Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek w ramach projektu CLARITY

Protokół ten pozwoli naukowcom odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące wzorców połączeń neuronalnych i organizacji przestrzennej, które leżą u podstaw funkcji w obwodzie. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację morfologii neuronów zlokalizowanych głęboko w nienaruszonej trójwymiarowej tkance. Ta metoda jest prosta, a tym samym łatwa do odtworzenia.

Początkujący eksperymentatorzy powinni czuć się komfortowo wykonując tę technikę. Konieczne jest posiadanie czystej próbki tkanki w celu uzyskania wysokiej jakości danych. Wizualna demonstracja odpowiedniej przejrzystości tkanek i technik oczyszczania umożliwi łatwe do odtworzenia wyniki.

Na początek umieść zanurzoną w hydrożelu tkankę mózgową w inkubatorze próżniowym na trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy próżni minus 90 kilopaskalów. Pozostaw górną część rurki odkręconą, aby próżnia mogła się prawidłowo wytworzyć. Myj chusteczkę PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.

Umieść spolimeryzowaną próbkę tkanki w komorze elektroforetycznej, śledząc orientację tkanki w komorze. Napełnij komorę i zbiornik dostarczonym buforem SDS do elektroforezy. Uruchom próbkę przy napięciu 70 woltów, jednym amperze i 35 stopniach Celsjusza ze stałym prądem przez około dwie godziny na mililitr tkanki.

Okresowo sprawdzaj próbkę pod kątem wystarczającego oczyszczenia tkanki mózgowej, wyjmując ją z komory i umieszczając w tej samej orientacji. Po zakończeniu oczyszczania próbki należy ją umyć w PBS przez noc w temperaturze pokojowej, zastępując PBS świeżym PBS tak często, jak to możliwe. Po ostatnim umyciu w PBS myj chusteczkę przez pięć minut w dejonizowanej wodzie o temperaturze pokojowej trzy razy.

Tkanka stanie się nieprzezroczysta i może się rozszerzać. Inkubować tkankę w roztworze dopasowania współczynnika załamania światła przez co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji należy skonstruować odpowiednią komorę do obrazowania próbki.

Zacznij od użycia szklanej prowadnicy jako podstawy do montażu, a następnie połóż gumowe lub plastikowe przekładki i zabezpiecz je super klejem, upewniając się, że nie ma żadnych otworów. Umieść przezroczystą tkankę w komorze montażowej wstępnie wypełnionej roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła. Bezpiecznie zamocuj chusteczkę, umieszczając na niej szklane szkiełko nakrywkowe i uszczelniając je lakierem do paznokci.

Zobrazuj tę tkankę, dodając kroplę roztworu montażowego pasującego do współczynnika załamania światła bezpośrednio na powierzchni szkła. Aby zbudować dużą komorę do obrazowania tkanek dla tkanek o grubości większej niż pięć milimetrów, użyj 10-centymetrowego szklanego naczynia o wysokiej ściance. Umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów pośrodku, upewniając się, że średnica rurki jest wystarczająco duża, aby pomieścić tubus używanej soczewki obiektywu.

Zrób 3% agarozy w wodzie i wlej ją do przestrzeni między szklanym naczyniem a stożkową rurką, a następnie pozwól jej ostygnąć przez godzinę. Utworzy to pierścień z litej agarozy. Bezpiecznie przyklej tkankę do dna komory za pomocą super kleju i wypełnij komorę roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła, który może zacząć polimeryzować, chyba że zostanie zachowany przed powietrzem i przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Uzyskaj obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego. Włącz wszystkie odpowiednie urządzenia do przetwarzania obrazu. Umieść próbkę na stoliku.

Ostrożnie podejdź do mediów zanurzeniowych z obiektywem i uformuj ciągłą kolumnę mediów. Korzystając z epifluorescencji, znajdź odpowiednie pole obrazowania. Zacznij od ustawienia rozdzielczości i szybkości skanowania.

W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego należy całkowicie zamknąć otwór otworkowy, aby uzyskać najmniejszy przekrój optyczny, a tym samym najlepszą rozdzielczość Z. Stopniowo zwiększaj moc lasera lub wzmocnienie czujnika, aż do uzyskania odpowiedniego obrazu o wysokim stosunku sygnału do szumu. Jeśli korzystasz ze standardowego obrazowania dwukolorowego EGFP lub tdTomato, ustaw ustawienia zbierania światła.

Ustaw parametry stosu Z na podstawie obserwowanych punktów początkowych i końcowych tkanki. Ustaw rozmiar kroku na podstawie żądanej rozdzielczości Z. Mniejsze rozmiary kroków zapewnią większą rozdzielczość Z, ale mogą prowadzić do wybielania próbki.

Jeśli ustawienia akwizycji obrazu są zadowalające, uzyskaj obraz. Upewnij się, że obraz ma wysoki stosunek sygnału do szumu i pokazuje wyraźne granice struktur. Po pozyskaniu obrazu reprezentatywna morfologia komórki została przeanalizowana przy użyciu wbudowanych statystyk i skryptów klasyfikujących w oprogramowaniu analitycznym.

Zebrane dane wskazują, że Neuron 2 ma strukturę większą niż dendrytyczna i większą gęstość kolców w porównaniu do Neuronu 1. Aby uzasadnić ten wynik, przeprowadzono standardową analizę Scholla, która potwierdza, że Neuron 2 jest bardziej złożony dendrytycznie niż Neuron 1, co wskazuje zwiększona liczba przecięć Scholla w odległości od 50 do 100 mikrometrów od somy. Neuron 1 zawiera większą część kolców o kształtach podobnych do filopodiów i jest podtypem niedojrzałego kręgosłupa.

Kolce z zarysowanymi głowami, zwane kolcami grzybów, prawdopodobnie zawierają bardziej rozwinięte i dojrzałe synapsy. Dzięki temu Neuron 2 jest bardziej dojrzały i ma większą gęstość dojrzałych kolców. Po oczyszczeniu fragmenty tkanki można wybarwić przy użyciu tradycyjnej immunohistochemii.