Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Ogólnym celem eksperymentu była identyfikacja fragmentów DNA związanych z białkiem w całym genomie, które odzwierciedlały stan chromatyny. Aby osiągnąć ten cel, przeprowadzono trzy operacje specjalne. W pierwszej kolejności wyizolowano nienaruszone jądra z komórek roślinnych.

Po drugie, modyfikacje chromatyny zostały rozpoznane przez specyficzne przeciwciało in situ. Po trzecie, przeciwciało wiążące białko fuzyjne transpozazy A, transpozaza Tn5, rozszczepia chromatynę in situ pod wpływem aktywacji jonów magnezu. Fragmenty DNA i miejsca wiązania modyfikacji chromatyny zostały następnie zintegrowane z adapterami i przygotowane do przygotowania DNA.

Wzbogacenie reakcji łańcuchowej polimerazy usprawniło sekwencjonowanie generacji. Regulacja epigenomiki na poziomie chromatycznym, w tym modyfikacje DNA i histonów, zachowania czynników transkrypcyjnych i niekodujących RNA z ich rekrutowanymi białkami, prowadzą do czasowej i przestrzennej kontroli ekspresji genów. Technologia CUT&Tag opracowana przez Henikoff Lab to metoda wiązania enzymów do profilowania epigenomiki chromatyny z wysoką wydajnością.

Tutaj wykorzystujemy liście bawełny jako materiał doświadczalny, a jako przykład do profilowania chromatyny za pomocą przeciwciała trimetylacji histonu H3 lizyny-4. Dostarczamy udoskonalony protokół z wideo do działania CUT&Tag w zakładach. Do każdego przygotowania próbki za pomocą CUT&Tag pobrano gram tkanki liścia bawełny.

Liść zmielono na drobny proszek z ciekłym azotem i przeniesiono do probówki sokoła o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej A. Roztwór buforowy delikatnie wymieszano, a probówkę inkubowano na lodzie przez pięć minut z delikatnym potrząsaniem, aby równomiernie rozproszyć materiał. Następnie wirowano go przy względnej sile odśrodkowej 500 lub rcf, w temperaturze 4 stopni Celsjusza, przez pięć minut, aby uformować osad komórkowy. Supernatant zdekantowano, a osad ponownie zawieszono w 20 ml schłodzonego buforu do izolacji jądrowej B, uzupełnionego 0,5% Tritonem.

Rurka została delikatnie odwrócona, aby całkowicie zawiesić pelis. Powstały lizat komórkowy został następnie przefiltrowany za pomocą kombinacji dwóch sit, a na wierzchu użyto sita o oczkach 500, aby usunąć większe resztki tkanki. A na dnie użyto sita o oczkach 1000 do zbierania jąder.

Wybór odpowiedniej wielkości oczek sit zależy od wielkości jąder roślin. Sterylna bibuła filtracyjna została użyta z tyłu sita do wchłonięcia części lizatu i resztek małych komórek. Lizat zawierający jądra przeniesiono do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wirowano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty, w temperaturze 4 stopni Celsjusza w celu zebrania jąder.

Po odwirowaniu używano końcówki pipety, aby usunąć jak najwięcej supernatantu. Dodano ilość 800 mikrolitrów, bufor do mycia jądrowego. Rurka została delikatnie odwrócona, aby ponownie zawiesić jądra.

Probówkę ponownie obracano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po trzech płukaniach, powstałe jądra połączono w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wirowano z prędkością 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Użyto końcówki pipety, aby usunąć jak najwięcej pozostałego buforu.

Kolejnym krokiem była inkubacja przeciwciała. Podwielokrotność 50 mikrolitrów jąder zawieszono ponownie w 1 mililitrze buforu przeciwciał uzupełnionego EDTA, BSA, koktajlem inhibitorów proteazy w digitoninie. Podwielokrotność 150 mikrolitrów zawiesiny jąder umieszczono w świeżej probówce o pojemności 1,5 mililitra na jedną reakcję, do każdej probówki dodano dwa mikrolitry przeciwciała.

W tym teście po dodaniu przeciwciała ustalono dwie kontrpróby biologiczne dla przeciwciała anty-histon-H3-lizyno-4-trimetylacji i grupy kontrolnej ujemnej immunoglobuliny G. Roztwór delikatnie wymieszano, a probówki pozostawiono na poziomej wytrząsarce do hybrydyzacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 12 obr./min. Następnego ranka probówki wyjęto, a jądra przemyto za pomocą 800 mikrolitrów buforu do przemywania immunostrącania.

Probówkę delikatnie odwrócono do góry nogami w celu wymieszania i pozostawiono na wytrząsarce poziomej na pięć minut w temperaturze pokojowej przy 12 obr./min. Po umyciu rurkę wirowano w temperaturze 300 rcf przez cztery minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu supernatant usunięto za pomocą końcówki do pipety.

Powtórzono to w sumie trzy prania. Po trzecim płukaniu probówkę obracano o 300 rcf przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a końcówka pipety była używana do usunięcia pozostałego buforu w jak największym stopniu. Przygotowanie mieszaniny transpozazy Tn5 do inkubacji.

Jeden mikrolitr transpozazy dodano do każdych 150 mikrolitrów buforu do inkubacji transpozazy. Zalecamy najpierw przygotowanie mieszaniny roztworów transpozazy w zależności od liczby reakcji. A następnie dodanie podwielokrotności 150 mikrolitrów do każdej probówki.

Roztwór delikatnie wymieszano i pozostawiono na poziomym wytrząsarce w temperaturze pokojowej w 12 obr./min na dwie godziny. Probówki mieszano delikatnie co 10 do 15 minut. Po inkubacji jądra przemyto trzykrotnie przy użyciu 800 mikrolitrów buforu do przemywania immunostrącaniem w temperaturze pokojowej w celu usunięcia niezwiązanej transpozazy Tn5.

Po trzecim płukaniu probówkę wirowano w temperaturze 300 rcf przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a do usunięcia pozostałego buforu użyto końcówki pipety. Na etapie znakowania do probówki reakcyjnej dodano 300 mikrolitrów buforu do znakowania. Roztwór dobrze wymieszano i inkubowano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji dodano 10 mikrolitrów 0,5 mola na litr EDTA w 30 mikrolitrach 10% SDS w celu określenia reakcji. Następnie dodano 300 mikrolitrów buforu do ekstrakcji DNA. Przeprowadzono nieregularną ekstrakcję DNA.

Fragmenty DNA rozpuszczono w 25 mikrolitrach sterylnej wody. 24 mikrolitry użyto do amplifikacji PCR w budowie biblioteki NGS. Rysunek ten przedstawia nienaruszone zabarwienie jąder za pomocą DAPI na obrazie, pod mikroskopem uzyskanie odpowiedniej ilości nienaruszonych i stosunkowo czystych jąder jest krytycznym krokiem dla CUT&Tag.

Po PCR przeniesiono dwa mikrolitry i sprawdzono wielkość DNA na 1,5% żelu agarozowym. Ten rysunek pokazuje, że w porównaniu z negatywną kontrolą genu immunoglobuliny. Większość fragmentów DNA z próbki trimetylacji histonu H3 lizyny 4 powinna mieć od 280 do 500 par zasad.

Fragmenty DNA mogą być oczyszczane, a następnie profilowane za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Rysunek ten przedstawia sekwencjonowanie generowania wyników dla przeciwciała antyhistonowego H3 Lizyna 4 trimetylacji w porównaniu z negatywnymi grupami kontrolnymi immunoglobuliny G. Technologia ta generuje biblioteki DNA w wysokiej rozdzielczości i wyjątkowo niskim tle przy użyciu niewielkiej liczby komórek przy użyciu uproszczonej procedury w porównaniu z ChIP-seq.

CUT&Tag to nowa metoda, która wciąż jest w toku.