Name: Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj przygotowanie organotypowych kultur warstwowych z tkanek nowotworowych do badań przedklinicznych. Ta metoda umożliwia testowanie odpowiedzi na leki w zachowanym mikrośrodowisku guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R. Braun był wspierany przez Szkołę Naukowców Klinicystów w Lubece (DFG #413535489) oraz Program Finansowania Juniorów Uniwersytetu w Lubece.

Próbki tkanek zostały pobrane i przetworzone po zatwierdzeniu przez lokalną komisję etyki Uniwersytetu w Lubece (# 16-281).
1. Pobieranie i obsługa świeżych tkanek
UWAGA: Z każdą nieutrwaloną próbką tkanki ludzkiej należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec ryzyku infekcji patogenami przenoszonymi przez krew. Wszyscy pacjenci powinni zostać przebadani pod kątem ujemnego wyniku testu na obecność wirusa HIV, HBV i HCV przed rozpoczęciem przetwarzania tkanki. Nosić fartuch ochronny i obchodzić się z próbkami tkanek ludzkich w rękawiczkach.
<ol>
	<li>Natychmiast po zabiegu należy pobrać świeżą, nieutrwaloną i niezamrożoną próbkę tkanki PDAC o minimalnym rozmiarze 0,4 x 0,4 cm i przetransportować próbkę do laboratorium w roztworze do przechowywania tkanek.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, natychmiast przetrzyj świeżą tkankę.</li>
	<li>Alternatywnie, należy przechowywać tkanki w roztworze do przechowywania tkanek na mokrym lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Jednak przechowywanie tkanek może powodować upośledzenie żywotności i generalnie należy tego unikać.</li>
</ol>
2. Przygotowanie
<ol>
	<li>Preparat z agarozy o niskiej temperaturze topnienia
	<ol>
		<li>Przygotować 100 ml niskotopliwej agarozy (8%), rozpuszczając 8 g agarozy w 100 ml podgrzanego roztworu Ringera i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
		<li>Po ogłoszeniu resekcji guza rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej.</li>
		<li>Umieścić agarozę w podgrzanej łaźni wodnej (37 °C), pozwalając jej ostygnąć do temperatury fizjologicznej przed przygotowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja wibratomu
	<ol>
		<li>Umieść żyletkę w uchwycie wibratomu i wykonaj automatyczną regulację kąta zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli dotyczy.</li>
		<li>Schłodzić płaszcz komory tnącej za pomocą agregatu chłodzącego lub mokrego lodu.</li>
		<li>Napełnij komorę tnącą około 100 ml fizjologicznego roztworu tnącego (np. roztworu Ringera).</li>
		<li>Umieść zamontowaną żyletkę we wstępnie schłodzonym roztworze do cięcia, pozwalając żyletce ostygnąć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zanurzanie tkanek w niskotopliwej agarozie
<ol>
	<li>Umyć próbkę tkanki schłodzonym (4 °C) PBS i umieścić tkankę w PBS na dużej (~14 cm) szalce Petriego na lodzie.</li>
	<li>Makroskopowo widoczny nadmiar tkanki łącznej z lodu należy usunąć za pomocą skalpela, ponieważ może to zmniejszyć wydajność cięcia.</li>
	<li>Umieść chusteczkę na małej szalce Petriego (~3 cm).</li>
	<li>Dostosować orientację tkanki tak, aby pozostała makroskopowo widoczna tkanka łączna miała taką samą orientację jak płaszczyzna dna płytki Petriego. Dno szalki Petriego ma taką samą orientację jak płaszczyzna cięcia.</li>
	<li>Wlej przygotowaną, niskotopliwą agarozę do małej szalki Petriego.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj orientację tkanki za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego na mokrym lodzie, aby szybciej stwardniała agaroza.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć tkankę za pomocą skalpela, pozostawiając co najmniej 5 mm otaczającej agarozy z każdej strony tkanki.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś osadzoną tkankę i przyklej ją do uchwytu na próbkę za pomocą super kleju.</li>
	<li>Po kilku sekundach umieścić uchwyt na próbkę w komorze cięcia.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj orientację tkanki w kierunku żyletki.</li>
</ol>
4. Krojenie tkanki zatopionej w agarozie za pomocą wibratomu
<ol>
	<li>Określ zewnętrzne granice zakresu cięcia (oś y) zgodnie z rozmiarem próbki tkanki.</li>
	<li>Wyreguluj ostrze w kierunku górnej części bloku tkanki.</li>
	<li>Ustaw prędkość cięcia na 0,04 mm/s, amplitudę cięcia na 1 mm i grubość plastra na 300 μm.</li>
	<li>Ostrożnie pokrój pierwsze plastry i przenieś je do osobnego pojemnika ze schłodzonym (4 °C) roztworem do krojenia na mokrym lodzie.</li>
</ol>
5. Kultura organotypowych kultur plastrowych
<ol>
	<li>Przygotuj 6-dołkową płytkę z 1 ml odpowiedniego podłoża uprawowego na dołek.
	<ol>
		<li>Podłoże A: Zaawansowany DMEM/F12, 10% FBS, 1% penicylina/streptomycyna.</li>
		<li>Medium B: RPMI 1640, 10% FBS, 1% penicylina/streptomycyna, 4 μg/ml insuliny, 8 ng/ml EGF, 0,3 μg/ml hydrokortyzon. 
		UWAGA: Pożywka zapewniająca optymalne warunki hodowli może się różnić w zależności od tkanki i pacjenta. Porównano dwa różne podłoża do hodowli tkankowych, jedno oparte na DMEM/F12 (pożywka A), drugie oparte na RPMI (pożywka B). Nie stwierdzono istotnych różnic między tymi pożywkami. Do wszystkich eksperymentów przedstawionych w tym protokole użyto pożywki A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść 6-dołkową płytkę z podłożem w inkubatorze, pozwalając na dostosowanie temperatury i pH przed uprawą.</li>
	<li>Umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych (np. hydrofilowych wkładkach PTFE o wielkości porów 0,4 μm) za pomocą filtra patrzącego.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu tnącego, umieszczając załadowany filtr na sterylnej szmatce.</li>
	<li>Umieść załadowany filtr w przygotowanej płytce 6-dołkowej. Nie dodawaj żadnego dodatkowego podłoża do wkładu.</li>
	<li>Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2 dni, powtarzając kroki 5.1, 5.2 i 5.5 z nową płytką 6-dołkową. 
	UWAGA: Organotypowe kultury warstwowe mogą być hodowane przez różne okresy w zależności od indywidualnego pytania badawczego.</li>
</ol>
6. Test żywotności resazuryny
UWAGA: Test żywotności resazuryny mierzy ogólną aktywność metaboliczną organotypowych kultur warstwowych na podstawie redukcji niefluorescencyjnej niebieskiej rezuryny do czerwonej fluorescencyjnej rezorufiny w żywych komórkach15. Test nie ma toksycznego wpływu na komórki i może być wielokrotnie stosowany do kultur w zależności od indywidualnego pytania badawczego. Żywotność mierzono za pomocą testu rezazuryny co 2-3 dni.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego resazuryny
	<ol>
		<li>Wyłącz światło sterylnego kaptura, ponieważ roztwór podstawowy resazuryny jest wrażliwy na światło.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy z 10 mg/ml soli sodowej resazuryny w 1x PBS.</li>
		<li>Przechowywać roztwór podstawowy w podwielokrotnościach chronionych przed światłem w temperaturze 4 °C w lodówce do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena ogólnej żywotności warstw
	<ol>
		<li>Wyłącz światło sterylnego kaptura, ponieważ roztwór podstawowy resazuryny jest wrażliwy na światło.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy resazuryny w stosunku 1:250 odpowiednią pożywką. 
		UWAGA: Pożywka używana do rozcieńczania powinna być taka sama, jak używana do uprawy (podłoże A lub podłoże B).</li>
		<li>Przygotować 1 ml końcowego roztworu resazuryny na plasterek i dodać dodatkowy 1 ml do ślepej próby, np. dla 6 plasterków rozcieńczyć 28 μl roztworu podstawowego resazuryny w 7 ml pożywki.</li>
		<li>Dozować roztwór rezazuryny na płytki 6-dołkowe, po 1 ml rozcieńczonego roztworu rezazuryny na studzienkę.</li>
		<li>Przenieś filtry uprawowe z plastrami do studzienek z roztworem rezazuryny. Jedna studzienka z roztworem resazuryny jest pusta jako ślepa kontrola. 
		UWAGA: Aby uprościć procedurę doświadczalną, krok ten można połączyć ze zmianą pożywki (krok 5.7). Jednak w przypadku, gdy potrzebne są dodatkowe pomiary żywotności, test można przeprowadzić w dowolnym momencie podczas uprawy kultur plastrów.</li>
		<li>Umieścić plastry tkanek w inkubatorze na 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Przygotować nowe 6-dołkowe płytki z pożywką hodowlaną, jeśli hodowla plastrów jest kontynuowana (patrz kroki 5.1 i 5.2).</li>
		<li>Wyjmij filtry hodowlane wraz z plastrami z roztworu resazuryny i usuń nadmiar roztworu, umieszczając załadowany filtr na sterylnej szmatce.</li>
		<li>Przenieś filtry uprawowe z plastrami na wcześniej przygotowaną płytkę hodowlaną.</li>
		<li>Z każdego 6-dołkowego dołka weź 100 μl roztworu resazuryny i przenieś go na 96-dołkową płytkę. Z ślepej próby umieścić trzy próbki (3 x 100 μl) w oddzielnych studzienkach płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Określ ilościowo ekstynkcję za pomocą fotometru płytkowego zgodnie z instrukcjami producenta. Długość fali wzbudzenia jest ustawiona na 545 nm, a długość fali emisji jest ustawiona na 600 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Utrwalanie formaliny i zatapianie parafiny w OTSC
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś wyhodowane plastry tkanki do plastikowej kasety do zatapiania. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Umieść filtr uprawowy z zamontowanym plastrem na szalce Petriego.</li>
		<li>Za pomocą skalpela ostrożnie wytnij membranę filtracyjną z zamontowanym plasterkiem tkanki.</li>
		<li>Ostrożnie przenieś membranę filtracyjną z zamontowanym plastrem do nylonowej torby do biopsji i umieść ją w kasecie do zatapiania.</li>
		<li>Następnie przenieś plastikowe kasety do zatapiania do pojemnika ze wstępnie schłodzoną (4 °C) 4,5% formaliną. Plastry można przechowywać w roztworze formaliny w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia, ale należy je inkubować przez co najmniej 24 godziny 
		UWAGA: OTSC należy przenosić z dużą ostrożnością, ponieważ łatwo się rozrywają.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie płucz utrwaloną w formalinie kulturę plastrów pod bieżącą wodą z kranu przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Odwodnić plaster tkanki utrwalony w formalinie przez inkubację w 70% etanolu (2x przez 3 godziny), 95% etanolu (1x przez noc, 1x przez 3 godziny), a następnie w etanolu absolutnym (1x przez 3 godziny, 1x przez noc).</li>
	<li>Oczyścić plaster tkanki utrwalony w formalinie przez 3-godzinną inkubację w ksylenie dwukrotnie.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w parafinie w temperaturze 60 °C (1x na noc, 1x na 2 h). Osadź tkankę w bloku parafiny w formie do zatapiania tkanek.</li>
	<li>Blok tkanki zatopionej w parafinie o grubości 4 μm należy przeciąć mikrotomem i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C zawierającej wodę destylowaną. Przenieś sekcje na szkiełka podstawowe.</li>
	<li>Inkubować skrawki parafiny przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C w celu związania tkanki ze szkłem. Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
8. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki z kroku 7.7 poprzez inkubację w ksylenie (3x przez 5 min).</li>
	<li>Ponownie uwodnić przez inkubację w alkoholu bezwodnym (2x przez 5 min), 95% alkoholu (2x przez 5 min) i 70% alkoholu (1x przez 5 min). Krótko spłukać wodą destylowaną.</li>
	<li>Plamić w roztworze hematoksyliny Mayer przez 5 min. Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.</li>
	<li>Barwienie przeciwstawne w 0,5% roztworze eozyny przez 40 s. Spłucz wodą destylowaną.</li>
	<li>Odwodnić przez inkubację odpowiednio w 70% alkoholu (maksymalnie 1 min), 95% etanolu (2x przez 3 min) i alkoholu bezwodnego (2x przez 3 min).</li>
	<li>Usunąć ksylen w trzech zmianach (po kilka sekund każda). Umieść kroplę podłoża montażowego i przykryj szkiełka nakrywkowe.</li>
</ol>
9. Immunohistochemia OTSC
<ol>
	<li>Odparafinować skrawki przez inkubację w ksylenie 2x przez 10 min, a następnie 1:1 etanol/ksylol przez 10 min.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do 100% etanolu (2x przez 3 min), 96% etanolu (2x przez 3 min), 70% etanolu (1x przez 3 min), a następnie do 50% etanolu (1x przez 3 min).</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu, aby zdemaskować epitop antygenowy. Podgrzewaj szkiełka w kuchence mikrofalowej w buforze cytrynianowym przez 5 minut przy 900 W, a następnie 2x przez 8 minut przy 600 W. Pozwól szkiełkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Prać w PBS 3x przez 3 min na shakerze.</li>
	<li>Przeprowadzić przepuszczalność błon komórkowych przez inkubację w 0,1% Triton X-100 w PBS (200 μL na szkiełko) w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
	<li>Umyj w PBS przez trzy zmiany, każda po 3 minuty na shakerze.</li>
	<li>Inkubować skrawki z 3% roztworem H2O2 w metanolu (200 μl na szkiełko) w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu zablokowania endogennej aktywności peroksydazy.</li>
	<li>Prać w PBS 3x przez 3 min na shakerze.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu blokującego (1:50 surowicy końskiej w PBS) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 25 min.</li>
	<li>Odcedź bufor blokujący ze szkiełek, przechylając szkiełko na chusteczce papierowej.</li>
	<li>Nanieść 200 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczalniku do przeciwciał na szkiełka podstawowe i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Jako kontrolę ujemną należy użyć odpowiedniej izoformy mysich immunoglobulin w tym samym rozcieńczeniu, co przeciwciało pierwszorzędowe.</li>
	<li>Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.</li>
	<li>Na szkiełka nanieść 200 μl biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego (roztwór w PBS w stosunku 1:50) i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.</li>
	<li>Przed zastosowaniem należy przygotować kompleks peroksydazy na bazie awidyny/biotyny zgodnie z instrukcjami producenta. Na szkiełka nanieść 200 μl kompleksu awidyna-biotyna-peroksydaza i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Myć 3x przez 3 min w PBS na shakerze.</li>
	<li>Nałożyć 200 μl roztworu substratu DAB (świeżo przygotowanego bezpośrednio przed użyciem: 1 kropla DAB na 1 ml podłoża), 200 μl na szkiełko. Pozwól na rozwój koloru przez 1-3 minuty, aż do osiągnięcia pożądanej intensywności koloru.</li>
	<li>Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.</li>
	<li>Przeciwbarwić slajdy, zanurzając boki w Hematoksylinie na 5 minut.</li>
	<li>Spłukiwać bieżącą wodą z kranu przez 10 min.</li>
	<li>Przykryj szkiełka wodnym medium montażowym i szkiełkami nakrywkowymi. Zamontowane prowadnice mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej na stałe.</li>
</ol>

<ol><li>Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+state-of-the-art+treatments+to+novel+therapies+for+advanced-stage+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Waghray, M., Yalamanchili, M., di Magliano, M. P., Simeone, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+stroma+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of stroma in pancreatic cancer.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 29 (5), 537-543 (2013).</li>
<li>Hwang, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+stromal+fibroblasts+promote+pancreatic+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression.</a> Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Hessmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+drug+scavenging+increases+intratumoural+gemcitabine+accumulation+in+murine+pancreas+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Fibroblast drug scavenging increases intratumoural gemcitabine accumulation in murine pancreas cancer.</a> Gut. 67 (3), 497-507 (2018).</li>
<li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+cancer+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li>
<li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li>
<li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Science Reports. 9 (1), 2133(2019).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).</li>
<li>Beutler, B., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis%2C+cachexia%2C+shock%2C+and+inflammation%3A+a+common+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemisty%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis, cachexia, shock, and inflammation: a common mediator.</a> Annual Review of Biochemisty. 57, 505-518 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili potencjalnych konfliktów interesów.

OTSC świeżych próbek guza są bliskim przybliżeniem guza in situ. Utrzymują swoją wyjściową morfologię, aktywność proliferacyjną i mikrośrodowisko podczas uprawy przez określony, zależny od tkanki okres 11,12,13. Technika ta umożliwia natychmiastowe zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo, a następnie dalsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu. Szczególną zalet...

Istniejące przedkliniczne modele gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i odpowiadające im przerzuty są słabymi predyktorami odpowiedzi na leczenie u pacjentów, co jest główną wadą w rozwoju leków i identyfikacji biomarkerów predykcyjnych1. Chociaż modele takie jak organoidy pochodzące od pacjentów i ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów są obiecujące, ich zastosowanie pozostaje ograniczone2. Głównymi ograniczeniami tych modeli in vitro są brak mikrośrodowiska guza i ksenoprzeszczep u gatunków innych niż ludzie z obniżoną odpornością. Szczególnie w przypadku PDAC i jego przerzutów, mikrośrodowisko guza znacznie zyskało zainteresowanie w ciągu ostatnich lat ze względu na jego kluczowe funkcje w biologii nowotworu. Składa się ze składników komórkowych i bezkomórkowych, takich jak (mio-)fibroblasty, komórki gwiaździste trzustki, komórki odpornościowe, naczynia krwionośne, macierz zewnątrzkomórkowa, cytokiny i czynniki wzrostu3. To mikrośrodowisko nie jest niefunkcjonalnym składnikiem guza, ale indukuje progresję guza i przerzuty i wydaje się znacząco przyczyniać do oporności na radio- i chemioterapię4. Mikrośrodowisko PDAC nie tylko mechanicznie upośledza dostarczanie leków, ale także wykazuje aktywność immunologiczną i wymiatającą leki5,6,7. W związku z tym pilnie potrzebne są modele przedkliniczne, które odzwierciedlają złożoną interakcję komórek nowotworowych i mikrośrodowiska guza, aby odpowiednio przetestować odpowiedź pacjentów na leczenie ex vivo i kierować zindywidualizowanym leczeniem klinicznym.
Hodowle ex vivo świeżych próbek guza reprezentują bliskie przybliżenie guza in situ. Organotypowe kultury plastrów (OTSC) zostały niedawno opracowane i przebadane pod kątem kilku nowotworów, takich jak rak głowy, szyi, piersi, prostaty, płuc, okrężnicy i trzustki8,9,10,11,12. Wykazano, że OTSC utrzymują swoją podstawową morfologię, aktywność proliferacyjną i mikrośrodowisko podczas uprawy przez określony, zależny od tkanki okres11,12,13. OTSC PDAC utrzymywały swoją żywotność, morfologię i większość składników mikrośrodowiska guza przez 4-9 dni w kilku badaniach in vitro5,12,14. Patrząc perspektywicznie, technika ta umożliwia natychmiastowe zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo, a następnie dalsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu.
Ustanowienie OTSC daje wyjątkową okazję do przetestowania odpowiedzi na leczenie ex vivo, zaraz po operacji. W ten sposób OTSC pozwolą prospektywnie zidentyfikować strategie terapeutyczne w celu personalizacji leczenia choroby przerzutowej. Protokół ten opisuje wytwarzanie i hodowlę żywotnych OTSC raka trzustki.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12 Medium</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Roth</td><td>6351.2</td><td>8% w roztworze Ringera</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał, redukujący tło</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>AquaTex</td><td>Merck</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>Bioetanol (99%, denaturowany)</td><td>CHEMSolute</td><td>2,21,19,010</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175) (5A1E) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>9664</td><td>Rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Derby Extra Double Edge Safety Razor Blades</td><td>Derby Tokai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kasety do zatapiania</td><td>Roth</td><td>H579.1</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y-roztwór 0,5% wodny</td><td>Merck</td><td>10,98,44,100</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt Szybkoutwardzalne podłoże montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu 4,5%, buforowany</td><td>B&uuml; fa Chemikalien</td><td>B211101000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ałunu hemowego kwasowy wg Mayer</td><td>Roth</td><td>T865</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF</td><td>Milteniy Biotec</td><td>130-097-794</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Merck</td><td>1,08,59,71,000</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Płynny system chromogenów do substratów DAB+</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>MACS Roztwór do przechowywania tkanek</td><td>Milteniy Biotech</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>10.600.092.500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 i mikro; m</td><td>Millipore (Merck)</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna mysz anty-ludzka&nbsp; Cytokeratyna 7 (klon OV-TL 12/30)</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Monoklonalny mysz anty-ludzka Ki67 Klon MIB-1</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna Anty-wimentyna (klon V9)</td><td>Dako</td><td>M0725</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kontrola ujemna Mysz IgG2a</td><td>Dako</td><td>X0943</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Kontrola ujemna Mysz IgG1</td><td>Dako</td><td>X093101-2</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Parafina (temperatura topnienia 56&deg;- 58&deg;)</td><td>Merck</td><td>10,73,37,100</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x) Klasa cytometrii przepływowej</td><td>Gibco</td><td>A12860301</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa resazuryny; 10 mg/ml w PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7017</td><td>rozcieńczenie 1:250</td></tr><tr><td>Roztwór Ringera</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2610813</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Płytka testowa do hodowli tkanek 6</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw peroksydazy ABC VECTASTAIN Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen (ekstra czysty)</td> <td>J.T.Baker</td><td>8,11,85,000</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek ClarioStar</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrum Osadzania Parafiny E61110</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotary Microtom Microm HM355S</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System transferu sekcji Microm STS</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT 1200S Vibratom</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Organotypic Slice Cultures as Preclinical Models of Tumor Microenvironment in Primary Pancreatic Cancer and Metastasis

Realistyczne modele przedkliniczne pierwotnego raka trzustki i przerzutów są pilnie potrzebne, aby przetestować odpowiedź na terapię ex vivo i ułatwić spersonalizowane leczenie pacjentów. Jednak brak mikrośrodowiska specyficznego dla nowotworu w obecnie stosowanych modelach, np. liniach komórkowych pochodzących od pacjentów i ksenoprzeszczepach, pozwala jedynie na ograniczony wgląd predykcyjny. Organotypowe kultury warstwowe (OTSC) składają się z nienaruszonej tkanki wielokomórkowej, którą można szybko wykorzystać do badania odpowiedzi na lek w rozdzielczości przestrzennej.
Ten protokół opisuje wytwarzanie i hodowlę żywotnych wycinków nowotworowych raka trzustki i jego przerzutów. Krótko mówiąc, tkanka jest odlewana w niskotopliwej agarozie i przechowywana w zimnym buforze izotonicznym. Następnie za pomocą wibratomu generowane są plastry tkanek o grubości 300 μm. Po przygotowaniu plastry są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz przy użyciu wkładek do hodowli komórkowych i odpowiedniego podłoża hodowlanego. Podczas hodowli można monitorować zmiany w różnicowaniu i żywotności komórek. Ponadto technika ta umożliwia zastosowanie leczenia do żywotnej ludzkiej tkanki nowotworowej ex vivo i późniejsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomu i proteomu.
OTSC dają unikalną okazję do przetestowania indywidualnej odpowiedzi na leczenie ex vivo i zidentyfikowania indywidualnych profili transkryptomicznych i proteomicznych związanych z odpowiednią odpowiedzią różnych wycinków guza. OTSC mogą być dalej badane w celu zidentyfikowania strategii terapeutycznych w celu personalizacji leczenia pierwotnego raka trzustki i przerzutów.

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat procesu hodowli OTSCs z tkanek nowotworowych pobranych na świeżo, niezamrożonych. Próbki pierwotnych PDAC oraz przerzutów pobrano bezpośrednio po resekcji chirurgicznej i przechowywano przez noc na mokrym lodu w temperaturze 4 °C w roztworze do przechowywania tkanek. Próbki zostały przetworzone, a plastry poddano hodowli zgodnie z opisem w protokole. Makroskopowa morfologia każdego OTSC nie uległa znacznym zmianom podczas hodowli. Jednakże powierzchnia OT...

Ten protokół opisuje przygotowanie organotypowych kultur plastrowych (OTSC). Technika ta ułatwia hodowlę ex vivo nienaruszonej tkanki wielokomórkowej. OTSC mogą być natychmiast użyte do zbadania ich odpowiedniej odpowiedzi na leki w środowisku wielokomórkowym.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Realistic preclinical models of primary pancreatic cancer and metastasis are urgently needed to test the therapy response ex vivo and facilitate ...

Organotypowe wycinki tkanek zostały wygenerowane z różnych tkanek. Ze względu na zachowaną integralność tkanek i rozwój technik hodowli nadają się do modelowania złożonych mechanizmów fizjologicznych. Organotypowe hodowle warstwowe z raków trzustki dokładnie przeliczają wielokomórkową architekturę guza i jego mikrośrodowisko ex vivo.Mogą być używane do różnych dalszych zastosowań, takich jak testowanie odpowiedzi na leki. Można je hodować natychmiast po chirurgicznej resekcji guza, są niedrogie i mniej czasochłonne w porównaniu z większością innych technik hodowli pierwotnej. Procedurę zademonstruje Olha Lapshyna, asystentka techniczna z Uniwersytetu w Lubece.Na początek przygotuj 100 mililitrów niskotopliwej 8% agarozy, rozpuszczając osiem gramów agarozy w 100 mililitrach wstępnie podgrzanego roztworu dzwonka i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, aż będzie potrzebna. Po ogłoszeniu resekcji guza rozpuść agarozę w kuchence mikrofalowej. Umieść agarozę w podgrzanej łaźni wodnej, pozwalając jej ostygnąć do fizjologicznej temperatury przed przygotowaniem.Umieść żyletkę w uchwycie Vibratome i wykonaj automatyczną regulację kąta zgodnie z instrukcjami producenta. Schłodzić płaszcz komory tnącej za pomocą agregatu chłodzącego lub mokrego lodu. Napełnij komorę tnącą około 100 mililitrami roztworu dzwonka, a następnie umieść zamontowaną żyletkę we wstępnie schłodzonym roztworze tnącym, pozwalając żyletce ostygnąć.Umyj próbkę tkanki schłodzonym PBS i umieść ją na dużej 14-centymetrowej szalce Petriego na lodzie. Usunąć makroskopowo widoczny nadmiar tkanki łącznej z lodu za pomocą skalpela. Umieść tkankę na małej szalce Petriego.Dostosować orientację tkanki tak, aby pozostała makroskopowo widoczna tkanka łączna miała taką samą orientację jak płaszczyzna dna szalki Petriego. Wlej przygotowaną niskotopliwą agarozę do małej szalki Petriego, dostosowując orientację tkanki. W razie potrzeby za pomocą kleszczy umieść szalkę Petriego na mokrym lodzie, aby szybciej stwardnieć agarozy.Ostrożnie przeciąć tkankę za pomocą skalpela, pozostawiając co najmniej pięć milimetrów otaczającej agarozy po każdej stronie tkanki. Dodaj klej do uchwytu na próbkę, rozprowadź go i przenieś osadzoną tkankę i przyklej ją do uchwytu próbki za pomocą superglue. Po kilku sekundach umieść uchwyt na próbkę w komorze tnącej i w razie potrzeby dostosuj orientację tkanki w kierunku żyletki.Określ zewnętrzne granice zakresu cięcia zgodnie z rozmiarem próbki tkanki. Wyreguluj ostrze w kierunku górnej części bloku tkanki. Ustaw prędkość cięcia na 0,04 milimetra na sekundę, amplitudę cięcia na jeden milimetr i grubość plastra na 300 mikrometrów.Ostrożnie pokrój pierwsze plastry i przenieś je do osobnego pojemnika ze schłodzonym roztworem dzwonka na mokrym lodzie. Przygotuj sześciodołkową płytkę z jednym mililitrem odpowiedniego podłoża uprawowego na studzienkę. Umieść sześciodołkową płytkę z podłożem w inkubatorze, pozwalając na dostosowanie temperatury i pH przed uprawą.Umieść plastry na wkładkach do hodowli komórkowych za pomocą filtra patrzącego, a następnie usuń nadmiar roztworu dzwonka, umieszczając załadowany filtr na sterylnej szmatce. Umieścić załadowany filtr w przygotowanej płytce sześciodołkowej bez dodawania dodatkowego podłoża do wkładu, a następnie umieścić płytkę sześciodołkową w inkubatorze i zmieniać pożywkę co dwa dni. Umieść filtr uprawowy z zamontowanym plastrem na szalce Petriego.Za pomocą skalpela ostrożnie wytnij membranę filtracyjną z zamontowanym plasterkiem tkanki. Przenieś membranę filtracyjną z zamontowanym plastrem do nylonowej torby do biopsji i umieść ją w kasecie do zatapiania. Następnie przenieś plastikowe kasety do zatapiania do pojemnika ze wstępnie schłodzoną 4,5% formaliną na minimum 24 godziny lub do dalszego użycia.Ostrożnie płucz kulturę plastrów z formaliną pod bieżącą wodą z kranu przez 1,5 godziny. Odwodnić plasterek tkanki utrwalonej w formalinie przez inkubację w 70%95% i absolutnym etanolu. Następnie wyczyść wycinek tkanki utrwalonej formaliną za pomocą dwóch trzygodzinnych inkubacji w ksylenie.Zanurz tkankę w parafinie w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc, a następnie ponownie na dwie godziny. Osadź tkankę w bloku parafinowym w formie do zatapiania tkanek i umieść ją na lodzie, aby szybciej schłodzić próbkę. Przeciąć blok tkanki zatopionej w parafinie o grubości czterech mikrometrów za pomocą mikrotomu i w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza zawierającej wodę destylowaną.Przenieś sekcje na szkiełka podstawowe. Inkubuj skrawki parafiny przez godzinę w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby związać tkankę ze szkłem. Następnie inkubuj szkiełka przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Odparafinować skrawki przez inkubację w ksylenie trzy razy przez pięć minut każda. Następnie nawodnij się przez kolejne inkubacje w alkoholu bezalkoholowym, 95% alkoholu i 70% alkoholu. Zabarwić skrawki w roztworze Hematoksyliny Mayera przez pięć minut i płukać bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.Przeciwbarwić w 0,5% roztworze ESN przez 40 sekund i spłukać wodą destylowaną, a następnie powtórzyć odwodnienie w etanolu. Oczyść tkankę w trzech zmianach ksylenu przez kilka sekund każda, a następnie umieść kroplę podłoża montażowego i przykryj szkiełka nakrywkowe. Makroskopowa morfologia każdego OTSC zmniejszała się podczas uprawy przez sześć dni.Zachowana żywotność dla OTSC z dwóch reprezentatywnych guzów pierwotnych w dwóch różnych pożywkach wykazała spadek żywotności po dniu zero ze względu na procedurę cięcia i dostosowanie do warunków hodowli, a także wzrost żywotności próbki guza w prawym panelu. Skrawki barwienia H&E wykazały, że ogólna struktura tkanki została zachowana przez cały czas uprawy ex vivo i że nie wykryto żadnych poważnych zmian proliferacji i apoptozy w okresie hodowli trwającym sześć dni. Mikroskopowa ocena histopatologiczna skrawków H&E nie wykazała istotnego wzrostu martwicy wszystkich hodowanych tkanek podczas hodowli.Nastąpił wzrost rozszczepionych komórek kaspazo-3-dodatnich po hodowli pierwotnego gruczolakoraka przewodowego trzustki lub PDAC przez 15 dni. Histopatologia przerzutów PDAC do otrzewnej wykazała wysoką niejednorodność wewnątrznowotworową między poszczególnymi wycinkami, a także naturalnie występującą apoptozę mierzoną rozszczepionym barwieniem kaspazą-3. Barwienie H&E i charakterystyka immunohistologiczna cytokeratyny 7 w przerzutach PDAC do ściany jamy brzusznej wykazały, że uzyskane OTSC nie zawierały żadnych komórek nowotworowych, a jedynie składały się z tkanki łącznej, która była częściowo martwicza.Każdy wyhodowany wycinek może być profilowany indywidualnie, w zależności od konkretnego pytania badawczego, na przykład za pomocą sekwencjonowania RNA w przypadku transkryptomiki lub łagodnego obrazowania w przypadku proteomiki rozdzielczej. W przyszłości połączenie z nieniszczącymi metodami analitycznymi ma ogromny potencjał w zakresie przewidywania specyficznych dla pacjenta reakcji na różne schematy terapeutyczne.

organotypic-slice-cultures-as-preclinical-models-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje rozwój systemu kokultury 3D. Wycinki mózgu myszy umieszcza się na błonie, a znakowane fluorescencyjnie ludzkie komórki guza mózgu mogą na niej rosnąć. Gdy system jest gotowy, jest barwiony do obrazowania.

Ustalenie guza mózgu w organotypowym modelu kokultury warstw

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

Obecne modele ex vivo glejaka (GBM) nie są zoptymalizowane pod kątem fizjologicznie istotnych badań nad inwazją nowotworów u ludzi. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i utrzymywania organotypowych kultur warstwowych ze świeżej tkanki ludzkiej GBM. Przedstawiono opis technik mikroskopii poklatkowej i ilościowej analizy migracji komórek.

Organotypowy model hodowli warstwowej glejaka ludzkiego do badania migracji komórek nowotworowych i specyficznych dla pacjenta skutków leków przeciwinwazyjnych

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Wprowadzamy protokół do mierzenia reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej. Przedstawiona tutaj strategia eksperymentalna stanowi platformę do przeprowadzania średnio-wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków na wycinkach tkanek pochodzących z nowotworów klinicznych lub mysich w warunkach ex vivo.

Pomiar reakcji na lek w czasie rzeczywistym w organotypowych wycinkach tkanki nowotworowej

Wprowadzamy protokół do pomiaru w czasie rzeczywistym reakcji komórek przerzutowych raka piersi do mózgu na leki i promieniowanie w organotypowym modelu wycinka mózgu. Metody te zapewniają test ilościowy w celu zbadania efektów terapeutycznych różnych metod leczenia przerzutów raka piersi do mózgu w sposób ex vivo w obrębie interfejsu mikrośrodowiska mózgu.

Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza z przerzutami do mózgu raka piersi

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Rak trzustki pozostaje jednym z najtrudniejszych nowotworów do leczenia. Dlatego tak ważne jest, aby modele przedkliniczne oceniające skuteczność leczenia były powtarzalne i istotne klinicznie. Protokół ten opisuje prostą procedurę kohodowli w celu wygenerowania powtarzalnych, klinicznie istotnych sferoid desmoplastycznych.

Hodowla desmoplastycznych trójwymiarowych sferoid raka trzustki z kokultury

Poznaj przygotowanie organotypowych kultur warstwowych z tkanek nowotworowych do badań przedklinicznych. Ta metoda umożliwia testowanie odpowiedzi na leki w zachowanym mikrośrodowisku guza.

Organotypowe kultury warstwowe jako przedkliniczne modele mikrośrodowiska guza w pierwotnym raku trzustki i przerzutach

Przeglądaj więcej filmów