Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia specyficzną metodę mikroiniekcji dla Anopheles gambiae, która historycznie była trudna do przekształcenia przy użyciu powszechnych technik inżynierii genetycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że niezawodnie tworzy transgeniczne Anopheles gambiae. Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku nowych strategii eliminacji malarii poprzez ułatwianie tworzenia komarów odpowiednich do tłumienia populacji lub modyfikacji populacji dzikich typu Anopheles gambiae.

Metodologię tę można łatwo dostosować do różnych gatunków komarów. Nasza technologia mikroiniekcji wymaga cierpliwości i praktyki. Jest krzywa uczenia się.

Na początek użyj aspiratora, aby umieścić od 20 do 30 samic w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Upewnij się, że rurka jest rozcięta na obu końcach i pokryta lateksową folią dentystyczną na jednym końcu oraz nylonową siatką i bibułą filtracyjną na drugim, gdzie komary będą składać jaja. Umieść probówkę wypełnioną komarami na małej szalce Petriego wypełnionej podwójnie destylowaną wodą, a następnie umieść probówkę i naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 45 minut.

Wyjąć probówkę z inkubatora i włożyć ją do pustej klatki. Delikatnie postukaj w rurkę, aby komary mogły wylecieć. Wyjmij rurkę z klatki, gdy wszystkie komary wylecą.

Gdy rurka jest wolna od komarów, odkręć dolny pierścień, zdejmij nylon i za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z jajami z probówki. Umieść bibułę filtracyjną wypełnioną jajami na plastikowej szalce Petriego zawierającej warstwę bibuły filtracyjnej zwilżonej wodą. Umieść membranę na czystym szkiełku podstawowym i za pomocą czystych kleszczyków przykryj membranę kawałkiem bibuły filtracyjnej, pozostawiając około jednego milimetra filtra membranowego odkrytego.

Zwilż bibułę filtracyjną wodą dejonizowaną, a następnie za pomocą szczoteczki delikatnie przenieś od 30 do 50 zarodków na krawędź błony i ustaw jaja pionowo wzdłuż membrany. Ustaw jaja w tym samym kierunku, tak aby podczas obserwacji jaj pod mikroskopem mikroiniekcyjnym tylny koniec znajdował się w pozycji dolnej i tworzył z igłą kąt 15 stopni. Wyłóż całą krawędź błony jajkami.

Użyj końcówki do mikroładowarki, aby napełnić igły dwoma mikrolitrami mieszaniny DNA. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej. Wyrównaj igłę tak, aby tworzyła kąt 15 stopni z płaszczyzną szkiełka.

Otwórz końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jajka, a następnie włóż końcówkę igły na około 10 mikrometrów w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej. Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.

Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie została zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły. Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły staje się nieco większy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.

Wstrzyknąć około 40 do 50 jaj za pomocą jednej igły. Po zakończeniu wstrzyknięć spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 mililitrami wody dejonizowanej. Korzystając z tego protokołu, autonomiczny system sterowany genami został wprowadzony do linii zarodkowej laboratoryjnego szczepu G3 z Anopheles gambiae.

System został zaprojektowany tak, aby celować w ortolog kardynalny lub Agcd na trzecim chromosomie u tego gatunku. Pokazany jest plazmid pCO37. Zawiera endonukleazę Streptococcus pyogenes Cas9 pod kontrolą elementów regulatorowych ortologu genu nanos.

Dodatkowo posiada przewodnik RNA pod kontrolą promotora genu U6 i kasetę markera dominującego 3XP3 CFP wyrażającego cyjanowe białko fluorescencyjne. Podejścia molekularne potwierdziły dokładną insercję około 10 kilo par zasad DNA, które oznaczono jako AgNosCd-1. Szeroko zakrojone analizy uzupełniające wykazały, że AgNosCd-1 był wysoce wydajny w napędzie, tworzył niewiele opornych alleli i nie miał dużego obciążenia genetycznego ze względu na integrację i ekspresję systemu napędu genowego.

Homozygotyczny napęd genowy zawierający komary były mutantami o utracie funkcji, z larwami, poczwarkami i nowo pojawiającymi się dorosłymi osobnikami o fenotypie czerwonych oczu. Podczas próby zastosowania tego protokołu, utrzymanie w wieku 88 lat ma kluczowe znaczenie dla dobrego wylęgu jasnoszarych jaj i unikania białych jaj.