Name: Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj metodę pęsety optycznej do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji. Technika łączy mikroskopię konfokalną z pomiarami sił rozwijania cząsteczek RNA w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anuji Kibe i Jun. Prof. Redmondowi Smythowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Dziękujemy Tatianie Koch za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy Kristynie Pekarkovej za pomoc w nagrywaniu eksperymentalnych filmów. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez Stowarzyszenie Helmholtza oraz finansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC) Grant nr 948636 (dla NC).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Klonuj sekwencję docelową do wektora zawierającego fragmenty DNA lambda, które pełnią funkcję sekwencji uchwytowych (Rysunek 2)43,50.</li>
	<li>Najpierw przygotuj matrycę DNA do dalszych in vitro transkrypcja za pomocą PCR (Rysunek 2B; reakcja 1). Na tym etapie PCR do końca 5' cząsteczki DNA sensownego dodawany jest promotor T732,33,43,50Przygotuj reakcję PCR zgodnie z Tabela 1Przeprowadź reakcję PCR w 50 µL alikwoty z odpowiednią liczbą cykli w termocyklerze.</li>
	<li>Przygotuj fragmenty łączące (handles) za pomocą dwóch oddzielnych reakcji PCR (Tabela 1, Rycina 2B; reakcja 2 i 3). Najpierw należy wygenerować fragment uchwytu 5' za pomocą PCR. Następnie należy wygenerować fragment uchwytu 3', jednocześnie znakując go digoksigeniną przy użyciu primera znakowanego digoksigeniną na końcu 5'.32,33,43,50.</li>
	<li>Po reakcji PCR oczyść DNA, wykorzystując kolumny wirówki z krzemionką.</li>
	<li>Przeprowadź in vitro reakcja transkrypcji z użyciem polimerazy RNA T7 (Tabela 2)32,33,43,50Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 2-4 h, w zależności od długości RNA. Następnie do reakcji należy dodać DNazę I i inkubować w 37 °C przez 30 min w celu strawienia matrycy DNA. RNA należy oczyścić, wykorzystując kolumny wirówkowe z krzemionką.</li>
	<li>Podczas reakcji znakowania uchwytu 5' (Tabela 3), a następnie do końca 3' uchwytu należy dodać biotin-16-dUTP przy użyciu polimerazy DNA T438,50Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej przez 1–2 h. Następnie oczyścić DNA za pomocą kolumienek spinowych z krzemionką. 
	UWAGA: Ponieważ uchwyt 5' musi zostać oznakowany na końcu 3' (Rysunek 2B), znakowania nie można przeprowadzić podczas reakcji PCR.</li>
	<li>Wymieszać wymienione powyżej komponenty – końcówkę 5' (znakowaną biotyną na końcu 3'), końcówkę 3' (znakowaną digoksigeniną na końcu 5') oraz RNA – w stosunku molowym 1:1:1 w buforze do hybrydyzacji (80% formamid, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), aby otrzymać pożądany hybryd RNA/DNA (Tabela 4). Podgrzać mieszaninę wyżarzającą do 85 °C przez 10 min, a następnie powoli schłodzić do 4 °C.</li>
	<li>Wymieszać wyżelowaną próbkę z 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH 5) oraz 3 objętości lodowatego etanolu i inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej 1 h lub w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wiruj próbki przy 15 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °COdrzucić supernatant i wysuszyć osad (zazwyczaj niewidoczny) pod próżnią.</li>
	<li>Na koniec resuspender osad w 50 µL wody wolnej od RNaz i przygotować alikwoty. Alikwoty przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. W przypadku krótkotrwałego przechowywania próbki można również przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Konfiguracja urządzenia
UWAGA: Poniższy protokół został zoptymalizowany dla komercyjnego instrumentu do pęset optycznych C-Trap firmy LUMICKS. W związku z tym, podczas korzystania z innych pęset optycznych, konieczne mogą być korekty przedstawionych kroków. Jeśli system mikroprzepływowy urządzenia nie jest używany, jest on przechowywany w wybielaczu (roztworze podchlorynu sodu) i musi zostać wypłukany przed użyciem.
<ol>
	<li>Wylać wybielacz i napełnić strzykawki 1 mL wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodać 50 µL 0,5 M tiosiarczanu sodu do co najmniej 1 mL wody wolnej od RNaz i dokładnie przemyć układ (1 bar, co najmniej 0,5 mL), aby usunąć pozostałości wybielacza z układu.</li>
	<li>Wylać roztwór tiosiarczanu sodu ze strzykawek. Wymienić strzykawki na nowe i przemyć układ co najmniej 0,5 mL wody wolnej od RNaz. 
	UWAGA: Należy dopilnować, aby układ mikroprzepływowy nigdy nie pracował na sucho, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w układzie.</li>
	<li>Nanieść 2 krople oleju imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,33) lub około 70 µL wody na górną część obiektywu.</li>
	<li>Umieścić komorę przepływową w ramce mocującej w odpowiedniej pozycji.</li>
	<li>Nanieść 2 krople oleju imersyjnego (współczynnik załamania światła 1,51) na górną część komory przepływowej.</li>
	<li>Włączyć urządzenie laserowe w aparaturze do pęsety optycznej. Po uruchomieniu włączyć laser pułapkujący w interfejsie oprogramowania na 100%.</li>
	<li>Używając kamer diagnostycznych (Z-finder), dostosować oś Z do środka komory pomiędzy drugą a trzecią refleksją (międzypowierzchniową), gdzie pierścienie refrakcji są największe, obracając mikrosrubą. 
	UWAGA: Za każdym razem, gdy obiektyw jest przesuwany bliżej komory pomiarowej i płaszczyzna ogniskowa obiektywu przecina granicę między dwiema fazami, w trybie Z-finder można zauważyć refleksję. Możliwe są 4 interfejsy: (i) woda/olej imersyjny i szkło dolne (ii) szkło dolne i bufor wewnątrz komory (iii) bufor wewnątrz komory i szkło górne (iv) szkło górne i olej imersyjny dla kondensora.</li>
	<li>Dostosować pozycję kondensora (ustawiając laser pułapkujący na około 50%), tak aby kondensor stykał się z olejem imersyjnym na górnej części komory pomiarowej.</li>
	<li>Ustawić ostrość, powoli przesuwając kondensorem w dół/górę, aż w trybie moon (kamery diagnostyczne) pojawi się około 10 pasm światła.</li>
</ol>
3. Pomiar próbek
<ol>
	<li>Inkubować kulek powlekanych anty-digoksigeniną (AD) z konstruktami próbek (3 µL 0,1% (w/v) zawiesiny kulek AD + 4 µL próbki) oraz z 1 µL inhibitorów RNazy i 8 µL buforu do analizy (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-20 min. Po inkubacji rozcieńczyć próbkę w 500 µL buforu do analizy. 
	UWAGA: Zaleca się dodanie do buforu pochłaniaczy tlenu, szczególnie podczas pomiarów fluorescencji, aby zapobiec uszkodzeniom oksydacyjnym. W tym przypadku zastosowano system pochłaniania tlenu zawierający glukozę (8,3 mg/mL), oksydazę glukozową (40 U/mL) i katalazę (185 U/mL).</li>
	<li>Wymieszać 0,8 µL 1% (w/v) kulek powlekanych streptawidyną (SA) z 1 mL buforu do analizy.</li>
	<li>Usunąć wodę ze strzykawek i napełnić je odpowiednimi zawiesinami/roztworami. Płukać przez co najmniej 2 min przy ciśnieniu około 1 bar, a następnie rozpocząć wychwytywanie kulek. 
	UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można zastosować różne układy kanałów (Rysunek 3). Typowo jeden kanał przepływowy jest wypełniony kulkami anty-digoksigeninowymi niosącymi cząsteczkę RNA. Drugi kanał jest wypełniony kulkami powlekanymi streptawidyną. Kanał buforowy służy do tworzenia wiązań (tethering). Czwarty kanał może zostać wykorzystany do wprowadzenia białka wiążącego RNA (Rysunek 3C), lub alternatywnie białko RBP można dodać bezpośrednio do kanału buforowego (Rysunek 3B).</li>
	<li>Aby przechwycić kulki, należy oddalić od siebie pułapki optyczne. Najpierw przejść do kanału AD i przechwycić kulkę AD w pułapce 1. Następnie przesunąć stoлик do kanału SA i przechwycić pojedynczą kulkę SA za pomocą pułapki 2. 
	UWAGA: Należy starać się pozostawać na granicy kanału buforowego i kanału z kulkami, aby uniknąć utraty już przechwyconej kulki lub zapobiec przechwyceniu wielu kulek przez jedną pułapkę.</li>
	<li>Po przechwyceniu kulek o odpowiednim rozmiarze, przejść do kanału buforowego i zatrzymać przepływ laminarny. Następnie przeprowadzić kalibrację siły, aby sprawdzić sztywność pułapki. Odpowiednie wartości sztywności nie powinny różnić się w osi x/y o więcej niż 10-15%. 
	UWAGA: Dostosować moc lasera lub podział wiązki lasera między pułapkami w zależności od rozmiaru kulek. Kalibracji siły nie trzeba przeprowadzać dla każdej pary kulek, o ile wzorce kulek są zgodne (wynik podobieństwa &gt; 0,9). Należy ją jednak wykonywać regularnie lub przynajmniej za każdym razem, gdy zmieniają się warunki analizy.</li>
	<li>Rozpocząć próbę utworzenia wiązania poprzez zbliżenie do siebie kulek, odczekanie kilku sekund, a następnie ponowne ich oddalenie; powtarzać czynność aż do utworzenia wiązania. Utworzenie wiązania objawia się wzrostem mierzonej siły podczas oddalania dwóch kulek od siebie. 
	UWAGA: Aby uniknąć utworzenia wielu wiązań, kulki nie powinny być zbliżane zbyt mocno. Po przechwyceniu wiązania między dwiema kulkami, jego jakość można sprawdzić, znajdując plateau nadrozciągania. Plateau dla pojedynczego wiązania powinno znajdować się w zakresie od 50 do 60 pN.</li>
	<li>Po uzyskaniu wiązania rozpocząć pomiar. W zależności od badanego zjawiska należy wybrać odpowiednią konfigurację pomiarową (Rysunek 1B-D). 
	UWAGA: Zazwyczaj na początku eksperymentu przeprowadza się eksperyment z rampą siłową, aby sprawdzić jakość wiązania i zbadać jego zachowanie. Następnie można rozpocząć eksperymenty z siłą stałą lub pozycją stałą, aby dalej badać przejścia stanów. Gdy wykonano wystarczającą liczbę pomiarów na próbce RNA, aby określić jej zachowanie, do układu można dodać znakowane czynniki w celu wykonania pomiarów konfokalnych.</li>
	<li>Aby przeprowadzić pomiary fluorescencji, włączyć lasery konfokalne i jednostkę licznika fotonów w urządzeniu do pęsety optycznej.</li>
	<li>Włączyć laser wzbudzenia o pożądanej długości fali w interfejsie oprogramowania i ustawić moc lasera na 5% lub wyższą, w zależności od fluoroforu. 
	UWAGA: W czasie, gdy pomiary nie są prowadzone, należy obniżyć ustawienie mocy lasera wzbudzenia do 0%, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń fotochemicznych próbki.</li>
	<li>Rozpocząć obrazowanie próbki, korzystając z funkcji obrazowania w oprogramowaniu. 
	UWAGA: Aby uzyskać dobrze ostrość obrazu, płaszczyzna ogniskowa mikroskopu konfokalnego i pułapek optycznych muszą być wyrównane. W tym celu można wykorzystać autofluorescencję kulek polistyrenowych w kanale niebieskiego lasera. Płaszczyznę ogniskową pułapek optycznych przesuwa się w górę lub w dół w osi z, aż obraz kulek osiągnie maksymalną średnicę. W tej pozycji można mierzyć sygnał fluorescencji cząsteczki powiązanej między kulkami.</li>
	<li>Aby korzystać z funkcji kymografu, określić pozycję x-y osi kymografu w taki sposób, aby umożliwić detekcję wiązania między kulkami.</li>
	<li>W trakcie pomiaru skład buforu można łatwo zmieniać, przenosząc kulki do różnych kanałów lub zmieniając bufor dostarczany w systemie mikroprzepływowym.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przetwarzanie wstępne surowych danych
	<ol>
		<li>Za pomocą prostego skryptu wykonaj downsampling surowych danych w stopniu wystarczającym, aby (i) przyspieszyć późniejsze przetwarzanie danych, ale (ii) nadal zachować wszystkie krytyczne informacje (Rysunek 4A). Zazwyczaj do tego celu odpowiedni jest zakres 100-5000 Hz. 
		UWAGA: Częstotliwość zbierania danych w eksperymentach z pęsetą optyczną jest często wyższa niż jest to konieczne do analizy – w przedstawionych eksperymentach domyślna częstotliwość zbierania danych wynosi 78 125 Hz. Ze względu na ograniczoną przestrzeń dyskową, zmniejszenie częstotliwości próbkowania danych jest wygodne i pozwala zaoszczędzić czas. W tym przypadku surowe dane poddano downsamplingowi z współczynnikiem 30.</li>
		<li>Następnie zastosuj filtr sygnału, aby zredukować wysokoczęstotliwościowy szum pomiarowy z sygnału (Rysunek 4A). Dostosuj stopień filtra oraz parametry częstotliwości odcięcia, aby zoptymalizować wyniki danych dla różnych eksperymentów (Rysunek 5). 
		UWAGA: Wśród filtrów sygnałów jeden z najszerzej stosowanych jest filtr Butterwortha51. W danych uzupełniających udostępniono napisany na zamówienie skrypt w języku python, umożliwiający przetwarzanie wstępne surowych danych. Parametry downsamplingu i filtrowania sygnału (częstotliwość odcięcia, stopień filtra) muszą zostać zoptymalizowane dla różnych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do analizy danych z rampy siły zastosuj następujące kroki.
	<ol>
		<li>Oznacz stopnie unfoldingu albo ręcznie, znajdując odpowiednie punkty na wykresie trajektorii siły, albo za pomocą napisanych na zamówienie skryptów. Stopnie unfoldingu charakteryzują się nagłym spadkiem siły połączonym ze wzrostem odległości na krzywej siła-odległość (FD).</li>
		<li>Po oznaczeniu zdarzeń unfoldingu dopasuj różne regiony krzywej FD, korzystając z odpowiednich modeli (Rysunek 4D). 
		UWAGA: Dla regionu przed pierwszym stopniem unfoldingu tether można uznać za „dwuniciowy” i powszechnie dopasowuje się go przy użyciu rozciągliwego modelu łańcucha podobnego do robaka (WLC)47,52,53. Fragmenty po pierwszym zdarzeniu unfoldingu są traktowane jako kombinacja nukleotydów dwuniciowych (uchwytów) i nukleotydów jednoniciowych (unfoldingowanej cząsteczki RNA). Dlatego dopasowanie danych jest bardziej złożone – zazwyczaj stosuje się kombinację dwóch modeli WLC lub modeli WLC i łańcucha swobodnie przegubowego (FJC)36,39,52. Rozciągliwy model WLC posiada dwa główne parametry dopasowania: długość konturową (LC) oraz długość persistencji (LP). Długość konturowa odpowiada długości całkowicie rozciągniętej cząsteczki, a długość persistencji definiuje właściwości zginania badanej cząsteczki. Model ten można opisać następującym równaniem (1). WLC może być używany do modelowania zachowania zarówno regionów sfałdowanych, jak i unfoldingowanych, choć dla każdego z nich należy zastosować osobny model z różnymi parametrami. 
		(1) <img alt="Równanie modelu łańcucha podobnego do robaka, \(X_{WLC}=L_C[1-\frac{1}{2}(\frac{k_BT}{F\cdot L_p})^{1/2}+\frac{F}{S}]\)." src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie x to rozciągnięcie, LC to długość konturowa, F to siła, LP to długość persistencji, kB to stała Boltzmanna, T to temperatura termodynamiczna, a S to moduł rozciągliwości. 
		Drugi model, nazywany łańcuchem swobodnie przegubowym (FJC), jest powszechnie używany do opisu zachowania unfoldingowanych regionów jednoniciowych. Wykorzystuje on podobne parametry polimerów, ale traktuje każdą jednostkę „łańcucha” jako sztywny pręt, co tutaj odpowiada nukleotydom unfoldingowanego regionu jednoniciowego. Poniższe równanie (2) opisuje ten model: 
		(2) <img alt="Wzór na rozciągnięcie elastycznego łańcucha polimerowego; równanie równowagi statycznej; do użytku badawczego." src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: Nasze laboratorium opracowało niedawno algorytm umożliwiający przetwarzanie wsadowe surowych danych z rampy siły o nazwie „Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54”. Algorytm wykonuje downsampling i filtrowanie danych, następnie identyfikuje możliwe stopnie unfoldingu, a na koniec przeprowadza dopasowanie danych. POTATO posiada przyjazny dla użytkownika graficzny interfejs użytkownika (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dane o stałej sile przetwarzaj w następujący sposób: 
	UWAGA: Poniższe instrukcje można analogicznie zastosować do danych o stałej pozycji.
	<ol>
		<li>W przypadku danych o stałej sile wykreśl odległość w funkcji czasu (Rysunek 5). Histogram pokazujący częstotliwość (liczbę wystąpień) różnych konformacji w funkcji względnej zmiany pozycji jest użytecznym sposobem charakteryzowania różnych stanów dominujących i mniejszościowych (Rysunek 7).</li>
		<li>Dopasuj histogram za pomocą (wielokrotnych) funkcji Gaussa, aby oszacować całkowity procent poszczególnych konformerów przy danej sile (Rysunek 7C). Dopasowania Gaussa, średnia pozycja i odchylenie standardowe zarysowują zależność od siły między różnymi populacjami. 
		UWAGA: W danych uzupełniających udostępniono napisany na zamówienie skrypt w języku python, umożliwiający przetwarzanie wstępne i podstawowe bimodalne dopasowanie Gaussa dla danych o stałej sile. Parametry (częstotliwość odcięcia, stopień filtra, oczekiwane średnie, wartości odchylenia standardowego i amplitudy) muszą zostać zoptymalizowane dla różnych eksperymentów.</li>
		<li>Następnie zastosuj ukryty model Markowa (Hidden Markov model), aby dalej analizować stany, co może ujawnić dodatkowe produkty pośrednie fałdowania (konformery)55. Dalsze informacje na temat stałej siły i ukrytego modelu Markowa można znaleźć w55,56,57,58.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj demonstrujemy zastosowanie pęsety optycznej sprzężonej z fluorescencją do badania interakcji i dynamicznego zachowania cząsteczek RNA z różnymi ligandami. Poniżej omówiono krytyczne kroki i ograniczenia obecnej techniki.
Krytyczne kroki w protokole Podobnie jak w przypadku wielu innych metod, jakość próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych. Dlatego, aby uzyskać próbki o jak najwyższej jakości, warto poświęcić czas na optymalizację procedury prz...

Transfer informacji genetycznej z DNA do białek za pośrednictwem mRNA to złożony proces biochemiczny, który jest precyzyjnie regulowany na wszystkich poziomach poprzez makromolekularne interakcje wewnątrz komórek. Dla regulacji translacji interakcje RNA-białko odgrywają kluczową rolę w szybkim reagowaniu na różne bodźce i sygnały1,2. Niektóre interakcje RNA-białko wpływają na stabilność mRNA, a tym samym zmieniają czas, w którym RNA jest aktywne translacyjnie. Inne interakcje RNA-białko są związane z mechanizmami kodowania, takimi jak odczyt kodonu stop, omijanie lub programowane rybosomalne przesunięcie ramki (PRF)3,4,5,6,7. Ostatnio wykazano, że wiele białek wiążących RNA (RBP) oddziałuje ze stymulującymi elementami mRNA i maszynerią translacyjną, aby dyktować, kiedy i ile przekodowania nastąpi w komórce7,8,9,10,11. W związku z tym, aby przeanalizować rolę białek wiążących RNA w translacji oraz sposób, w jaki modulują one strukturę i stabilność RNA, kluczowe jest szczegółowe zbadanie zasad interakcji i właściwości mechanicznych tych kompleksów RNA-białko.
Dziesięciolecia pracy położyły podwaliny pod badanie wieloetapowego i wieloskładnikowego procesu translacji, który opiera się na skomplikowanej komunikacji między RNA a składnikami białkowymi maszynerii translacyjnej, aby osiągnąć szybkość i dokładność12,13,14. Kolejnym kluczowym krokiem w zrozumieniu złożonych zdarzeń regulacyjnych jest określenie sił, skal czasowych i determinantów strukturalnych podczas translacji z dużą precyzją12,15,16,17. Badania dynamiki konformacyjnej RNA, a zwłaszcza tego, jak czynniki pomocnicze działające transakcyjnie wpływają na strukturę RNA podczas translacji, zostały dodatkowo naświetlone przez pojawienie się narzędzi jednocząsteczkowych, w tym pęsety optycznej lub falowodów w trybie zerowym16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26.
Pęseta optyczna (OT) reprezentuje wysoce precyzyjną technikę pojedynczej cząsteczki, która została zastosowana do badania wielu rodzajów procesów dynamicznych zależnych od RNA, w tym transkrypcji i translacji26,27,28,29,30,31,32. Zastosowanie pęsety optycznej pozwoliło na szczegółowe zbadanie oddziaływań molekularnych, struktur kwasów nukleinowych i właściwości termodynamicznych, kinetyki i energetyki tych procesów16,17,22,33,34,35,36,37,38,39. Test pęsety optycznej opiera się na uwięzieniu mikroskopijnych obiektów za pomocą skupionej wiązki laserowej. W typowym eksperymencie OT cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest uwiązana między dwoma przezroczystymi (zwykle polistyrenowymi) koralikami (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)27. Koraliki te są następnie chwytane przez pułapki optyczne, które zachowują się jak sprężyny. W ten sposób siłę przyłożoną do cząsteczki można obliczyć na podstawie przemieszczenia kulki od środka skupionej wiązki laserowej (środek pułapki). Ostatnio pęsety optyczne zostały połączone z mikroskopią konfokalną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B), umożliwiając pomiary fluorescencji lub rezonansu Förstera (FRET)40,41,42. Otwiera to zupełnie nowe pole możliwych eksperymentów pozwalających na jednoczesny pomiar, a tym samym precyzyjną korelację danych spektroskopii sił i fluorescencji.
Tutaj demonstrujemy eksperymenty z użyciem pęsety optycznej połączonej z mikroskopią konfokalną do badania interakcji białko-RNA regulujących translacyjne przesunięcie ramki. Pomiędzy obiektywem a skraplaczem znajduje się komora przepływowa z pięcioma kanałami, która umożliwia ciągłe nanoszenie próbki z przepływem laminarnym. Za pośrednictwem kanałów mikroprzepływowych różne składniki mogą być wstrzykiwane bezpośrednio, co skraca czas pracy ręcznej, a także pozwala na bardzo małe zużycie próbki podczas całego eksperymentu.
Po pierwsze, zaproponowano podstawowe wytyczne pomocne w projektowaniu eksperymentów OT oraz omówiono zalety i pułapki różnych konfiguracji. Następnie opisano przygotowanie próbek i eksperymentalne przepływy pracy, a także przedstawiono protokół analizy danych. Aby przedstawić przykład, przedstawiamy wyniki uzyskane z eksperymentów rozciągania RNA w celu zbadania elementu RNA SARS-CoV-2 zmieniającego ramkę ramki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) z czynnikiem transdziałającym krótką izoformą białka przeciwwirusowego palca cynkowego (ZAP), która zmienia translację wirusowego RNA z alternatywnej ramki odczytu43. Ponadto wykazano, że rybosomy znakowane fluorescencją można zastosować w tym teście konfokalnym OT, co byłoby przydatne do monitorowania procesyjności i szybkości maszynerii translacyjnej. Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do szybkiego przetestowania wpływu różnych, ligandów lub innych składników komórkowych w celu zbadania różnych aspektów translacji. Na koniec omówiono typowe pułapki eksperymentalne i sposoby ich rozwiązywania. Poniżej przedstawiono kilka kluczowych punktów w projektowaniu eksperymentalnym.
Zbuduj projekt 
Zasadniczo istnieją dwa powszechne podejścia do tworzenia konstruktu RNA zgodnego z OT. Pierwsze podejście wykorzystuje długą cząsteczkę RNA, która jest hybrydyzowana z komplementarnymi uchwytami DNA, uzyskując w ten sposób konstrukt składający się z dwóch hybrydowych regionów RNA / DNA flankujących jednoniciową sekwencję RNA w środku (<silna klasa = "xfig">Figura 2B). To podejście jest stosowane w większości eksperymentów OT RNA33,44,45.
Drugie podejście wykorzystuje uchwyty dsDNA z krótkimi (około 20 nt) zwisami15,17. Te zwisy są następnie hybrydyzowane z cząsteczką RNA. Chociaż jest to bardziej skomplikowane w konstrukcji, zastosowanie uchwytów dsDNA przezwycięża niektóre ograniczenia systemu hybrydowego DNA/RNA. W zasadzie można zastosować nawet bardzo długie uchwyty (>10kb), co jest wygodniejsze w przypadku pomiarów konfokalnych. Ponadto cząsteczka RNA może być ligowana do uchwytów DNA w celu zwiększenia stabilności uwięzi.
Strategia etykietowania końcowego 
Konstrukt musi być przywiązany do koralików poprzez silne oddziaływanie molekularne. Chociaż dostępne są metody kowalencyjnego wiązania uchwytów z koralikami46, silne, ale niekowalencyjne interakcje, takie jak streptawidyna-biotyna i digoksygenina-przeciwciało, są powszechnie stosowane w eksperymentach OT15,33,35,45. W opisanym protokole konstrukt jest znakowany biotyną lub digoksygeniną, a kulki są pokryte odpowiednio streptawidyną lub przeciwciałami przeciwko digoksygeninie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Takie podejście byłoby odpowiednie do przykładania sił do około 60 pN (na uwięzi)47. Co więcej, zastosowanie różnych strategii etykietowania 5' i 3' pozwala określić orientację linki utworzonej między koralikami17.
Znakowanie białek do pomiarów fluorescencji 
W przypadku obrazowania konfokalnego istnieje kilka powszechnie stosowanych podejść do znakowania fluorescencyjnego. Na przykład fluorofory mogą być kowalencyjnie przyłączone do reszt aminokwasowych, które znajdują się natywnie w białkach lub są wprowadzane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce przez reaktywną grupę organiczną. Barwniki tiolowe lub aminowo-reaktywne mogą być stosowane odpowiednio do znakowania reszt cysteiny i lizyny. Istnieje kilka odwracalnych metod ochrony w celu zwiększenia specyficzności etykietowania48,49, jednak natywne białka są zazwyczaj znakowane wieloma resztami. Chociaż mały rozmiar fluoroforu może dawać przewagę, niespecyficzne znakowanie może zakłócać aktywność białka, a zatem intensywność sygnału może się różnić49. Ponadto, w zależności od skuteczności etykietowania, intensywność sygnału może się różnić w zależności od eksperymentu. Dlatego przed eksperymentem należy przeprowadzić kontrolę aktywności.
W przypadku, gdy interesujące białko zawiera znacznik N- lub C-końcowy, taki jak znacznik Hisa lub znacznik paciorkowca, specyficzne etykietowanie tych znaczników stanowi inne popularne podejście. Co więcej, etykietowanie ukierunkowane na znaczniki zmniejsza ryzyko zakłóceń aktywności białka przez fluorofor i może zwiększyć rozpuszczalność49. Jednak znakowanie specyficzne dla znacznika zwykle daje białka znakowane monofluoroforem, które mogą być trudne do wykrycia. Inny sposób specyficznego znakowania można osiągnąć poprzez zastosowanie przeciwciał.
Konfiguracja mikrofluidyki 
Połączenie OT z systemem mikrofluidycznym pozwala na szybkie przejście między różnymi warunkami eksperymentalnymi. Co więcej, obecne systemy wykorzystują utrzymywanie przepływu laminarnego wewnątrz komory przepływowej, co wyklucza mieszanie cieczy z innych kanałów w kierunku prostopadłym względem kierunku przepływu. Dlatego przepływ laminarny jest szczególnie korzystny dla projektu eksperymentalnego. Obecnie powszechnie stosuje się komory przepływowe z maksymalnie 5 kanałami (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).

<table><tbody><tr><td><silne>szczepy bakteryjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>kolekcja laboratoryjna</td><td>Nie dotyczy</td><td>klonowania wektorów</td></tr> <tr><td>< silnych> chemikaliów i enzymów< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotynylacja</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td></td></tr><tr><td>Katalazy</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>System skanowania tlenu</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>DNAzy I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Transkrypcja in vitro</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>System scavanger tlenu</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>System scavanger</td></tr><tr><td>tlenu HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Montaż Gibsona, klonowanie</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polimeraza</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pirofosfotaza, termostabilna, nieorganiczna</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>Inhibitor RNazy transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td></td><td>Molox</td><td>1000379515</td><td></td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>life technologies</td><td>R0481</td><td>transkrypcja in vitro</td></tr><tr><td>Tiosulofat sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>Dezaktywacja wybielacza</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>pomiary konfokalne</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>Biotynylacja</td></tr><tr><td>T5 egzonukleaza</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>Montaż Gibsona, klonowanie</td></tr><tr><td>polimerazy RNA T7</td><td>Wyprodukowany we własnym</td> zakresie <td>transkrypcja in vitro</td>N<td>/A</td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ligaza Taq</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Montaż Gibsona, klonowanie</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr> <tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania białek monolitycznych RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>Używany do znakowania rybosomów</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>Rybosomy używane do znakowania</td></tr><tr><td><silne>oligonukleotydy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' uchwyt T7 forward</td><td>Microsynth</td><td>na zamówienie</td> <td>niestandardowe5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', służy do generowania szablonu transkrypcji OT in vitro w PCR 1</td></tr><tr><td>3' obsługa odwrotna</td><td>Mikrosyntezator</td><td>na zamówienie</td><td>niestandardowe 5' -&nbsp; GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', służy do generowania szablonu transkrypcji OT in vitro w PCR 1</td></tr><tr><td>5' uchwyt naprzód</td><td>Mikrosyntezator</td><td>na zamówienie niestandardowe</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , służy do generowania uchwytu 5' w PCR 2</td></tr><tr><td>5' uchwyt odwrotny</td><td>Mikrosyntezator</td> na <td>zamówienie</td><td>niestandardowe 5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', służy do generowania uchwytu 5' w PCR 2</td></tr><tr><td>3' uchwyt do przodu</td><td>Microsynth</td><td>na zamówienie niestandardowe</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3', służy do generowania uchwytu 3' w PCR 3</td></tr>' <tr><td>uchwytu 3' wstecznego 5' znakowany digoksygeniną</td><td>Mikrosyntezator</td><td>na zamówienie</td><td>niestandardowe 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCCCCCGTTATCC - 3', używany do generowania uchwytu 3' w wektorach PCR 3</td></tr><tr><td>DNApMZ_OT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>produkowanych we własnym zakresie</td><td>N/A</td><td>dalszy opis w "Badania strukturalne białka Cardiovirus 2A ujawniają molekularne podstawy rozpoznawania RNA i kontroli translacyjnej" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>Software and algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>POTATO</td><td></td> https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNAstructure</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><silny>Inny</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cząstki polistyrenu pokryte streptawidyną, 1,5-1,9 i mikro; m, 5 ml, 1.0% w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>Cząstki polistyrenu powlekane anty-digoksygeniną, 2,0-2,4 i mikro; m, 2 ml, 0,1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; Pęseta optyczna sprzężona z mikroskopią konfokalną</td></tr></tbody></table>

pęseta optyczna do badania interakcji rna-białko w regulacji translacji

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA przyjmuje różnorodne fałdy strukturalne, które są niezbędne dla jego funkcji, a tym samym mogą wpływać na różne procesy w komórce. Ponadto struktura i funkcja RNA może być modulowana przez różne czynniki transakcyjne, takie jak białka, metabolity lub inne RNA. Na przykład cząsteczki RNA z przesunięciem ramki są regulatorowymi RNA zlokalizowanymi w regionach kodujących, które kierują translację rybosomów do alternatywnej otwartej ramki odczytu, a tym samym działają jako przełączniki genów. Mogą również przyjmować różne fałdy po związaniu się z białkami lub innymi faktorami trans. Aby przeanalizować rolę białek wiążących RNA w translacji oraz sposób, w jaki modulują one strukturę i stabilność RNA, kluczowe jest jednoczesne badanie wzajemnych oddziaływań i cech mechanicznych tych kompleksów RNA-białko. Praca ta ilustruje, w jaki sposób można wykorzystać pęsetę optyczną sprzężoną z pojedynczą cząsteczką i fluorescencją do zbadania konformacyjnego i termodynamicznego krajobrazu kompleksów RNA-białko w wysokiej rozdzielczości. Jako przykład opracowano interakcję zaprogramowanego przez SARS-CoV-2 rybosomalnego elementu przesuwnego ramki z krótkim izoformem czynnika transdziałającego białka przeciwwirusowego palca cynkowego. Ponadto rybosomy znakowane fluorescencyjnie monitorowano za pomocą jednostki konfokalnej, co ostatecznie umożliwiło badanie wydłużenia translacji. Test OT sprzężony z fluorescencją może być szeroko stosowany do badania różnych kompleksów RNA-białko lub czynników transaktywnych regulujących translację i może ułatwić badania nad regulacją genów opartą na RNA.

W tej sekcji skupiono się głównie na pomiarach oddziaływań RNA-białko/ligand za pomocą fluorescencyjnej pęsety optycznej. Opis ogólnych eksperymentów z wykorzystaniem pęsety optycznej dla RNA oraz odpowiadające im reprezentatywne wyniki przedstawiono w 32. Bardziej szczegółowe omówienie oddziaływań RNA/DNA-białko znajduje się również w 1,2,26,59,<sup class="xr...

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Ogólnym celem poniższego artykułu dotyczącego metody jest zademonstrowanie protokołu przydatnego do badania interakcji RNA z białkami lub innymi czynnikami za pomocą pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopią konfokalną. W ciągu ostatniej dekady opracowano kilka zaawansowanych technik w celu zbadania właściwości pojedynczych makrocząsteczek. Jedną z tych technik jest pęseta optyczna z pojedynczą cząsteczką.Dzięki nowej pęsetie optycznej wspomaganej fluorescencją można szczegółowo monitorować nie tylko siły wymagane do rozwijania cząsteczek RNA, ale także zdarzenia wiązania podczas translacji. Tutaj skupiamy się na pomiarach, w których cząsteczki RNA są rozciągane z czynnikami transakcyjnymi regulującymi translację i bez nich. Ilustrujemy również, w jaki sposób technika ta może być zastosowana do monitorowania translacji za pomocą znakowanych rybosomów.Protokół zostanie zademonstrowany przez dwóch doktorantów z mojej grupy, Lukasa Pekarka i Stefana Parka. W tym filmie przeprowadzimy Cię przez proces konfiguracji i wykonania eksperymentu z pęsetą optyczną. Przedstawiamy również prosty proces pracy związany z analizą danych.Zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i solidna. Cząsteczka jest uwiązana między dwoma koralikami, przywiązana do ogniska wiązek laserowych, a zmiana i siła po przemieszczeniu mogą być precyzyjnie zmierzone w tak zwanych eksperymentach z rampą siły. Struktury drugorzędowe wewnątrz uwięzi rozwijają się z określoną siłą w zależności od energii wewnętrznej cząsteczki.To dynamiczne przejście między wieloma strukturami może być dalej badane za pomocą pomiarów stałej siły. Co więcej, równoległe zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego może być wykorzystywane do wizualizacji zdarzeń wiązania w czasie rzeczywistym. Wyraźny profil siły-odległości uwięzi może się różnić po związaniu potencjalnych czynników transakcyjnych, które wpływają na jej stabilność.Po pierwsze, interesujące nas RNA musi zostać sklonowane do wektora DNA. Przed i za tą sekwencją, dodatkowe części, uchwyty są potrzebne do związania końcowego konstruktu DNA-RNA między kulkami. Po udanym sklonowaniu i amplifikacji plazmidu przeprowadza się trzy różne reakcje PCR.Dla każdej reakcji PCR należy wymieszać odczynniki zgodnie z tabelą pierwszą w protokole. Uruchom PCR w 50 mikrolitrowych porcjach w odpowiednim termocyklerze. W pierwszym z nich powstaje dwuniciowe DNA całego konstruktu z promotorem T7 do późniejszej transkrypcji in vitro.Drugi PCR wytwarza pięć głównych uchwytów. Natomiast ostatnia reakcja skutkuje trzema pierwszymi uchwytami. Zarówno 5 głównych, jak i 3 głównych uchwytów muszą być oznaczone zgodnie z użytymi koralikami.Trzy główne uchwyty są znakowane podczas PCR za pomocą odwróconego startera znakowanego digoksygeniną, a pięć głównych uchwytów musi być znakowanych w dodatkowym kroku przez biotynylację. Trzy główne biotynylacje pięciu głównych uchwytów przeprowadza się przy użyciu T 40 i polimerazy. Reakcję przeprowadza się przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej.Następnie przeprowadź transkrypcję in vitro przy użyciu polimerazy T7. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni przez dwie do czterech godzin, w zależności od długości RNA. W ostatnim etapie uchwyty są wyżarzane RNA z transkrypcji in vitro, aby uzyskać końcowy konstrukt DNA-RNA z jednoniciowym regionem zainteresowania między dwuniciowymi uchwytami.Aby wyżarzyć pożądaną hybrydę RNA-DNA, wymieszaj uchwyty i RNA w buforze do wyżarzania. Podgrzej mieszaninę wyżarzania do 85 stopni przez 10 minut, a następnie powoli schładzaj próbkę do czterech stopni. Wyżarzoną próbkę zmieszać z 1/10 objętości trzech molowych octanów sodu i trzema objętościami lodowatego etanolu i inkubować w temperaturze minus 80 stopni przez co najmniej godzinę.Odwirować próbki o stężeniu 15 000 xg przez 30 minut w temperaturze czterech stopni. Wyrzucić supernatant i wysuszyć osad w próżni. Małe porcje zawieszonego osadu zamraża się w ciekłym azocie i utrzymuje w temperaturze minus 80 stopni do momentu ich użycia.Najpierw wyjmij wybielacz ze strzykawek i wlej jeden ml wody wolnej od RNazy. Dodaj 50 mikrolitrów 0,5-molowego tiosiarczanu sodu i umyj układ jednym barem. Należy uważać, aby układ mikroprzepływowy nigdy nie pracował na sucho, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w układzie.Następnie wyrzucić pozostały roztwór tiosiarczanu sodu i wymienić strzykawki na nowe. Następnie ponownie przemyj co najmniej 0,5 ml wody wolnej od RNaz. Aby ustawić układ optyczny maszyny, nałóż dwie krople olejku immersyjnego na obiektyw.Umieść kuwetę przepływową na miejscu i podnieś obiektyw, aż ciecz dotknie komory przepływowej. Następnie umieść dwie krople olejku immersyjnego na wierzchu komory przepływowej. Teraz włącz jednostkę sterującą pułapką i laser pułapkowania.Obiektyw jest regulowany za pomocą szukacza Z w kamerach diagnostycznych maszyny. Obracając mikrośrubę, oś Z jest ustawiana do środka komory pomiędzy drugim a trzecim odbiciem. Gdzie pierścienie załamania światła są największe.Przełącz kamery diagnostyczne w tryb księżycowy i zmniejsz laser pułapkujący do około 50%Następnie opuść kondensator i dostosuj jego położenie, aby zobaczyć około 10 pasm światła. Komora pomiarowa ma pięć kanałów, a przed eksperymentem należy rozważyć różne możliwości konfiguracji. Dla prostego eksperymentu z rampą siły, koraliki-bufor-koraliki to wygodny układ kanałów.W przypadku pomiarów z czwartym związkiem, takim jak rybosomy fluorescencyjne lub czynniki transakcyjne, współczynnik kulki-kulki-bufor jest lepszym układem, ale utrudnia złapanie kulek. Podwielokrotność wyżarzonego konstruktu inkubuje się z trzema mikrolitrowymi zawiesinami kulek AD, jednym mikrolitrowym inhibitorem RNazy i ośmioma mikrolitrami buforu testowego w temperaturze pokojowej przez 10 do 20 minut. Następnie próbkę rozcieńcza się w buforze testowym o pojemności 500 mikrolitrów i umieszcza w odpowiednim kanale.W przypadku drugiego rodzaju kulek 0,8 mikrolitra kulek testowych miesza się z jednym ml buforu testowego i podaje do odpowiedniego kanału. Kanały są otwierane i myte pod niskim ciśnieniem. Teraz włącz laser pułapkowy.Aby złapać koraliki, lasery są odsuwane od siebie, a koralik AD jest chwytany w pułapkę pierwszą. Następnie stolik jest przenoszony do kanału stopki SA, a koralik jest łapany w pułapkę drugą. Aby uniknąć zgubienia koralików lub złapania drugiego w tę samą pułapkę, stolik jest przenoszony do kanału buforowego i wszystkie kanały są zamykane.W buforze przeprowadzana jest kalibracja pułapki. Złapane koraliki należy ustawić jako wizualne szablony do kolejnych pomiarów. A wynik podobieństwa powinien być utrzymywany powyżej 90% między pomiarami, aby zagwarantować porównywalność.Na koniec koraliki zbliżają się do siebie i można zacząć łapać pojedynczą linkę. Odbywa się to poprzez zbliżenie koralików na kilka sekund, a następnie ponowne powolne opuszczenie koralików. Formacja linki powoduje wzrost mierzonej siły po odciągnięciu dwóch koralików od siebie.Liczbę i jakość uwięzi można sprawdzić, znajdując plateau nadmiernego rozciągania i porównując trajektorię z modelem swobodnie łączonego łańcucha lub łańcucha ślimakowego. Nadmierne rozciąganie plateau powinno wynosić od 50 do 60 piconewton dla pojedynczej uwięzi. Aby wykonać pomiary fluorescencji, włącz lasery konfokalne i zliczanie fotonów na urządzeniu i pęsetie optycznej.Następnie włącz laser wzbudzający o żądanej długości fali i interfejs oprogramowania i ustaw moc lasera na 5% lub więcej, w zależności od fluoroforu. Teraz obrazowanie można rozpocząć za pomocą funkcji obrazu lub kimografu w oprogramowaniu. Aby uzyskać dobrze ostre obrazy, upewnij się, że płaszczyzna ogniskowa mikroskopu konfokalnego i pułapki optyczne są wyrównane.W tym celu można zastosować autofluorescencję kulek polistyrenowych w kanale niebieskiego lasera. Poruszaj się w górę i w dół wraz z płaszczyzną ogniskową pułapek optycznych, aż autofluorescencja kulek osiągnie najwyższą średnicę. W tej pozycji można wykryć sygnały fluorescencyjne zachodzące w cząsteczce na uwięzi.W przypadku obu funkcji ważne jest, aby wybrać odpowiednie obszary zainteresowania. W trakcie pomiaru skład bufora można łatwo zmienić, przesuwając kulki do różnych kanałów lub zmieniając bufor dostarczany w układzie mikroprzepływowym. Aby uniknąć fotowybielania, zawsze wyłączaj laser wzbudzający, gdy nie wykonujesz pomiaru.Surowe dane wyjściowe z urządzenia często zawierają dużo szumów. Dlatego, aby dalej analizować rozproszone dane, należy je najpierw wstępnie przetworzyć. Pierwszym krokiem jest zmniejszenie próbki i przefiltrowanie danych za pomocą dolnoprzepustowego filtra Butterwortha, uzyskano dobre wyniki.W przypadku eksperymentów z rampą siły, rozwijające się zdarzenia muszą być oznaczone w odpowiednich zagiętych i rozłożonych obszarach pierwszej krzywej odległości, które można dopasować za pomocą łańcucha ślimakowego lub swobodnie łączonych modeli łańcuchowych. W przypadku danych o stałej sile można wykreślić odległość w czasie i przydatne jest wygenerowanie histogramu w celu ilościowego określenia dominującej konformacji przy danej sile. Tutaj pokazano, że parametry filtra mają kluczowe znaczenie dla rozróżnienia różnych stanów składania.Aby lepiej zrozumieć, co można osiągnąć za pomocą tej techniki, przedstawiono kilka reprezentatywnych wyników. Tak wygląda standardowa krzywa siła-odległość z eksperymentu z rampą siły. W tym przypadku badaliśmy element przesunięcia ramy SARS-coronavirus-2.Zaobserwowaliśmy, jak rozwija się w wielu krokach około 15 piconewton. Kiedy kierunek jest odwrócony, a koraliki ponownie się zbliżają, linka składa się z powrotem z nieco mniejszą siłą. Kiedy zmierzyliśmy ten sam RNA w obecności białka przeciwwirusowego ZAP palca cynkowego, zaobserwowano podobny wzorzec rozwijania się.Ale drugorzędowa struktura RNA nie uległa ponownemu fałdowaniu. Jest to dobry przykład pokazujący, jak duży wpływ może mieć wiązanie białek na kinetykę RNA. Patrząc na dane dotyczące stałej siły, kinetyka rozwijania może być dalej badana.Odległość w czasie jest wykreślana dla różnych sił, a histogram różnych obserwowanych stanów jest dodawany po prawej stronie. Przy 10 pikonewtonach RNA jest całkowicie w stanie złożonym. Przy 11,5 pikonewtonie przełącza się między stanami, a przy 13 pikonewtonach RNA jest stale w stanie rozwiniętym.Jednak, gdy element przesunięcia ramki SARS-coronavirus-2 został zmierzony razem z ZAP, RNA był całkowicie w stanie rozwiniętym przy 11 pikonewtonach, a nawet wykazywał bardzo małe przejście w stan zagięty przy 10 pikonewtonach. Oznacza to, że ZAP wiąże się z jednopasmowym elementem przesuwającym ramę i zapobiega tworzeniu się struktury wtórnej. Na koniec przyjrzymy się niektórym danym z pęsety optycznej w połączeniu z mikroskopią konfokalną.W tym eksperymencie użyto barwnika fluorescencyjnego, który znakuje dwuniciowe kwasy nukleinowe, niespecyficznie z rosnącą siłą. Kymograf pokazuje, że gdy koraliki są odsuwane od siebie, intensywność fluorescencji wzrasta i całkowicie zanika, gdy linka jest zbyt mocno rozciągnięta i pęka. Na ostatnim rysunku fluorescencyjnie znakowane rybosomy zostały dodane przez kanał czwarty.W tym eksperymencie zaobserwowano specyficzne wiązanie rybosomów z uwięzią RNA. Mamy nadzieję, że ten film dał Ci wgląd w pęsetę optyczną i to, co można wykonać tą niesamowitą techniką.

optical-tweezers-to-study-rna-protein-interactions-translation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

W tej metodzie, określamy ilościowo powinowactwo wiązania białek wiążących RNA (RBP) do pokrewnych i niepokrewnych miejsc wiązania za pomocą prostego, żywego, reporterowego testu w komórkach bakteryjnych. Test opiera się na represji genu reporterowego.

Test do ilościowego określania wiązania białka-RNA u bakterii

Test podwójnej linijki DNA został opracowany w celu określenia pozycji mRNA podczas translokacji rybosomów, która opiera się na siłach dysocjacji utworzonych dupleksów DNA-mRNA. Dzięki rozdzielczości pojedynczego nukleotydu i zdolności dotarcia do obu końców mRNA, może dostarczyć mechanistycznych spostrzeżeń na temat translokacji rybosomów i sondować przemieszczenia innych kwasów nukleinowych.

Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu

Transfer energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki to metoda, która śledzi dynamikę tRNA podczas syntezy białek rybosomalnych. Śledząc poszczególne rybosomy, identyfikuje się niejednorodne populacje, które rzucają światło na mechanizmy. Metoda ta może być wykorzystana do śledzenia biologicznych zmian konformacyjnych w ogóle, aby ujawnić zależności dynamiczno-funkcyjne w wielu innych złożonych biosystemach. W metodach jednocząsteczkowych można zaobserwować etapy nieograniczające szybkości i...

Badanie transferu energii fluorescencji pojedynczej cząsteczki w syntezie białek rybosomów

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę pęsety optycznej do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji. Technika łączy mikroskopię konfokalną z pomiarami sił rozwijania cząsteczek RNA w czasie rzeczywistym.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Przeglądaj więcej filmów