ze względu na bardzo czułą naturę komórek tucznych i ich skłonność do wywoływania prozapalnych reakcji na bodźce zewnętrzne, wymagane jest dokładne rozważenie składników matrycy 3D i metody biodruku polegającej na wprowadzaniu komórek tucznych do rusztowania 3D, jak omówiono dalej. Konstrukty tkankowe mogą być biowytwarzane z dwóch szerokich kategorii biomateriałów, tj. biotuszy i atramentów biomateriałowych. Różnica polega na tym, że biotusze są kompozytami hydrożelowymi obciążonymi komórkami, podczas gdy tusze biomateriałowe to kompozyty hydrożelowe, które są pozbawione komórek, zgodnie z definicją Groll i wsp.13,14. W związku z tym konstrukcje 3D wydrukowane za pomocą biotuszy zawierają komórki wstępnie osadzone w matrycy hydrożelowej, podczas gdy konstrukcje 3D wydrukowane za pomocą atramentów biomateriałowych muszą zostać zasiane komórkami po wydrukowaniu. Biofabrykacja rusztowań hodowlanych z biotuszów na bazie hydrożelu/tuszy biomateriałowych jest najczęściej wykonywana przy użyciu biodrukarek 3D do wytłaczania, które wytłaczają atrament biotuszowy/atramentowy przez dyszę mikroskalową pod ciśnieniem za pomocą pneumatycznie lub mechanicznie napędzanego tłoka14. Biodrukarki wytłaczające wytwarzają rusztowania 3D, osadzając biotusz w przekrojach 2D, które są sekwencyjnie układane jeden na drugim w podejściu "oddolnym".
Aby być kompatybilnym z biodrukiem ekstruzyjnym, hydrożelowy tusz do biotuszu/biomateriału musi posiadać właściwości tiksotropowe (rozrzedzenie ścinające), dzięki czemu polimery hydrożelowe wchodzące w skład tuszu do biotuszu/biomateriału przepływają jak płyn przez dyszę mikrokanałową, gdy są poddawane naprężeniom ścinającym, ale wracają do lepkiego, żelowego stanu po usunięciu naprężenia ścinającego<klasa SUP="xref">15. Ze względu na wysoką zawartość wody, polimery biotuszy / atramentów biomateriałowych na bazie hydrożelu muszą być usieciowane, fizycznie lub kowalencyjnie, aby zachować architekturę i integralność strukturalną biodrukowanej struktury 3D. W przypadku biotuszów obciążonych komórkami, komórki są bezpośrednio poddawane naprężeniom chemicznym podczas procesu sieciowania. Proces wytłaczania komórek zamkniętych w matrycy hydrożelowej biotuszu również poddaje komórki naprężeniom ścinającym, co może prowadzić do zmniejszenia żywotności i/lub śmierci komórki. Po biodruku modelu tkanki 3D trudno jest rozróżnić poziomy cytotoksyczności wywołane przez samą matrycę hydrożelową oraz odpowiednio procesy ekstruzji i sieciowania. Jest to szczególnie trudne w kontekście rusztowań 3D, w których komórki są wstępnie osadzone w matrycy hydrożelowej, co utrudnia usunięcie komórek do późniejszych analiz, co byłoby szkodliwe dla żywotności komórek tucznych.
Łagodniejsze podejście do generowania konstruktów tkanek 3D zawierających komórki tuczne polega na umieszczaniu komórek w wstępnie wydrukowanych, porowatych rusztowaniach 3D z biomateriału z zawiesiny hodowli komórkowej, która wykorzystuje wrodzoną zdolność komórek tucznych do migracji z krążenia do tkanek obwodowych. Korzyści płynące z tego podejścia do wysiewu komórek są dwojakie: (i) komórki tuczne nie są poddawane naprężeniom ścinającym i chemicznym w procesach wytłaczania i sieciowania, odpowiednio, oraz (ii) komórki można łatwo usunąć z rusztowania 3D po ekspozycji poprzez delikatne mycie w celu analizy bez negatywnego wpływu na ich żywotność. Dodatkową korzyścią z wysiewu i analizy żywotności komórek tucznych na biodrukowanych, porowatych rusztowaniach hydrożelowych 3D w przeciwieństwie do dysków hydrożelowych 2D jest to, że biodrukowane rusztowania hydrożelowe 3D podsumowują cechy topograficzne tkanek in vivo w skali mikroskali, które nie występują w masowych, płaskich dyskach hydrożelowych 2D. Podejście to jest odpowiednim, szybkim i opłacalnym podejściem do określenia potencjalnie katastrofalnych skutków cytotoksycznych kandydujących matryc hydrożelowych biotuszu na komórki tuczne, a także inne komórki immunologiczne, przed zainwestowaniem w kosztowne eksperymenty inżynierii tkankowej 3D.

<table><tbody><tr><td>A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid (lodowaty)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX0074-6</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2125-500GM</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG chomika ormiańskiego, APC (klon: eBio299Arm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-4888-82</td><td></td></tr><tr><td>B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>BD 5 ml Strzykawka (końcówka Luer-Lok)</td><td>Igła BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 26G x 1/2 cala</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 24-dołkowa wielomisowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930-186</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96 Well Multidish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130-188</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 175 cm2 Termo</td><td>Fisher Scientific</td><td>130-191</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II</td><td>Microzone Corp., Kanada</td><td>BK-2-6-B3</td><td></td></tr><tr><td>BSA, frakcja V (OmniPur)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>2930-100GM</td><td></td></tr><tr><td>< myszy strong>C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Laboratorium Jacksona Przeciwciało</td><td></td> monoklonalne 000664 <td></td></tr><tr><td>CD117 (c-Kit), PE (klon: 2B8)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK BIOINK (wkład 3 x 3 mL)</td><td>CELLINK LLC</td><td>IK1020000303</td><td></td></tr><tr><td>Środek sieciujący CELLINK CaCl2 - sterylna butelka 1 x 60 mL</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td>CL1010006001</tr><tr><td>CELLINK Puste wkłady 3cc z nasadkami końcowymi i końcówkowymi</td><td>CELLINK LLC</td><td>CSC0103000102</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK HeartWare na PC</td><td>CELLINK</td><td>LLC wersja 2.4.1</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK INKREDIBLE+ BIODRUKARKA 3D</td><td>CELLINK LLC</td><td>S-10003-001</td><td></td></tr><tr><td>CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 22G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td> NZ4220005001</tr><tr><td>CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 25G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4250005001 <tr><td>CELLINK Sterylne standardowe stożkowe dysze do biodruku 27G</td><td>CELLINK LLC</td><td></td><td></td></tr> NZ4270005001 <tr><td>Zestaw do proliferacji komórek II (XTT) (Roche)</td><td>Wirówka 11465015001</td><td></td><td></td>Sigma Aldrich</tr><tr><td>(stołowa)</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Gwiazda Corning&nbsp; 96 Well Clear, płaskodenna, nieobrobiona mikropłytka PS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3370</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Binder GmbH, Niemcy</td><td>9040-0113</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy CytoFLEX</td><td>Beckman Coulter</td><td>A00-1-1102</td><td></td></tr><tr><td>D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem)</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-390-7100GM</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml polistyrenowe probówki stożkowe, sterylne</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml polistyrenowe probówki stożkowe, sterylne</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FceR1 alfa przeciwciało monoklonalne, APC (klon: MAR-1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, ciepło dezaktywowane</td> oprogramowanie <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12484028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson & Co. USA</td><td>Wersja 10.6.2</td><td></td></tr><tr><td>G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>Wersja 8.4.3</td><td></td></tr><tr><td>H</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer (ulepszona Neubauer 0,1 mmm głębokości poboru)</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Sól sodowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>I</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodonitrotetrazolium chlorek (INT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I10406-5G</td><td></td></tr><tr><td>L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>L-mleczan litu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2250-100G</td><td></td></tr><tr><td>M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne 100 ml 100x (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1-metoksy-5-metylofenazynosiarczan metylu (MPMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8640</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki (1,7 ml przezroczyste)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki (2,0 ml przezroczyste)</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Academic (do produkcji ultraczystej wody MilliQ)Millipore</td><td></td> <td>ZMQS60001</td><td></td></tr><tr><td>N</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 90 mm Jednostka filtrująca (0,2 mm Wielkość porów, 500 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Nalgene (0,2 mm PES, 25 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>725-2520</td><td></td></tr><tr><td>P</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna 100 ml (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4, bez wapnia/magnezu, 500 ml (Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny, 1,0 mg/ml (invitrogen)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (klon: eB149/10H5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-3</td><td>PeproTech, Inc.&nbsp;</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1X + 2,05 mM L-glutamina (Hyklon)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30027.01<</td><td></td></tr><tr><td>strong>S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sarstedt 96-dołkowa okrągła podstawa PS przezroczysta mikropłytka testowa (82.1582.001)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9913213</td><td></td></tr><tr><td>Azek sodu, 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM) 100X (Gibco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (2-amino-2(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego (0,4%, do mikroskopii)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>V</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy VARIOSKAN LUX (typ: 3020)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture

Trójwymiarowy (3D) biodruk wykorzystuje kompozyty na bazie hydrożelu (lub atramenty biomateriałowe), które są osadzane we wzorze, tworząc podłoże, na którym osadzane są komórki. Ponieważ wiele atramentów biomateriałowych może być potencjalnie cytotoksycznych dla komórek pierwotnych, konieczne jest określenie biokompatybilności tych kompozytów hydrożelowych przed ich wykorzystaniem w kosztownych procesach inżynierii tkankowej 3D. Niektóre metody hodowli 3D, w tym biodrukowanie, wymagają osadzenia komórek w matrycy 3D, co utrudnia ekstrakcję i analizę komórek pod kątem zmian w żywotności i ekspresji biomarkerów bez wywoływania uszkodzeń mechanicznych. Protokół ten opisuje jako dowód koncepcji, metodę oceny biokompatybilności kompozytu agarozowego osadzonego w krystalicznej nanocelulozie (CNC), wytworzonego w 24-dołkowym systemie hodowli, z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy (BMMC) przy użyciu testów cytometrii przepływowej dla żywotności komórek i ekspresji biomarkerów.
Po 18 godzinach ekspozycji na matrycę CNC/agarozy/D-mannitolu, żywotność BMMC pozostała niezmieniona, mierzona przepuszczalnością jodku propidyny (PI). Jednak BMMC hodowane na stylu <span="font-size: 14px;">Substrat CNC/agarozy/D-mannitolu wydawał się nieznacznie zwiększać ekspresję receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI) i receptora czynnika komórek macierzystych (Kit; CD117), chociaż nie wydaje się, aby było to zależne od ilości CNC w kompozycie z biotuszu. Żywotność BMMC oceniono również po ekspozycji w czasie na rusztowania hydrożelowe, które zostały wytworzone z komercyjnego tuszu biomateriałowego składającego się z nanocelulozy fibrylarnej (FNC) i alginianu sodu przy użyciu biodrukarki wytłaczanej 3D. W okresie od 6 do 48 godzin substraty FNC/alginianu nie wpływały negatywnie na żywotność BMMC określoną za pomocą cytometrii przepływowej i testów mikromiareczkowych (XTT i dehydrogenaza mleczanowa). Protokół ten opisuje skuteczną metodę szybkiego badania biochemicznego kompatybilności potencjalnych atramentów biomateriałowych pod kątem ich użyteczności jako rusztowań 3D do wysiewu po wydruku z komórkami tucznymi.

Jedną z najważniejszych cech skutecznego tuszu biomateriału lub podłoża hodowlanego jest biokompatybilność. Przede wszystkim podłoże nie może indukować śmierci komórkowej. Istnieje kilka metod opartych na mikropłytkach oraz metod cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania żywotności i nekrozy komórek; jednak metody te nie nadają się do analizy komórek zatopionych w macierzy hydrożelowej. W niniejszym protokole powyższe ograniczenie omija się poprzez wysiewanie BMMCs na podłoże hydrożelowe lub wydrukowany biologicz...

Ten protokół podkreśla metodę szybkiej oceny biokompatybilności krystalicznego tuszu biomateriałowego z nanocelulozy (CNC)/agarozy z komórkami tucznymi pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy pod względem żywotności komórek i fenotypowej ekspresji receptorów powierzchniowych komórki, Kit (CD117) i receptora IgE o wysokim powinowactwie (FcεRI).

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Three-dimensional (3D) bioprinting utilizes hydrogel-based composites (or biomaterial inks) that are deposited in a pattern, forming a substrate onto ...

Protokół ten oferuje łatwe i szybkie podejście do badania potencjalnych atramentów biomateriałowych pod kątem potencjalnych skutków cytotoksycznych wobec wrażliwych komórek pierwotnych i odpornościowych przed złożonymi eksperymentami biodruku 3D. Po inkubacji komórek odpornościowych na konstruktach atramentu biomateriałowego, komórki można łatwo odzyskać z konstruktów poprzez delikatne mycie w celu przeprowadzenia dalszych analiz cytotoksyczności lub biomarkerów. Protokół ten ma bezpośrednie znaczenie dla inżynierii tkankowej, w której biodrukowane tkanki przeznaczone do przeszczepu muszą być zbudowane z komórek pierwotnych i biokompatybilnych atramentów biomateriałowych.Aby rozpocząć, przygotuj bio wkład atramentowy do instalacji na biodrukarce 3D INKREDIBLE+. Najpierw usuń niebieskie zaślepki z trzymililitrowego wkładu z atramentem z biomateriału i przymocuj sterylną stożkową dyszę do biodruku o średnicy 22 mm do końcówki Luer lock wkładu z atramentem biologicznym. Podłącz rurkę doprowadzającą powietrze do głowicy drukującej pierwszej lub PH1 do przeciwległego końca wkładu i włóż kasetę z dołączoną stożkową dyszą do biodruku do pionowej szczeliny PH1.Następnie mocno osadź wkład w PH1 za pomocą stożkowej dyszy biodrukującej wystającej poniżej głowicy drukującej. Dokręć na PH1 zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż dokręci palec, aby zablokować wkład z atramentem biologicznym na miejscu. Należy pamiętać, że biodruk 3D można wykonać przy pustym PH2.Włącz biodrukarkę i uruchom oprogramowanie biodrukarki na komputerze podłączonym do biodrukarki 3D za pomocą USB 2.0. W oprogramowaniu kliknij przycisk połącz, aby zsynchronizować go z biodrukarką 3D. Zwróć uwagę na trzy opcje w głównym menu sterowania biodrukarki 3D.Najpierw przygotuj bioprint. Po drugie, menu narzędzi. I po trzecie, ekran stanu.Wybierz opcję przygotowania bioprintu, a następnie przewiń w dół i wybierz opcję osi głównych. Po pomyślnej kalibracji osi XYZ wysokość stołu roboczego nieznacznie się obniży, a głowice drukujące przemieszczą się powyżej punktu środkowego stołu roboczego. Aby kontynuować kalibrację punktu początkowego dla biodruku na płytkach 24-dołkowych, wyjmij sterylną 24-dołkową płytkę hodowlaną z jej szczelnego plastikowego opakowania i zaznacz kropkę w środkowym punkcie basenika D1 na spodniej stronie płytki trwałym markerem.Zdejmij pokrywę płytki i umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną na stole roboczym w pozycji D1 znajdującej się w lewym przednim rogu stołu roboczego. W głównym menu sterowania wybierz menu narzędzi, a następnie przesuń oś. Przesuwaj głowice drukujące w krokach co jeden milimetr wzdłuż osi X i Y, aż stożkowa dysza biodrukująca PH1 znajdzie się bezpośrednio nad kropką oznaczoną pod studzienką D1. W razie potrzeby dostosuj położenie stożkowej dyszy do biodruku nad kropką, przesuwając głowice drukujące w krokach co 0,1 milimetra.Zapisz współrzędne X i Y stożkowej dyszy do biodruku, gdy znajduje się bezpośrednio nad środkiem studzienki D1, jak wskazano na ekranie panelu sterowania biodrukarki 3D i zaznacz współrzędne. Następnie podnoś stół roboczy w krokach co jeden milimetr, aż dno studzienki D1 prawie dotknie stożkowej dyszy biodrukującej zainstalowanej w głowicy drukującej. W razie potrzeby dostosuj ruch stołu roboczego w krokach co 0,1 milimetra.Z menu narzędzi wybierz opcję kalibracji osi Z, a następnie wybierz i potwierdź opcję zapisz kalibrację Z. Wróć do menu głównego i wybierz opcję przygotowania bioprintu. Przewiń w dół i wybierz opcję kalibracji Z.Zaktualizuj kod geometryczny płytki 24-dołkowej lub kod G, podając prawidłowe współrzędne punktu początkowego. Otwórz dostarczony 24-dołkowy plik G-code w oprogramowaniu bioprint. Zaktualizuj współrzędne X i Y w pierwszym wierszu przy użyciu wartości uzyskanych w poprzednich krokach i zapisz plik pod nową nazwą.Upewnij się, że pompa pneumatyczna jest szczelnie podłączona do tylnego portu wlotu powietrza biodrukarki INKREDIBLE+3D i włącz ją. Wyciągnij przednie pokrętło sterujące znajdujące się po prawej stronie biodrukarki INKREDIBLE+3D. Upewnij się, że cyfrowe manometry PH1 i PH2 znajdujące się z przodu biodrukarki wskazują wartość bliską zeru kilopaskala.Powoli obracaj przednie pokrętło sterujące zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ciśnienie wskazane na lewym manometrze dla PH1 osiągnie 12 kilopaskalów. Umieść złożoną bibułkę lub kawałek wodoodpornej folii uszczelniającej pod dyszą drukującą zainstalowanej kasety, uważając, aby nie dotknąć dyszy drukującej. Z głównego menu sterowania na biodrukarce 3D wybierz opcję przygotuj biodruk.Przejdź do i wybierz opcję włącz PH1. Zwróć uwagę, że atrament biologiczny zaczyna wytłaczać się z dyszy drukującej. W razie potrzeby zwiększ ciśnienie wytłaczania, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż atrament biologiczny zostanie wytłoczony w ciągłym żarniku i zapisz nowe ustawienie ciśnienia.Wybierz opcję wyłącz PH1, aby zatrzymać wytłaczanie atramentu biologicznego. Usuń bibułkę lub folię zawierającą wytłaczany atrament biologiczny ze stołu roboczego i zamknij drzwiczki biodrukarki. Aby wykonać biodruk 3D prostoliniowych podłoży hydrożelowych w formacie płytki 24-dołkowej, wybierz menu narzędzi z głównego menu sterowania, a następnie wybierz opcję wyłącz drukowanie SD, co pozwoli oprogramowaniu biodrukarki przesyłać pliki G-code do biodrukarki 3D w celu wydrukowania.Kliknij przycisk ładowania w oprogramowaniu biodrukarki i wybierz zaktualizowany plik G-code z 24-dołkową płytką. W panelu sterowania po prawej stronie w oprogramowaniu wybierz zakładkę podglądu wydruku i kliknij przycisk drukowania, aby rozpocząć biodrukowanie w dołku D1. Po zakończeniu biodrukowania konstruktów prostoliniowych przykryj 24-dołkową płytkę pokrywką i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Zanurz każdy prostoliniowy konstrukt w dwóch kroplach sterylnego 50-milimolowego roztworu chlorku wapnia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Ostrożnie odessać roztwór chlorku wapnia z każdej studzienki i spłukać raz na jeden mililitr 1X PBS, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia. Aby zapobiec odwodnieniu biodrukowanych konstruktów hydrożelowych, utrzymuj biodrukowane w 3D prostoliniowe konstrukcje w świeżym 1X PBS, aż komórki tuczne pochodzące ze szpiku kostnego będą gotowe do zasiania na konstruktach. Na podstawie parametrów rozproszenia do przodu i bocznego BMMC analizowanych za pomocą cytometrii przepływowej zaobserwowano, że podłoże hydrożelowe o najwyższym stężeniu CNC nie zmieniło natywnej wielkości ani ziarnistości BMMC w porównaniu z BMMC hodowanymi przy braku substratów hydrożelowych CBD z agarozy CNC.Analiza cytometryczna przepływowa przepuszczalności BMMC dla jodku propidyny wykazała, że żadne z badanych stężeń CNC nie wywołało żadnego niekorzystnego wpływu na żywotność BMMC. Substrat agarozy CNC zwiększał ekspresję biomarkerów komórek tucznych przy stężeniach CNC większych lub równych 2,5%Jednak poziomy ekspresji tych receptorów pozostały stosunkowo stałe między 2,5% a 12,5% CNC, co sugeruje efekt niezależny od stężenia CNC. Test XTT wykazał, że aktywność metaboliczna BMMC hodowanych na biodrukowanych rusztowaniach hydrożelowych 3D pozostawała stosunkowo spójna na poziomie około 100% we wszystkich badanych punktach czasowych.Podobnie, testy uwalniania LDH i wykluczania barwnika PI nie wykazały żadnych znaczących zmian w żywotności BMMC. Zwrócenie szczególnej uwagi na wybór miernika dyszy drukującej, kalibrację osi biodrukarki 3D i ustawienie ciśnienia wytłaczania zapewnią powtarzalne drukowanie wysokiej jakości konstrukcji 3D. Łatwość, z jaką można odzyskać komórki tuczne, pozwala na ich badanie za pomocą szerokiego zakresu testów biologicznych w celu dalszego badania dowolnego aspektu ich funkcji komórkowych.

fabrication-crystalline-nanocellulose-embedded-agarose-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Arias, S. L. i in. Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstek tlenku żelaza.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje produkcję nanocelulozy poprzez hodowlę bakterii produkujących celulozę w medium odżywczym zawierającym mannitol. Bakterie metabolizują mannitol do glukozy, która następnie jest polimeryzowana i wytłaczona jako łańcuchy glukanowe, krystalizujące się w arkusze celulozy, tworząc trójwymiarową macierz na styku powietrze–ciecz.

Przygotowanie bakteryjnych pelikuli nanocelulozy z bakterii produkujących celulozę

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia magnetycznej bakteryjnej nanocelulozy (BNC) do zastosowań w rekonstrukcji uszkodzonych naczyń krwionośnych. BNC został zsyntetyzowany przez szczep G. xylinus. Z drugiej strony, namagnesowanie BNC zostało zrealizowane poprzez wytrącanie in situ jonów żelazawychFe2+ i Fe3+ wewnątrz siatki BNC.

Wytwarzanie funkcjonalizowanej magnetycznej nanocelulozy bakteryjnej z nanocząstkami tlenku żelaza

Analogi chrząstki i skóry zostały wydrukowane biodrukiem za pomocą biotuszu na bazie nanocelulozy i alginianu. Biotusze zostały poddane celaryzacji przed drukowaniem za pomocą jednostopniowej pasywnej jednostki mieszającej. Wykazano, że konstrukty są jednolicie ukomórkowane, mają wysoką żywotność i wykazują korzystne markery różnicowania.

Bioprinting analogów chrząstki i tkanki skórnej z wykorzystaniem nowatorskiej techniki pasywnego mieszania do precelularyzacji biotuszu

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Trzy kluczowe kroki tego protokołu to: i) opracowanie właściwego składu i konsystencji tuszu hydrożelowego celulozy, ii) drukowanie 3D rusztowań w różnych strukturach porów z dobrą wiernością kształtu i wymiarów oraz iii) demonstracja właściwości mechanicznych w symulowanych warunkach ciała do regeneracji chrząstki.

Drukowane w 3D porowate rusztowania hydrożelowe z celulozy nanokompozytowej

Przedstawiona tutaj jest metoda biodruku 3D żelatyny metakryloilo.

Protokoły biodruku 3D biotuszy na bazie żelatyny i hydrożelu metakryloylowego

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Przetwarzanie ścinaniem podczas tworzenia hydrożelu powoduje produkcję zawiesin mikrożelowych, które są cienkie jak ścinanie, ale szybko się restrukturyzują po usunięciu sił ścinających. Materiały te zostały wykorzystane jako matryca nośna do biodruku złożonych, obciążonych komórkami struktur. W tym miejscu opisano metody stosowane do produkcji łoża nośnego oraz kompatybilne biotusze.

Płynne żele agarozowe utworzone przez obróbkę ścinającą podczas żelowania do zawieszonego biodruku 3D

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Poznaj metodę oceny biokompatybilności atramentów biologicznych z nanocelulozą krystaliczną i agarozą w hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Protokół umożliwia szybkie badanie cytotoksyczności.

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie krystalicznego atramentu z biomateriału agarozowego z nanocelulozą do hodowli komórek tucznych pochodzących ze szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów