Name: Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę CUT&Tag do profilowania modyfikacji histonowych H3K4me3 w roślinach. Technika ta umożliwia izolację jąder komórkowych i analizę epigenomową z wysoką efektywnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana finansowo przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) oraz projekt JCIC-MCP.

1. Przygotowanie transpozazy i roztworów podstawowych (Dzień 1)
UWAGA: W tej części, adaptery oligonukleotydowe są skompleksowane z transpozazą Tn5 w celu wytworzenia aktywnej transpozazy.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć startery (starter A, starter B i primer C) do stężenia 100 μM przy użyciu buforu do wyżarzania (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji o sekwencji starterów i Tabela 2 w celu uzyskania receptur roztworów roboczych). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Ustaw następujące dwie reakcje w probówkach PCR: Reakcja 1 (adapter AB), 10 μL 100 μM startera A, 10 μL 100 μM startera B; Reakcja 2 (adapter AC), 10 μL 100 μM startera A, 10 μL 100 μM startera C.</li>
	<li>Wyżarzać adaptery w maszynie PCR za pomocą następującego programu: pokrywka termiczna (102 °C), 75 °C przez 15 min, 60 °C przez 10 min, 50 °C przez 10 min, 40 °C przez 10 min, 25 °C przez 30 min. 
	UWAGA: Adaptery są częściowo dwuniciowymi cząsteczkami DNA (stężenie = 50 pmol/μL).</li>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml należy przeprowadzić następującą reakcję: 10 μl transpozazy pA-Tn5 (500 ng/μL lub 7,5 pmol/μL), 0,75 μl adaptera AB (50 pmol/μL), 0,75 μl adaptera AC (50 pmol/μL), 7 μL buforu sprzęgającego. Delikatnie pipetować 20x, aby dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę. Końcowe stężenie transpozazy = 4 pmol/μL. Przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Stosunek molowy adaptera AB: adapter AC: transpozaza = 0,5:0,5:1.</li>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe zgodnie z recepturami podanymi w Tabeli 2 i autoklawować lub przefiltrować roztwory podstawowe w celu sterylizacji.</li>
	<li>Autoklaw i sterylizuj nożyczki, bibułę filtracyjną, sito ze stali nierdzewnej, moździerz, tłuczki itp.</li>
</ol>
2. Izolacja jąder (Dzień 2)
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Na każdy 1 g materiału wyjściowego (liście bawełny) przygotować 25 ml buforu do izolacji jądrowej A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 ml buforu do izolacji jądrowej B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 ml buforu do płukania jądrowego (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyna, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%), 1 ml buforu przeciwciał (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyna, 1 mg/ml BSA, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitonina). Pozostaw probówki na lodzie do czasu użycia.</li>
	<li>Zmielić świeże liście (~1 g) w ciekłym azocie na drobny proszek i przenieść do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej A.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór buforowy i inkubuj probówkę na lodzie przez 5 minut, delikatnie wstrząsając, aby równomiernie rozprowadzić materiał.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 rcf w temperaturze 4 °C, aby uformować osad komórkowy.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 20 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej B uzupełnionego 0,5% Tritonem X-100. Delikatnie odwróć rurkę, aby całkowicie zawiesić granulkę. 
	UWAGA: 20 ml bufor izolacji jądrowej B ma zastosowanie do 1 g materiału wyjściowego, a objętość tę można odpowiednio zwiększyć.
	<ol>
		<li>Wykonać test pilotażowy w celu zbadania wpływu stężenia szeregowego Triton X-100 (np. 2 ml buforu do izolacji jądrowej B, każdy z 0,1%, 0,25%, 0,5% i 1% Triton X-100 na 100 mg rozdrobnionych tkanek). Na odpowiednie stężenie Triton X-100 wskazuje nagromadzenie białych/szarych jąder na dnie i ciemnozielony supernatant po lizie i odwirowaniu na niskiej prędkości (< 500 rcf przez 4 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltruj powstały lizat komórkowy za pomocą kombinacji dwóch sit: sita o oczkach 500 na górze, aby usunąć większe resztki tkanki, i sita o oczkach 1000 na dole, aby zebrać jądra. 
	UWAGA: Wybierz odpowiedni rozmiar oczek dla sit w zależności od wielkości jąder roślin.</li>
	<li>Użyj sterylnej bibuły filtracyjnej z tyłu sita, aby wchłonąć drobne resztki komórek w lizacie.</li>
	<li>Pozostałe jądra zawierające lizat przenieść z górnej strony sita o oczkach 1000 do czterech świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C w celu zebrania jąder.</li>
	<li>Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą końcówki pipety i przemyć osad buforem do przemywania jądrowego.</li>
	<li>Dodać 800 μl buforu do płukania jądrowego i delikatnie odwrócić probówki, aby ponownie zawiesić osad. Ponownie obracać rurkę przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wykonaj w sumie 3 prania.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Zobrazuj jądra pod mikroskopem w celu barwienia DAPI.
	<ol>
		<li>Przenieść 100 μl zawiesiny jąder w buforze do płukania jądrowego z etapu 2.11. do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 900 μl buforu do przemywania jądrowego i 2 μl roztworu podstawowego DAPI (1 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie robocze 2 μg/ml dla DAPI. Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po barwieniu wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C w celu zebrania jąder.</li>
		<li>Usunąć jak najwięcej supernatantu za pomocą końcówki pipety. Przemyć 3 razy 800 μl buforu do przemywania nuklearnego.</li>
		<li>Usunąć jak najwięcej supernatantu i ponownie zawiesić jądra za pomocą 100 μl buforu do płukania jądrowego.</li>
		<li>Zobrazuj jądra pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą kanału DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz jądra z dwóch probówek (~50 μl objętości jąder w każdej probówce o pojemności 1,5 ml). Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć jak najwięcej pozostałego buforu za pomocą końcówki do pipety.</li>
</ol>
3. Inkubacja przeciwciał
<ol>
	<li>Zawiesić każde 50 μl jąder w probówce o pojemności 1,5 ml z 1 ml buforu przeciwciał.</li>
	<li>Ustaw następujące reakcje w probówkach o pojemności 1,5 ml: dwie kontrpróby biologiczne grup kontrolnych IgG ze 150 μl jąder (~ 1 μg chromatyny) i 2 μl IgG (1 mg / ml) w każdej probówce, dwie kontrpróby biologiczne grup testowych H3K4me3 z 150 μl jąder i 2 μl przeciwciała anty-H3K4me3 (1 mg / ml) w każdej probówce.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać roztwór i pozostawić probówki na poziomym wytrząsarce do hybrydyzacji przez noc w temperaturze 4 °C i 12 obr./min.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Przygotować świeże 50 ml buforu do przemywania immunoprecypitacji (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitoniny) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Pozostaw probówkę na lodzie.</li>
	<li>Odwirowywać probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor przeciwciał z każdej probówki.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 800 μl buforu do płukania IP i delikatnie wymieszać. Pozostaw probówki na wytrząsarce poziomej na 5 minut w temperaturze pokojowej i 12 obr./min.</li>
	<li>Po umyciu odwirować probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą końcówki do pipety. 
	UWAGA: Aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń w osadzie jąder, należy pozostawić ~50-80 μL buforu z jądrami.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.6.-3.7. jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Po trzecim płukaniu wirować przez 2 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć pozostały bufor w jak największym stopniu.</li>
</ol>
4. Inkubacja transpozazy
<ol>
	<li>Przygotować świeży 1 ml buforu do inkubacji transpozazy (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 0,05% w/v digitoniny) mieszając 1 ml buforu do przemywania IP z 30 μl 5 M NaCl.</li>
	<li>Aby przygotować mieszaninę transpozazy Tn5 do inkubacji, należy dodać 1 μl transpozazy do każdych 150 μl buforu do inkubacji transpozazy. 
	UWAGA: Najpierw przygotować mieszaninę roztworu transpozazy zgodnie z liczbą reakcji, a następnie dodać podwielokrotność 150 μl do każdej probówki.</li>
	<li>Zawiesić jądra w 150 μl roztworu transpozazy.</li>
	<li>Pozostaw probówki na wytrząsarce poziomej przy 12 obr./min przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej i mieszaj co 10-15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji transpozazy odwirowywać probówki przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć bufor do inkubacji transpozazy z każdej probówki.</li>
	<li>Umyj probówki buforem do płukania IP. W tym celu dodaj 800 μl buforu do płukania IP do każdej probówki, delikatnie wymieszaj i pozostaw probówki na poziomym wytrząsarce z prędkością 12 obr./min na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przez 4 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6.-4.7. jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Po trzecim płukaniu wirować przez 2 minuty w temperaturze 300 rcf w temperaturze 4 °C. Usunąć pozostały bufor w jak największym stopniu.</li>
</ol>
5. Oznaczanie
<ol>
	<li>Świeżo przygotować 2 ml buforu znakującego (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM spermidyny, koktajl inhibitorów proteazy 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% w/v digitoniny) mieszając 2 ml buforu do przemywania IP z 60 μl 5 M NaCl i 20 μL 1 M MgCl2.</li>
	<li>Zawiesić jądra za pomocą 300 μl buforu znakującego.</li>
	<li>Wymieszać roztwór i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu znakowania.</li>
	<li>Zatrzymaj znakowanie za pomocą 10 μL 0,5 M EDTA (stężenie końcowe ~15 mM) i 30 μL 10% SDS (stężenie końcowe 1%).</li>
</ol>
6. Ekstrakcja DNA i budowa biblioteki NGS
<ol>
	<li>Dodać 300 μl buforu do ekstrakcji DNA CTAB zgodnie z opisem7. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 30 minut. Odwróć do mieszania co ~10 min.</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 600 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1). Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Wstępnie odwirować probówki z żelem z blokadą fazową przez 2 minuty w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C. Przenieść powyższy roztwór do probówek z żelem z blokadą fazy.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (~600 μL) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 600 μl chloroformu do każdej probówki. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant (~600 μL) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodaj 12 μl 100% etanolu i 2 μl GlycoBlue Coprecipitant. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant. Przemyć osad DNA przy użyciu 75% (v/v) etanolu i odwirować przez 5 minut w temperaturze 13 000 rcf w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant. Wysuszyć na powietrzu osad DNA i ponownie zawiesić DNA w 25 μl ddH2O.</li>
	<li>Ustaw reakcję PCR w następujący sposób. Aby uzyskać łącznie 50 μl reakcji, dodaj 24 μl DNA, 11 μl ddH2O, 10 μl buforu 5x TAE, 2 μl startera P5 (10 μM), 2 μl startera P7 (10 μM) i 1 μl enzymu TruePrep Amplify. Program PCR: 72 °C przez 3 min, 98 °C przez 30 s; następnie 14 cykli w temperaturze 98 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, a następnie 72 °C przez 5 min. 
	UWAGA: Nie można pominąć pierwszych 72 °C przez 3 minuty w celu przedłużenia. Nadmierna amplifikacja biblioteki doprowadzi do wysokiego poziomu duplikatów PCR w NGS. Zacznij od 12-14 cykli PCR w reakcji PCR dla H3K4me3 przy użyciu ~1 μg chromatyny w każdej reakcji.</li>
	<li>Załaduj 2 μl produktów PCR na 1,5% żelu agarozowym do elektroforezy.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR za pomocą komercyjnych kulek magnetycznych do oczyszczania DNA.</li>
	<li>Określ ilościowo bibliotekę za pomocą fluorometru i elektroforezy w żelu agarozowym. 
	UWAGA: Efektywne stężenie biblioteki powinno wynosić >2 nM metodą qPCR, aby zapewnić dobrą jakość.</li>
	<li>Wykonuj sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) i analizę danych.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie pozostają w konflikcie interesów z żadną firmą handlującą jednym z wyżej wymienionych produktów.

W tym miejscu opisaliśmy CUT&Tag, technologię generowania bibliotek DNA w wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek przy użyciu uproszczonej procedury w porównaniu z immunoprecypitacją chromatyny (ChIP). Nasz sukces w profilowaniu H3K4me3 w liściach bawełny sugeruje, że CUT&Tag, który po raz pierwszy został zaprojektowany dla komórek zwierzęcych, może być również stosowany do komórek roślinnych. Zarówno system buforowy Tris powszechnie stosowany w teście ChIP8...

Miejsca związane z czynnikiem transkrypcyjnym DNA i otwarta chromatyna związana ze znacznikami modyfikacji histonów pełnią kluczowe funkcje funkcjonalne w regulacji ekspresji genów i są głównymi celami badań epigenetycznych1. Konwencjonalnie, test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w połączeniu z głębokim sekwencjonowaniem (ChIP-seq) był stosowany do identyfikacji całego genomu specyficznej modyfikacji histonów chromatyny lub celów DNA z określonymi białkami i jest szeroko stosowany w dziedzinie epigenetyki2. Technologia CUT&Tag (Cleavage under targets and tagmentation) została pierwotnie opracowana przez Henikoff Lab w celu wychwytywania fragmentów DNA związanych z białkiem w całym genomie5. W porównaniu do ChIP, CUT&Tag może generować biblioteki DNA o wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek za pomocą uproszczonej procedury3. Do tej pory metody analizy regionów chromatyny ze specyficznymi modyfikacjami histonów za pomocą CUT&Tag zostały ustalone w komórkach zwierzęcych4,5. W szczególności jednokomórkowy CUT&Tag (scCUT&Tag) został również z powodzeniem opracowany dla tkanek i komórek ludzkich6. Jednak ze względu na złożoność ściany komórkowej i metabolitów wtórnych, CUT&Tag jest nadal wyzwaniem technicznym dla tkanek roślinnych. 
Poprzednio opisaliśmy protokół CUT&Tag wykorzystujący nienaruszone jądra wyizolowane z allotetraploidalnych liści bawełny4. Aby zademonstrować skuteczność izolacji jąder i wychwytywania DNA za pomocą tkanki roślinnej, przedstawiono procedurę profilowania. Główne etapy obejmują izolację nienaruszonych jąder, inkubację in situ z przeciwciałem do modyfikacji chromatyny, inkubację transpozazy, integrację adaptora i przygotowanie biblioteki DNA. Rozwiązywanie problemów koncentruje się na przygotowaniu biblioteki CUT&Tag do izolacji jąder roślinnych i kontroli jakości. 
W tym badaniu prezentujemy udoskonaloną strategię CUT&Tag dla roślin. Nie tylko dostarczamy krok po kroku protokół profilowania H3K4me3 w liściach bawełny, ale także zapewniamy zoptymalizowaną metodologię izolacji jąder roślinnych, w tym strategię wyboru stężenia detergentu do prawidłowej lizy komórek oraz strategię filtrowania jąder. Szczegółowe kroki z krytycznymi komentarzami są również zawarte w tym zaktualizowanym protokole.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normalne królicze IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td></td><td></td><td>Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego BSA. Przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>digitonina (~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Przygotować 5% roztwór podstawowy digitoniny (200 mg digitoniny [~50% czystości] do 2 ml DMSO). Uwaga: Sterylizuj za pomocą filtra 0,22 mikrona. Przechowywać w temperaturze -20&deg; Kwas</td></tr><tr><td>C-dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td></td><td></td> <td>Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy EDTA (pH = 8,5). Uwaga: Przygotowanie 100 ml 0,5-M EDTA (pH = 8,5) wymaga około 2 g granulek wodorotlenku sodu (NaOH) w celu dostosowania pH</td></tr><tr><td>etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg / ml)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>chlorek magnezu (MgCl2)</td><td></td><td></td> <td>Przygotować 1 M MgCl2 koktajl</td></tr><tr><td>inhibitora proteazy</td> w roztworze podstawowym <td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu (KCl)</td><td></td><td></td><td>Przygotować 1 M roztwór podstawowy KCl</td></tr><tr><td>fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1,v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu (NaCl)</td><td></td><td></td><td>Przygotować 5 M roztworu podstawowego NaCl</td></tr><tr><td>spermidyny</td><td></td><td></td><td>Przygotować 2 M roztwór podstawowy spermidyny, przechowywać w temperaturze -20&C.</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)Przygotować</td><td></td><td></td> <td>10% roztwór podstawowy SDS. Uwaga: Nie sterylizować w autoklawie; sterylizować za pomocą filtra 0,22 mikrona</td></tr><tr><td>Podstawa</td><td></td><td></td> Tris <td>Zrobić 1 M Tris (pH = 8,0) roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Zrobić 20% roztwór podstawowy Triton X-100</td></tr> <tr><td><silny>enzym</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nadpobudliwy transpozaza pG-Tn5/pA-Tn5 do CUT& Etykietka</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Sprawdź powinowactwo przeciwciał białka A lub białka G, które jest połączone z Tn5. Ogólnie rzecz biorąc, białka A i G mają szerokie powinowactwo do przeciwciał. Jednak białko A ma stosunkowo większe powinowactwo do przeciwciał króliczych, a białko G ma stosunkowo wyższe powinowactwo do przeciwciał myszy. Wybierz odpowiednie produkty transpozazy, które pasują do Twojego przeciwciała.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp; spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-JEDEN-W</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie modyfikacji h3k4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Regulacja epigenomiczna na poziomie chromatycznym, w tym modyfikacje DNA i histonów, zachowania czynników transkrypcyjnych i niekodujących RNA z ich rekrutowanymi białkami, prowadzą do czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji genów. Rozszczepienie pod celami i znakowaniem (CUT&Tag) to metoda wiązania enzymatycznego, w której specyficzne białko chromatyny jest najpierw rozpoznawane przez jego specyficzne przeciwciało, a następnie przeciwciało wiąże białko fuzyjne transpozazy A (pA-Tn5), które rozszczepia docelową chromatynę in situ poprzez aktywację jonów magnezu. W tym miejscu przedstawiamy nasz wcześniej opublikowany protokół CUT&Tag wykorzystujący nienaruszone jądra wyizolowane z allortetraploidalnych liści bawełny z modyfikacją. Ten protokół krok po kroku może być wykorzystany do badań epigenomicznych na roślinach. Ponadto przedstawiono istotne modyfikacje izolacji jąder roślinnych wraz z krytycznymi uwagami.

Rycina 1 przedstawia schemat procedury CUT&amp;Tag. Rycina 2 pokazuje barwienie DAPI nienaruszonych jąder komórkowych. Celem etapu „izolacji jąder” było uzyskanie nienaruszonych jąder w ilości wystarczającej do przeprowadzenia następującej reakcji CUT&amp;Tag. Rycina 3 przedstawia elektroforezę produktów PCR w żelu agarozowym. Podczas przygotowywania eksperymentu konieczne jest równoległe zastosowanie ujemnej kontroli IgG. W porówna...

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Ogólnym celem eksperymentu była identyfikacja fragmentów DNA związanych z białkiem w całym genomie, które odzwierciedlały stan chromatyny. Aby osiągnąć ten cel, przeprowadzono trzy operacje specjalne. W pierwszej kolejności wyizolowano nienaruszone jądra z komórek roślinnych.Po drugie, modyfikacje chromatyny zostały rozpoznane przez specyficzne przeciwciało in situ. Po trzecie, przeciwciało wiążące białko fuzyjne transpozazy A, transpozaza Tn5, rozszczepia chromatynę in situ pod wpływem aktywacji jonów magnezu. Fragmenty DNA i miejsca wiązania modyfikacji chromatyny zostały następnie zintegrowane z adapterami i przygotowane do przygotowania DNA.Wzbogacenie reakcji łańcuchowej polimerazy usprawniło sekwencjonowanie generacji. Regulacja epigenomiki na poziomie chromatycznym, w tym modyfikacje DNA i histonów, zachowania czynników transkrypcyjnych i niekodujących RNA z ich rekrutowanymi białkami, prowadzą do czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji genów. Technologia CUT&Tag opracowana przez Henikoff Lab to metoda wiązania enzymów do profilowania epigenomiki chromatyny z wysoką wydajnością.Tutaj wykorzystujemy liście bawełny jako materiał doświadczalny, a jako przykład do profilowania chromatyny za pomocą przeciwciała trimetylacji histonu H3 lizyny-4. Dostarczamy udoskonalony protokół z wideo do działania CUT&Tag w zakładach. Do każdego przygotowania próbki za pomocą CUT&Tag pobrano gram tkanki liścia bawełny.Liść zmielono na drobny proszek z ciekłym azotem i przeniesiono do probówki sokoła o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej A. Roztwór buforowy delikatnie wymieszano, a probówkę inkubowano na lodzie przez pięć minut z delikatnym potrząsaniem, aby równomiernie rozproszyć materiał. Następnie wirowano go przy względnej sile odśrodkowej 500 lub rcf, w temperaturze 4 stopni Celsjusza, przez pięć minut, aby uformować osad komórkowy. Supernatant zdekantowano, a osad ponownie zawieszono w 20 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej B, uzupełnionego 0,5% Tritonem.Rurka została delikatnie odwrócona, aby całkowicie zawiesić pelis. Powstały lizat komórkowy został następnie przefiltrowany za pomocą kombinacji dwóch sit, a na wierzchu użyto sita o oczkach 500, aby usunąć większe resztki tkanki. A na dnie użyto sita o oczkach 1000 do zbierania jąder.Wybór odpowiedniej wielkości oczek sit zależy od wielkości jąder roślin. Sterylna bibuła filtracyjna została użyta z tyłu sita do wchłonięcia części lizatu i resztek małych komórek. Lizat zawierający jądra przeniesiono do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wirowano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty, w temperaturze 4 stopni Celsjusza w celu zebrania jąder.Po odwirowaniu używano końcówki pipety, aby usunąć jak najwięcej supernatantu. Dodano ilość 800 mikrolitrów, bufor do mycia jądrowego. Rurka została delikatnie odwrócona, aby ponownie zawiesić jądra.Probówkę ponownie obracano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po trzech płukaniach, powstałe jądra połączono w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wirowano z prędkością 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyto końcówki pipety, aby usunąć jak najwięcej pozostałego buforu.Kolejnym krokiem była inkubacja przeciwciała. Podwielokrotność 50 mikrolitrów jąder zawieszono ponownie w 1 mililitrze buforu przeciwciał uzupełnionego EDTA, BSA, koktajlem inhibitorów proteazy w digitoninie. Podwielokrotność 150 mikrolitrów zawiesiny jąder umieszczono w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra na jedną reakcję, do każdej probówki dodano dwa mikrolitry przeciwciała.W tym teście po dodaniu przeciwciała ustalono dwie kontrpróby biologiczne dla przeciwciała anty-histon-H3-lizyno-4-trimetylacji i grupy kontrolnej ujemnej immunoglobuliny G. Roztwór delikatnie wymieszano, a probówki pozostawiono na poziomej wytrząsarce do hybrydyzacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 12 obr./min. Następnego ranka probówki wyjęto, a jądra przemyto za pomocą 800 mikrolitrów buforu do przemywania immunostrącania.Probówkę delikatnie odwrócono do góry nogami w celu wymieszania i pozostawiono na wytrząsarce poziomej na pięć minut w temperaturze pokojowej przy 12 obr./min. Po umyciu rurkę wirowano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu supernatant usunięto za pomocą końcówki do pipety.Powtórzono to w sumie trzy prania. Po trzecim płukaniu probówkę obracano o 300 rcf przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a końcówka pipety była używana do usunięcia pozostałego buforu w jak największym stopniu. Przygotowanie mieszaniny transpozazy Tn5 do inkubacji.Jeden mikrolitr transpozazy dodano do każdych 150 mikrolitrów buforu do inkubacji transpozazy. Zalecamy najpierw przygotowanie mieszaniny roztworów transpozazy w zależności od liczby reakcji. A następnie dodanie podwielokrotności 150 mikrolitrów do każdej probówki.Roztwór delikatnie wymieszano i pozostawiono na poziomym wytrząsarce w temperaturze pokojowej w 12 obr./min na dwie godziny. Probówki mieszano delikatnie co 10 do 15 minut. Po inkubacji jądra przemyto trzykrotnie przy użyciu 800 mikrolitrów buforu do przemywania immunostrącaniem w temperaturze pokojowej w celu usunięcia niezwiązanej transpozazy Tn5.Po trzecim płukaniu probówkę wirowano w temperaturze 300 rcf przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a do usunięcia pozostałego buforu użyto końcówki pipety. Na etapie znakowania do probówki reakcyjnej dodano 300 mikrolitrów buforu do znakowania. Roztwór dobrze wymieszano i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji dodano 10 mikrolitrów 0,5 mola na litr EDTA w 30 mikrolitrach 10% SDS w celu określenia reakcji. Następnie dodano 300 mikrolitrów buforu do ekstrakcji DNA. Przeprowadzono nieregularną ekstrakcję DNA.Fragmenty DNA rozpuszczono w 25 mikrolitrach sterylnej wody. 24 mikrolitry użyto do amplifikacji PCR w budowie biblioteki NGS. Rysunek ten przedstawia nienaruszone zabarwienie jąder za pomocą DAPI na obrazie, pod mikroskopem uzyskanie odpowiedniej ilości nienaruszonych i stosunkowo czystych jąder jest krytycznym krokiem dla CUT&Tag.Po PCR przeniesiono dwa mikrolitry i sprawdzono wielkość DNA na 1,5% żelu agarozowym. Ten rysunek pokazuje, że w porównaniu z negatywną kontrolą genu immunoglobuliny. Większość fragmentów DNA z próbki trimetylacji histonu H3 lizyny 4 powinna mieć od 280 do 500 par zasad.Fragmenty DNA mogą być oczyszczane, a następnie profilowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Rysunek ten przedstawia sekwencjonowanie generowania wyników dla przeciwciała antyhistonowego H3 Lizyna 4 trimetylacji w porównaniu z negatywnymi grupami kontrolnymi immunoglobuliny G. Technologia ta generuje biblioteki DNA w wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek przy użyciu uproszczonej procedury w porównaniu z ChIP-seq.CUT&Tag to nowa metoda, która wciąż jest w toku.

profiling-h3k4me3-modification-plants-using-cleavage-under-targets

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&amp;Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&amp;Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&amp;Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę CUT&Tag do profilowania modyfikacji histonowych H3K4me3 w roślinach. Technika ta umożliwia izolację jąder komórkowych i analizę epigenomową z wysoką efektywnością.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Przeglądaj więcej filmów