Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Opisany tutaj protokół jest odpowiedni do oceny wydajności komarów transgenicznych i porównań z ich odpowiednikami typu dzikiego w małych laboratoryjnych badaniach klatkowych. Badania z małymi klatkami są ważne, aby dostarczyć wartości empirycznych, które pomogą w realizacji nowych technologii eliminacji malarii. Próby klatkowe mogą być dostosowane do innych projektów eksperymentalnych i są odpowiednie do oceny dynamiki zagrożenia pożądanym transgenem.

Po wprowadzeniu osobników transgenicznych. Rozpocznij początkową fazę eksperymentu od ustawienia trzech klatek o pojemności 0,216 metra sześciennego w trzech egzemplarzach. I dodanie 60 larw drugiego stadium dzikiego do każdej klatki przez trzy kolejne tygodnie.

Co tydzień podawaj dorosłym samicom w każdej klatce znieczulone myszy jako źródło posiłku z krwi. I pojemnik do składania jaj trzy dni po posiłku z krwi. Jaja wykluwają się z każdej klatki co tydzień.

Od czwartego do ósmego tygodnia wybierz losowo 60 larw L2 w drugim stadium rozwoju, aby powróciły do odpowiednich klatek. W dziewiątym tygodniu losowo przypisz jeden zestaw potrójnych klatek jako kontrolę i jeden zestaw dla każdego pożądanego współczynnika uwalniania. Co tydzień do klatek kontrolnych należy dodawać 60 poczwarek typu dzikiego z 30 samcami i 30 samicami.

Utrzymuj stosunek jeden do jednego w każdej odpowiedniej klatce, dodając co tydzień 30 transgenicznych poczwarek płci męskiej wraz z 60 poczwarkami typu dzikiego. Aby uzyskać stosunek jeden do 0,1, dodaj 300 transgenicznych poczwarek płci męskiej tygodniowo do każdej odpowiedniej klatki wraz z 60 poczwarkami typu dzikiego. Powtarzaj dodawanie poczwarek komarów do klatki, dostarczając mączkę z krwi i jaja wylęgowe co tydzień.

Wybierz losowo łącznie 300 larw z każdej klatki do przesiewania. Przebadaj larwy pod mikroskopem stereoskopowym z filtrami fluorescencyjnymi w celu wyrażenia dominującego markera fluorescencyjnego w stadiach larwalnych i poczwarkowych. Oceń płeć powstałych poczwarek.

W eksperymencie z napędem genowym zastosuj strategię bariery, trzymając komary w bezpiecznym insekcie i przestrzegając standardowych procedur operacyjnych z regularnym monitorowaniem. Przygotuj klatkę z dwoma zestawami potrójnych klatek o pojemności 0,216 metra sześciennego dla każdego pożądanego stosunku uwalniania samców typu transgenicznego do dzikiego. Aby osiągnąć stosunek uwalniania samców jeden do jednego, dodaj 120 transgenicznych samców, 120 samców i samic typu dzikiego w stadium poczwarki do każdej replikowanej klatki.

Zapewnij posiłek z krwi za pomocą znieczulonych myszy cztero- do siedmiodniowych samic w każdej klatce. Po wykluciu się z jaj w tacy na larwy wybierz losowo około 240 larw L1 w pierwszym stadium rozwojowym z każdej klatki i wyhoduj je do poczwarek przed powrotem do odpowiednich klatek. Wybierz i przebadaj larwy pod kątem markera oka i fenotypu płci, jak opisano wcześniej.

Zmontuj konfigurację klatek składającą się z potrójnych klatek o pojemności 0,005 metra sześciennego z równą liczbą samców i samic dla każdego określonego współczynnika uwalniania transgeników do samców typu dzikiego. Używając aparatu do sztucznego karmienia, podawaj posiłki z krwi cztero- lub siedmiodniowym samicom w każdej klatce przez dwa kolejne dni. Trzy dni po drugim posiłku z krwi dodać pojemnik do składania jaj i wyjąć pojemniki po trzech dniach.

Po nacięciu wszystkich martwych i żywych dorosłych pozostających w klatce według płci, przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy molekularnej. Wykluwaj się z jaj i uruchamiaj, wybierz 200 larw L1 i odłóż larwy na bok, aby zaludnić nowe klatki dla następnego pokolenia. Następnie losowo wybierz kolejne 500 larw z każdej klatki przeznaczonej do przesiewania.

Wyhoduj wybrane 200 larw do poczwarki i 500 larw do stadium L4. Przywróć poczwarkę z 200 tac, aby zaludnić nową klatkę. Przesiewaj losowo wybrane larwy pod kątem markera oka i fenotypu płci Jak poprzednio.

W analizie reprezentatywnej przedstawiono oczekiwaną dynamikę fenotypu najlepiej działających kontrprób dla różnych protokołów prób wymiany populacji. Wyniki wykazały liniowy wzrost odsetka larw z fenotypem markera DsRed w ciągu siedmiu pokoleń. Uwolnienie jeden do jednego bez napędu osiągnęło niewiele ponad 80% wprowadzenia transgenu w ciągu siedmiu pokoleń.

Protokoły napędu genowego osiągnęły to w ciągu trzech do czterech pokoleń. W ten sposób potwierdzamy, że pojedyncze uwolnienie systemu napędu genowego może być bardziej efektywne w przypadku wprowadzenia transgenu. Pod koniec obserwacji rozprzestrzenianie się transgenu osiągnęło prawie całkowite wprowadzenie do genowych systemów napędowych.

Ważne parametry, takie jak współczynnik uwalniania, struktura wiekowa populacji, wielkość klatki i inne, będą się różnić w zależności od celu eksperymentu i konkretnych celów. Można przeprowadzić eksperymenty w celu oceny parametrów sprawności, takich jak płodność i płodność. Dalsze, bardziej empiryczne dane z prób klatkowych mogą być wykorzystane do parametryzacji matematycznych modeli dynamiki populacji.