Name: Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj model eksperymentalnego stłuszczenia wątroby in vitro z użyciem komórek HepG2 w pożywce kondycjonowanej lipidami. Metoda umożliwia badanie markerów diagnostycznych i celów terapeutycznych chorób wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos jest doktorantką w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, a jej wsparcie otrzymał Conacyt (CVU: 1002502).

1. Przygotowanie pożywki standardowej i warunkowanej
<ol>
	<li>Aby przygotować standardowe medium RPMI 1640, uzupełnić pożywkę RPMI 1640 o 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS, uprzednio inaktywowanej ciepłem) oraz 1% (v/v) roztworu penicyliny i streptomycyny. Pożywkę przechowywać w temperaturze 4 °C. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór zapasowy palmitynu, przygotować 50 mM roztwór palmitynu w standardowym medium RPMI 1640, uprzednio uzupełnionym o 1% albuminy surowicy bydlęcej (wolnej od lipidów). Wystarczająca będzie objętość 5-10 mL tego roztworu. Roztwór zapasowy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, do 1 miesiąca.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór zapasowy oleinianu, przygotować 50 mM roztwór oleinianu w standardowym medium RPMI 1640, uprzednio uzupełnionym o 1% albuminy surowicy bydlęcej (wolnej od lipidów). Wystarczająca będzie objętość 10 mL. Roztwór zapasowy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem, do 1 miesiąca.</li>
	<li>Aby przygotować medium steatogenne z uprzednio przygotowanych roztworów zapasowych, przygotować medium steatogenne w proporcji 1 część palmitynu : 2 części oleinianu dla dwóch możliwych poziomów: stłuszczenia łagodnego i ciężkiego.
	<ol>
		<li>Stłuszczenie łagodne: Przygotować 100 mL mieszaniny 1 część palmitynu : 2 części oleinianu (50 µM) w standardowym medium RPMI 1640. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.</li>
		<li>Stłuszczenie ciężkie: Przygotować 100 mL mieszaniny 1 część palmitynu : 2 części oleinianu (500 µM) w standardowym medium RPMI 1640. Sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.</li>
		<li>Alternatywna metoda przygotowania roztworów zapasowych.
		<ol>
			<li>Przygotować oba roztwory zapasowe z odpowiednich kwasów tłuszczowych, wykorzystując albuminę wolną od lipidów, zgodnie z powyższymi instrukcjami.</li>
			<li>W przypadku braku albuminy wolnej od lipidów, należy użyć soli palmitynianu i oleinianu.
			<ol>
				<li>Rozpuścić palmitynian lub oleinian w 2 mL bezwodnego etanolu, a następnie wymieszać do uzyskania końcowej objętości standardowego medium RPMI 1640 (5-10 mL). Oleinian rozpuszczać bezpośrednio poprzez mieszanie w standardowej pożywce RPMI 1640.</li>
				<li>Pozwolić na odparowanie etanolu, inkubując w kąpieli wodnej w temperaturze 70 °C; dokładnie wymieszać.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>W każdym przypadku oba roztwory zapasowe należy sterylizować za pomocą filtrów 0,22 µm. Roztwór zapasowy palmitynu przechowywać w temperaturze 4 °C, a roztwór zapasowy oleinianu w temperaturze -20 °C. Oba roztwory chronić przed światłem. Roztwory te są stabilne przez 1 miesiąc.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przedhodowla
<ol>
	<li>Wysiać 100 000 komórek HepG2 na dołek w płytce 24-dołkowej. Dodać 1 mL standardowej pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Preinkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 24 h, aby umożliwić adhezję komórek.</li>
</ol>
3. Hodowla steatogenna
<ol>
	<li>Po wstępnej hodowli usunąć standardową pożywkę RPMI 1640 i dodać odpowiednią pożywkę steatogenną.</li>
	<li>Co 24 h usuwać supernatant i dodawać świeżą pożywkę steatogenną.</li>
</ol>
4. Ocena żywotności i śmiertelności
<ol>
	<li>Wysiać 100 000 komórek HepG2 na dołek w płytce 24-dołkowej. Dodać 1 mL standardowego medium RPMI 1640.</li>
	<li>Preinkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Wymienić standardowe medium RPMI 1640 na medium steatogenne.</li>
	<li>Inkubować przez 24 h, 2 dni, 3 dni i 4 dni, odświeżając medium steatogenne co 24 h.</li>
	<li>Po odpowiednim czasie odpiąć nadosad.</li>
	<li>Odłączyć komórki z dołka, dodając 500 µL 0,05% Trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Zebrać resuspendowane komórki do mikroprobówki.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g i odpiąć nadosad.</li>
	<li>Dodać 200 µL standardowego RPMI 1640 i resuspendować komórki.</li>
	<li>Do nowej mikroprobówki dodać 15 µL 0,4% roztworu błękitu trypanu. Wymieszać z 15 µL poprzedniej zawiesiny komórek.</li>
	<li>Policzyć komórki zabarwione i niezabarwione za pomocą komory licznikowej (hemocytometru).</li>
	<li>Obliczyć odpowiednio wskaźniki żywotności i śmiertelności. 
	Żywotność = 
	<img alt="Wzór na żywotność komórek; (Komórki żywe/Wszystkie komórki)x100; stosowany w eksperymentach biologicznych; równanie." src="/files/ftp_upload/62543/62543eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	Śmiertelność = 
	<img alt="Wzór na obliczanie żywotności komórek; równanie procentu śmierci komórek; analiza danych naukowych." src="/files/ftp_upload/62543/62543eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"></li>
</ol>
5. Barwienie lipidów metodą Oil-Red O
<ol>
	<li>Umieść szkiełko przykrywowe do hodowli komórkowych w każdym dołku płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Zasiać 100 000 komórek HepG2 na dołek. Dodać 1 mL standardowego medium RPMI 1640.</li>
	<li>Preinkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 h.</li>
	<li>Wymienić standardowe medium RPMI 1640 na medium steatogenne.</li>
	<li>Inkubować przez 24 h, 2 dni, 3 dni i 4 dni, odświeżając medium steatogenne co 24 h.</li>
	<li>Po odpowiednim czasie usunąć nadsącz.</li>
	<li>Przemyć 1 mL solą fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Usunąć nadsącz.</li>
	<li>Utrwalić 1 mL 4% paraformaldehydu w PBS.</li>
	<li>Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć nadmiar paraformaldehydu.</li>
	<li>Przepłukać komórki 1 mL wody destylowanej.</li>
	<li>Dodać 1 mL 70% izopropanolu i inkubować przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć nadmiar izopropanolu. Na tym etapie płukanie w PBS nie jest wymagane.</li>
	<li>Dodać 1 mL roztworu Oil-red O i inkubować przez 30 min.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu Oil-red O.</li>
	<li>Przepłukać 1 mL wody destylowanej.</li>
	<li>Dodać 500 µL roztworu hematoksyliny. Inkubować przez 3 min.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu hematoksyliny.</li>
	<li>Przepłukać 1 mL wody destylowanej.</li>
	<li>Obserwować pod mikroskopem przy powiększeniu 400x (obiektyw 40x, okular 10x).</li>
</ol>
6. Ocena morfometryczna zawartości lipidów
<ol>
	<li>Losowo wybierz i wykonaj zdjęcia 10 pól widzenia z całego obszaru studzienki. Powtórz tę procedurę dla każdej studzienki.</li>
	<li>Oceń procent powierzchni zabarwionej na czerwono, korzystając z narzędzia Color Threshold w oprogramowaniu ImageJ zgodnie z opisem Ferreira i Rasband33.</li>
	<li>Porównaj obszar zabarwiony z całkowitą powierzchnią pola widzenia, korzystając z narzędzia Analyze Particles w oprogramowaniu ImageJ zgodnie z opisem Ferreira i Rasband33.</li>
	<li>Oblicz średni procent dla każdej studzienki.</li>
</ol>

<ol><li>Younossi, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+-+a+global+public+health+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective.</a> Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).</li>
<li>Younossi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+perspectives+on+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).</li>
<li>Eslam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+definition+for+metabolic+dysfunction-associated+fatty+liver+disease%3A+An+international+expert+consensus+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement.</a> Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).</li>
<li>Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAFLD%3A+A+consensus-driven+proposed+nomenclature+for+metabolic+associated+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).</li>
<li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+Practice+guidance+from+the+American+association+for+the+study+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li>
<li>Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+course+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">The natural course of non-alcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774(2016).</li>
<li>Reccia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease%3A+A+sign+of+systemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease.</a> Metabolism. 72, 94-108 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+cholesterol+accumulation+in+hepatic+stellate+cells%3A+Mechanism+of+liver+fibrosis+aggravation+in+nonalcoholic+steatohepatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice.</a> Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).</li>
<li>Byrne, C. D., Targher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nafld%3A+A+multisystem+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nafld: A multisystem disease.</a> Journal of Hepatology. 62, 1 Suppl 47-64 (2015).</li>
<li>Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+hepatic+lipid+accumulation+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).</li>
<li>Diehl, A. M., Day, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause%2C+pathogenesis%2C+and+treatment+of+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+acid+ameliorates+palmitic+acid+induced+hepatocellular+lipotoxicity+by+inhibition+of+ER+stress+and+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis.</a> Nutrition and Metabolism. 17, London. 11(2020).</li>
<li>Ore, A., Akinloye, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+antioxidant+biomarkers+in+clinical+and+experimental+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Medicina (Kaunas). 55 (2), 26(2019).</li>
<li>Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+cardiolipin+and+mitochondrial+dysfunction+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).</li>
<li>Aravinthan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+senescence+predicts+progression+in+non-alcohol-related+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease.</a> Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).</li>
<li>Gomez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+hepatocellular+in+vitro+model+to+investigate+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico+Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis.</a> Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).</li>
<li>Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%2C+NAFLD+and+NAFLD-related+HCC%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).</li>
<li>Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+models+of+hepatic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture models of hepatic steatosis.</a> Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).</li>
<li>Kanuri, G., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).</a> International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+biomarkers+of+de+novo+lipogenesis+fatty+acids+and+incident+heart+failure+in+older+adults%3A+The+cardiovascular+health+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study.</a> Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119(2020).</li>
<li>Alnahdi, A., John, A., Raza, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+glucotoxicity%2C+oxidative+stress%2C+apoptosis+and+mitochondrial+dysfunction+in+Hepg2+cells+by+palmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid.</a> Nutrients. 11 (9), 1979(2019).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+acid+protects+saturated+fatty+acid+mediated+lipotoxicity+in+hepatocytes+and+rat+of+non-alcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis.</a> Life Sciences. 203, 291-304 (2018).</li>
<li>Xing, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasome+mediate+palmitate-induced+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction.</a> Life Sciences. 239, 116882(2019).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+Growth+Factor+Binding+Protein+7+accelerates+hepatic+steatosis+and+insulin+resistance+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).</li>
<li>Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tanshinone+IIA+reduces+palmitate-induced+apoptosis+via+inhibition+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+Hepg2+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+and+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells.</a> Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).</li>
<li>Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGFBP5+modulates+lipid+metabolism+and+insulin+sensitivity+through+activating+ampk+pathway+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Life Sciences. 256, 117997(2020).</li>
<li>Avila, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+conjugated+linoleic+acid+%28CLA%29+on+inflammatory+functions+of+bovine+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes.</a> Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).</li>
<li>Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acids+induce+JNK-dependent+hepatocyte+lipoapoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).</li>
<li>Oh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+palmitic+acid+on+TNF-alpha-induced+cytotoxicity+in+SK-Hep-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%3A+An+International+Journal+Published+in+Association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells.</a> Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).</li>
<li>Stellavato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+nutraceutical+compounds+and+novel+nutraceutical+formulations+in+a+liver-steatosis-based+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model.</a> Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24(2018).</li>
<li>Pachikian, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+trans-11%2C+trans-13+conjugated+linoleic+acid+in+the+development+of+hepatic+steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis.</a> PLoS One. 13 (2), 0192447(2018).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide%22">ImageJ User Guide</a>. , Ch. 30 132-135 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperetin+protects+against+palmitate-induced+cellular+toxicity+via+induction+of+GRP78+in+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 404(2020).</li>
<li>Geng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+metformin+against+palmitate-induced+hepatic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621(2020).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-+and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Chen, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydrocurcumin+ameliorates+free+fatty+acid-induced+hepatic+steatosis+and+improves+insulin+resistance+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+and+Drug+Analysis%22%5BJournal%5D)">Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells.</a> Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).</li>
<li>Burhans, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+oleate+regulates+adipose+tissue+lipogenesis+and+fatty+acid+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation.</a> Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).</li>
<li>Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olive+oil+antioxidants+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease.</a> Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).</li>
<li>Nagarajan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+and+glucose+metabolism+in+hepatocyte+cell+lines+and+primary+mouse+hepatocytes%3A+A+comprehensive+resource+for+in+vitro+studies+of+hepatic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten ma na celu zapewnienie strategii badania stłuszczenia in vitro. Hodowla komórkowa jest potężnym narzędziem do badania komórkowych, molekularnych, biochemicznych i toksykologicznych aspektów komórek narażonych na różne warunki. Dzięki takiemu podejściu stłuszczenie można uwidocznić nie tylko jako etap złożonej choroby, jaką jest MAFLD, ale także jako nadmierną ekspozycję hepatocytów na lipidy i możliwe wyniki wynikające z takiej ekspozycji. Dlatego jego zastosowanie nie ogranicza się do fizjopatologi...

Stłuszczenie wątroby związane z dysfunkcją metaboliczną jest bardzo rozpowszechnione na całym świecie1,2; szacuje się, że dotyczy to do 25% populacji3. Choroba ta, znana wcześniej jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), zaktualizowała swoją nomenklaturę do stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), aby dokładnie odzwierciedlić patogenezę związaną z otyłością, insulinoopornością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią, a także możliwe sposoby postępowania w chorobie3,4.
Bez względu na nazwę, choroba obejmuje szerokie spektrum zmian histopatologicznych charakteryzujących się nienormalnie wysokim nagromadzeniem lipidów w wątrobie (>5% tłuszczu w hepatocytach5) i może postępować poprzez akumulację lipidów typowo występującą w prostym stłuszczeniu do stłuszczeniowego zapalenia wątroby, co z kolei może prowadzić do rozwoju zwłóknienia, marskości wątroby, Rak wątrobowokomórkowy i niewydolność wątroby5,6,7,8. Ze względu na rosnące rozpowszechnienie, oczekuje się, że MAFLD stanie się pierwszym wskazaniem przeszczepu wątroby i główną przyczyną raka wątrobowokomórkowego9.
Chociaż stłuszczenie wątroby zostało uznane za łagodną lub łagodną formę stłuszczenia wątroby, w rzeczywistości jest kluczem metabolicznym w MAFLD10. Akumulacja lipidów w wątrobie wpływa na różne szlaki metaboliczne, w tym między innymi na syntezę, eksport i metabolizm lipidów10. Insulinooporność, stres oksydacyjny, stres siatkowaty i dysfunkcja komórkowa są silnie związane z lipotoksycznością wątroby11,12. Z drugiej strony, hepatocyty tłuszczowe są celem reaktywnych form tlenu, powodując metabolity jako nadtlenki lipidów, karbonylki białkowe i addukty kwasów nukleinowych13. Na poziomie komórkowym hepatocyty tłuszczowe mogą ulegać uszkodzeniu mitochondriów14, cellular senescence15, apoptosis16, pyroptosis12 i autophagia17, między innymi.
Hepatocyty są wysoce odpowiedzialne za metabolizm, detoksykację i syntezę szerokiej gamy molekuł. Wiele z tych funkcji może być zagrożonych przez akumulację lipidów obserwowaną w stłuszczeniu. Dlatego tak ważne jest, aby dysponować powtarzalnymi narzędziami, które pozwalają na dokładną ocenę stłuszczenia. W tym sensie modele in vitro są łatwe do zastosowania i wysoce powtarzalne. Stłuszczenie in vitro było stosowane w różnych celach16,18,19. Komórki HepG2 są szeroko stosowane jako linia komórkowa hepatocytów. Ma zalety, takie jak łatwość uprawy i dobrze scharakteryzowana. Być może jedyną wadą komórek HepG2 jest fakt, że jest to rakotwórcza linia komórkowa, więc należy to wziąć pod uwagę podczas analizy wyników. Przedstawiono zastosowanie mieszaniny kwasów tłuszczowych szeroko stosowanych w hodowli komórkowych: kwasu palmitynowego (PA) i kwasu oleinowego (OA). Zarówno PA, jak i OA oferują różne wyniki w culture20. PA (C 16:0) jest najczęściej spotykanym nasyconym kwasem tłuszczowym otrzymywanym z diety16. PA jest uważany za biomarker lipogenezy de novo, kluczowy krok w rozwoju NAFLD21. Wykazano, że PA jest wysoce toksyczny22; W związku z tym może nie być zalecane wywoływanie stłuszczenia in vitro. OA (C 18:1) jest jednonienasyconym kwasem tłuszczowym. W przeciwieństwie do PA, sugeruje się, że choroba zwyrodnieniowa stawów ma właściwości przeciwzapalne i przeciwutleniające, będąc w stanie przeciwdziałać PA12. Zarówno PA, jak i OA są głównymi kwasami tłuszczowymi obecnymi w trójglicerydach, niezależnie od stanu zdrowia lub choroby16. Tabela 1 zawiera przykłady hodowli hepatocytów z PA, OA i ich mieszaniną, a także przedstawione wyniki12,23,24,25,26,27. Inne kwasy tłuszczowe były również używane w hodowli hepatocytów, w tym kwas stearynowy (C 18:0)28,29,30, kwas linolowy (C 18:1)28,30,31 i jego koniugaty (CLA)28,32, kwas palmitynowy (C 16:1)29. Jednak ich stosowanie jest najrzadziej opisywane w literaturze, być może dlatego, że ich liczebność w wątrobie jest niższa niż PA i OA16.
W połączeniu, oba kwasy tłuszczowe przypominają stłuszczenie in vitro, dostarczając proliferujących komórek, o zwiększonej śmierci komórek i niższej żywotności w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Warto wspomnieć, że odpowiednie sole tych kwasów tłuszczowych są dostępne i mogą być również stosowane. Jednym z głównych problemów przy ocenie przeciążenia lipidami w hodowli komórek hepatocytów jest rozróżnienie między modelami toksykologicznymi a modelem, który najlepiej reprezentuje stłuszczenie. W pierwszym przypadku można uwzględnić wiele modeli. W rzeczywistości użycie samego PA może być brane pod uwagę wśród nich, a wysoka śmiertelność jest najbardziej widocznym wynikiem12,16,23,24,25,26,27. Stosowanie wysokich dawek nawet w przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów można również uznać za model toksykologiczny. Przedstawiony tutaj protokół jest bardziej zgodny z rozwojem stłuszczenia, ponieważ wykazuje niską śmiertelność w porównaniu z obserwowaną w innych modelach i pozwala na jego przestrzeganie przez kilka dni z postępującą akumulacją lipidów, tak jak ma to miejsce w NAFLD. Za kolejną zaletę uważa się możliwość oceny łagodnego i ciężkiego stłuszczenia w warunkach eksperymentalnych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kwasy tłuszczowe</td>
			<td colspan="2">Warunki</td>
			<td colspan="2">Wyniki</td>
			<td>odniesienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie: 200 μM</td>
			<td colspan="2">Akumulacja lipidów</td>
			<td rowspan="3">Yan i inni, 201925.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
			<td colspan="2">Uszkodzenie hepatocytów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Zwiększenie aktywności aminotransferaz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie: 50, 100 i 200 μM</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Nagromadzenie lipidów</td>
			<td rowspan="2">Xing i inni, 201924.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie: 250 μM , 500 μM , 750 μM i 1,000 μM</td>
			<td colspan="2">Akumulacja lipidów</td>
			<td rowspan="2">Wang i inni, 202026.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
			<td colspan="2">Postępujące zmniejszanie żywotności komórek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Mieszanka OA/PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie: 1 mM</td>
			<td colspan="2">Akumulacja lipidów</td>
			<td rowspan="3">Xiao i inni, 202027.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
			<td colspan="2">Nie zgłasza lipotoksyczności</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Oceń: 2OA:1PA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Mieszanka OA/PA</td>
			<td colspan="2">Pierwsza stymulacja 200 μM i 400 μM PA, a następnie druga stymulacja 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">Nagromadzenie lipidów. </td>
			<td rowspan="4">Zeng i inni, 202012.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Stężenie:400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2">Dowody na lipotoksyczność wywołaną przez PA zostały zmniejszone przez stymulację choroby zwyrodnieniowej stawów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Oceń: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Mieszanka OA/PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie: 400 μM PA: 200 μM OA</td>
			<td colspan="2" rowspan="3">Akumulacja lipidów</td>
			<td rowspan="3">Chen i inni, 201823.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Oceń: 2PA:1OA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Mieszanka OA/PA</td>
			<td colspan="2">Stężenie :50 i 500 μM</td>
			<td colspan="2">Powstawanie dwóch rodzajów stłuszczenia: łagodne stłuszczenie i 
			ciężkie stłuszczenie.</td>
			<td rowspan="3">Campos i Guzmán 2021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Oceń: 2PA:1OA</td>
			<td colspan="2">Symuluje przewlekłe narażenie na przeciążenie lipidami</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Czas ekspozycji: 24 godziny, 2 dni, 3 dni i 4 dni.</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Hodowla hepatocytów w warunkach stłuszczeniowych. W tabeli przedstawiono rodzaj użytego kwasu tłuszczowego, utrzymywane warunki oraz obserwowane wyniki w hodowli hepatocytów. PA: Kwas palmitynowy. OA: Kwas oleinowy.
Na koniec, ten model ma zastosowanie nie tylko do badania stłuszczenia i stłuszczenia wątroby, ale także do szlaków metabolicznych, syntetycznych i detoksykacyjnych w wątrobie w kontekście stłuszczenia. Również stłuszczenie indukowane in vitro może dostarczyć dowodów na identyfikację potencjalnych markerów choroby, a także celów terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ESCO Airstream</td><td>AC2-452+C2:C26</td><td>Klasa II&nbsp; Wpisz A2&nbsp; Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Filtr górny do butelki</td><td>Corning, USA</td><td>430513</td><td>&nbsp; Nie pirogenny, polistyrenowy, sterylny. 1 filtr/worek. 0,22 &m; m, 500 ml.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca albimun (BSA)</td><td>Gold Biotechnology, US</td><td>A-421-10</td><td>BSA Bez kwasów tłuszczowych do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Pożywki hodowlane RPMI 1640</td><td>ThermoFisher-Gibco, US</td><td>31800-022-Płodowa</td><td></td></tr> <tr><td>surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher-Gibco, US</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A4766801-Hemocytometr</td><td>Marienfeld, DE</td><td>640010-HepG2</td><td></td></tr> <tr><td>linia komórkowa</td><td>ATCC, US</td><td>HB-8065</td><td>Rak wątrobowokomórkowy komórki ludzkie.</td></tr><tr><td>Nawilżany inkubator</td><td>Thermo Electronic Corporation, model amerykański</td><td>: 3110</td><td>Temperatura (37 & stopnie; C &plusmn; 1 &stopnie; C), wilgotność (90% &plusmn; 5%) , CO2 (5% &plusmn; 1%)</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse</td><td>NIKON, JPN</td><td>Model: TE2000-S-Isopropanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>I9030-4L-Oil</td><td></td></tr> <tr><td>Red O Kit</td><td>Abcam, US</td><td>ab150678</td><td>Zestaw do histologicznej wizualizacji obojętnego tłuszczu.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>P6148-500G-penicylina</td><td></td></tr><tr><td>/streptomycyna</td><td>ThermoFisher-Gibco, US</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyki 10 000 U/ml Penicylina, 10 000 &mu; pH-metr g / ml Streptomycyny</td></tr><tr><td></td><td>Beckman, model amerykański</td><td>: 360 miernik PH / Temp / MV</td> <td>-</td></tr> <tr><td>buforowana solą fizjologiczną z fosforanami</td><td>ThermoFisher-Gibco, US</td><td>10010-023-Pipety</td><td></td></tr> <tr><td>serologiczne</td><td>Sarstedt, AUS</td><td>86.1253.001</td><td>&nbsp; Niepirogenne, sterylne, 5 ml</td></tr><tr><td>pipety serologiczne</td><td>Sarstedt, AUS&</td><td>nbsp; 86.1254.001</td><td>&nbsp; Niepirogenny, sterylny, 10 ml</td></tr><tr><td>wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>S5761-1KG</td><td>Przygotowanie pożywek</td></tr><tr><td>hodowlanych Oleinian sodu</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>sc-215879A-Palmitynian</td><td></td></tr> <tr><td>sodu</td><td>Santa Cruz Biotechnology, US</td><td>sc-215881-Filtr</td><td></td></tr> <tr><td>strzykawkowy</td><td>Corning, USA</td><td>431219</td><td>&nbsp; Niepirogenny, sterylny, 28 mm, 0,2 &mu;m.</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich, US</td><td>T6146-25G-Trypsyna</td><td></td></tr> <tr><td>0,05% / EDTA 0,53 mM</td><td>Corning, US</td><td>25-052-Cl-24</td><td></td></tr> <tr><td>studzienkowy klaster hodowli komórkowych</td><td>Corning, US</td><td>3524</td><td>Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie.</td></tr><tr><td>96-dołkowy klaster hodowli komórkowych</td><td>Corning, US</td><td>3599</td><td>Płaskie dno z pokrywką. Hodowla tkankowa poddana obróbce. Niepirogenne, polistyrenowe, sterylne. 1/opakowanie.</td></tr></tbody></table>

model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Stłuszczeniowa choroba wątroby związana z dysfunkcją metaboliczną (MAFLD), wcześniej znana jako niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD), jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą wątroby na świecie ze względu na jej związek z otyłością, cukrzycą typu 2 i dyslipidemią. Stłuszczenie wątroby, czyli nagromadzenie kropelek lipidów w miąższu wątroby, jest kluczową cechą choroby poprzedzającej stan zapalny obserwowany w stłuszczeniowym zapaleniu wątroby, zwłóknieniu i schyłkowej niewydolności wątroby. Nagromadzenie lipidów w hepatocytach może zaburzać prawidłowy metabolizm ksenobiotyków i cząsteczek endogennych, a także indukować procesy komórkowe prowadzące do zaawansowania choroby. Chociaż eksperymentalne badanie stłuszczenia można przeprowadzić in vivo, podejścia in vitro do badania stłuszczenia są narzędziami uzupełniającymi o różnych zaletach. Hodowla hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów jest doskonałą, powtarzalną opcją do badania stłuszczenia wątroby, umożliwiając identyfikację procesów komórkowych związanych z akumulacją lipidów, takich jak stresy oksydacyjne i siatkowate, autofagia, proliferacja, śmierć komórki itp., a także inne testy, w tym skuteczność leków i testy toksykologiczne, wśród wielu innych możliwych zastosowań. W tym celu miało to na celu opisanie metodyki hodowli komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów. Komórki HepG2 hodowano w pożywce RMPI 1640 kondycjonowanej palmitynianem sodu i oleinianem sodu. Co ważne, stosunek tych dwóch lipidów ma kluczowe znaczenie dla akumulacji kropelek lipidów, przy jednoczesnym utrzymaniu proliferacji komórek i umiarkowanej śmiertelności, jak ma to miejsce w wątrobie podczas choroby. Przedstawiono metodologię od przygotowania roztworów lipidowych, mieszaniny, dodawania do pożywki i hodowli hepatocytów. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest zidentyfikowanie kropelek lipidów w hepatocytach, które można łatwo zaobserwować za pomocą barwienia czerwienią olejową O, a także krzywych współczynników proliferacji/śmiertelności.

Hepatocyty hodowane w medium steatogennym wykazują wzrost na całej powierzchni dołka; jednakże hepatocyty stłuszczone wykazują niższy tempo wzrostu w porównaniu z komórkami hodowanymi w medium kontrolnym. Zaproponowany stosunek i stężenie OA i PA gwarantują przeżywalność komórek podczas hodowli. Wysianie 1 x 105 komórek na dołek w płytkach 24-dołkowych zapewnia optymalną konfluencję, co przedstawiono na Rysunku 1.
Żywotność hodowanych komórek była niższ...

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Protokół ten ma zastosowanie do badania stłuszczenia wątroby, a także do szlaków wątrobowych, metabolicznych, syntetycznych i toksyczności w kontekście stłuszczenia. Głównymi zaletami tej metody są jej powtarzalność oraz krótki czas potrzebny na uzyskanie wyników. Dodaj do tego fakt, że oferuje dwa poziomy stłuszczenia, łagodny i ciężki.Stłuszczenie indukowane in vitro może dostarczyć dowodów na identyfikację potencjalnych markerów do diagnozy choroby, a także celów terapeutycznych. Ta metoda jest przeznaczona do stosowania w wyniku stłuszczenia. Można go jednak dostosować do wielu różnych komórek dotkniętych nadmierną ekspozycją na lipidy, np. podczas otyłości i lipidemii.Przygotuj standardowy RPMI 1640. Uzupełnij pożywkę hodowlaną RPMI 1640 o 10% aktywowanego termicznie FBS i 1% roztworu streptomycyny penicyliny. Wysterylizuj go za pomocą filtrów 0,22 mikrometra i przechowuj suplement w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby przygotować roztwór podstawowy palmitynianu, należy przygotować 50-milimolowy roztwór palmitynianu w standardowym RPMI 1640 uzupełniony o 1% BSA wolnego od lipidów. Wysterylizuj około pięciu do dziesięciu mililitrów roztworu podstawowego za pomocą filtrów

a-model-experimental-steatosis-vitro-hepatocyte-cell-culture-lipid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie demonstrujemy barwienie in vitro neutralnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby lub nadmiernego gromadzenia tłuszczu w wątrobie. Nadmiar tłuszczu gromadzi się w komórkach w postaci kropelek lipidów. Olej Red O jest rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem, który wiąże się z wewnątrzkomórkowymi obojętnymi lipidami w tych kropelkach lipidów. Obserwowane pod mikroskopem świetlnym te wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów wydają się intensywnie czerwone.

Barwienie czerwienią olejową O: technika barwienia obojętnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby in vitro

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Ten protokół bada ochronne działanie platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro wywołanym kwasem palmitynowym.

Badanie ochronnego wpływu platykodyny D na niealkoholową stłuszczeniową chorobę wątroby w modelu in vitro indukowanym kwasem palmitynowym

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Poznaj model eksperymentalnego stłuszczenia wątroby in vitro z użyciem komórek HepG2 w pożywce kondycjonowanej lipidami. Metoda umożliwia badanie markerów diagnostycznych i celów terapeutycznych chorób wątroby.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Przeglądaj więcej filmów