Name: Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji do wprowadzania obcych genów do zarodków Anopheles gambiae, umożliwiającą tworzenie transgenicznych komarów. Ta technika wspiera badania nad kontrolą wektorów malarii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Drusilli Stillinger, Kionie Parker, Parrishowi Powellowi i Madeline Nottoli za hodowlę komarów. Finansowanie zostało zapewnione przez Uniwersytet Kalifornijski, Irvine Malaria Initiative. AAJ jest profesorem Donalda Brena na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

1. Przygotowanie komarów do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Zasiej klatkę 13 (~5000 cm3) ~100 samcami i 200-300 samicami 1-2 dniowymi dorosłymi komarami po eklozji i pozwól im łączyć się w pary przez 2 dni.</li>
	<li>Po okresie godowym należy dostarczyć komarom posiłek z krwi, używając 2 ml krwi za pomocą sztucznego urządzenia do karmienia lub żywych znieczulonych zwierząt, w zależności od praktyk owadobójczych14. Następnego dnia zapewnij komarom drugi posiłek z krwi, aby upewnić się, że wszystkie kryte samice miały możliwość żerowania i że częściowo odżywione komary stały się w pełni nabrzmiałe.</li>
	<li>Wykorzystaj komary do pobrania zarodków 2-4 dni po drugim posiłku z krwi. 
	UWAGA: Odżywianie larw jest ważne dla odporności dorosłych osobników i sprawności reprodukcyjnej. Zobacz Benedict et al. (2020), aby uzyskać informacje o tym, jak hodować zdrowe owady14. Nie zaobserwowano istotnych różnic w składaniu jaj, gdy komary są karmione sztucznym karmnikiem lub żywymi znieczulonymi zwierzętami. Użyj dowolnej metody, która jest rutynowo stosowana w przypadku Anopheles gambiae u owadów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Użyj aspiratora, aby umieścić 20-30 samic w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 50 ml, która została przycięta (piłą taśmową) tak, aby była otwarta na obu końcach i pokryta lateksową folią dentystyczną na jednym końcu oraz nylonową siatką i bibułą filtracyjną na drugim (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: Komary złożą jaja na bibule filtracyjnej, a nylonowa siatka utrzyma bibułę filtracyjną bezpiecznie na miejscu. Jaja komarów mają kształt cylindryczny, ~500 μm długości, ~200 μm średnicy w najszerszym miejscu i zwężają się na przednim i tylnym końcu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Umieść probówkę wypełnioną komarami na małej (60 mm x 15 mm) szalce Petriego wypełnionej wodą podwójnie destylowaną (ddH2O). Umieść probówkę i naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 °C na 45 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Wyjąć probówkę z inkubatora i włożyć ją do pustej klatki. Delikatnie postukaj w rurkę, aby komary mogły wylecieć i wyjmij rurkę z klatki, gdy wszystkie komary wylecą.</li>
	<li>Gdy rurka jest wolna od komarów, odkręć dolny pierścień, zdejmij nylon i za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z jajami z probówki. Umieścić bibułę filtracyjną na plastikowej szalce Petriego (100 mm x 15 mm) zawierającej warstwę bibuły filtracyjnej zwilżonejddH2O.</li>
	<li>Obserwuj jaja. Jaja, które zestarzały się do punktu, w którym mają jasnoszary kolor (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) są gotowe do wyrównania.
	<ol>
		<li>Jeśli jaja są nadal białe, należy je umieścić z powrotem w inkubatorze i sprawdzać kolor co 5 minut. Białe jaja są kruche, łatwo pękają i nie przeżywają dobrze po procesie wstrzykiwania, co skutkuje niskim wylęgiem.</li>
		<li>Jaja, które są ciemnoszare lub czarne, za bardzo się zestarzały. Nie używaj ich.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wyrównanie zarodka
<ol>
	<li>Wytnij kawałek nylonowej membrany bibułkowej (2 cm x 1 cm) żyletką, upewniając się, że krawędź jest starannie przycięta. 
	UWAGA: Jeśli krawędź nie jest prosta, jaja nie pozostaną prawidłowo przymocowane do błony podczas procesu wstrzykiwania.</li>
	<li>Umieść membranę na szkiełku podstawowym i przykryj membranę kawałkiem bibuły filtracyjnej (2 cm x 2 cm), pozostawiając ~1 mm filtra membranowego odkrytego (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Przed użyciem upewnij się, że szkiełka mikroskopowe są czyste i użyj czystych kleszczyków do manipulowania filtrem membranowym.</li>
	<li>Zwilż bibułę filtracyjną dejonizowanymH2O, ponieważ jaja umrą, jeśli będą suszone przez dłuższy czas. 
	UWAGA: Nie nalewaj zbyt dużo wody na papier, ponieważ zarodki będą się poruszać podczas procesu wstrzykiwania, ale upewnij się, że jest wystarczająco dużo, aby zapobiec wysuszeniu zarodka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A, B). Nadmiar wody można usunąć, wchłaniając go kawałkiem bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Delikatnie przenieś 30-50 zarodków na krawędź błony za pomocą pędzla (rozmiar #0). Użyj szczoteczki, aby wyrównać jaja pionowo wzdłuż błony, delikatnie przetaczając je na szkiełku tak, aby strona brzuszna (wypukła) była skierowana do góry.</li>
	<li>Ustaw wszystkie jaja w tym samym kierunku, tak aby podczas obserwacji jaj pod mikroskopem mikroiniekcyjnym, tylny koniec (bardziej spiczasty, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A, B) znajdował się w dolnej pozycji i tworzył kąt ~ 15 ° z igłą (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 6C). Wyłóż całą krawędź błony jajami (30-50) i umieść szkiełko pod mikroskopem do wstrzykiwań. 
	UWAGA: Jajka dobieraj ostrożnie. Odrzuć te, które są białe (zbyt młode lub nierozwinięte) lub ciemnoszare (zbyt stare i złamią igłę), a także nienormalne (<silna klasa="xfig">Rysunek 7). Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje wilgotna przez cały czas.</li>
</ol>
4. Przygotowanie DNA
<ol>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA do wstrzyknięcia, co najmniej, za pomocą zestawu maxiprep plazmidu DNA wolnego od endotoksyn zgodnie z protokołami producenta.</li>
	<li>Zawiesić DNA w wodzie o czystości PCR i odwirować przy 17 100 x g w wirówce z chłodzeniem przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Następnie przenieść supernatant do nowej, czystej probówki stożkowej o pojemności 1,5 ml. Ostrożnie pipetować mikropipetą, aby uniknąć przenoszenia niepożądanych cząstek stałych z kolumny.</li>
	<li>Wykonaj drugie wytrącanie DNA, używając jednej dziesiątej objętości octanu sodu 3M i podwójnej objętości 100% etanolu. </li>
	<li>Ponownie zawiesić DNA w 300-500 μl wody klasy PCR, aby uzyskać końcowe stężenie plazmidu 1000 ng / μL. Wymieszaj koktajl plazmidowy w buforze do wstrzykiwań dla końcowego stężenia plazmidu 300-400 ng / μL i przygotuj 10-20 μl podwielokrotności. 
	UWAGA: DNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności DNA do mikroiniekcji mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub w temperaturze -80 °C w przypadku stosowania składników RNA. Nie należy przekraczać 800 ng/μl DNA w mieszance iniekcyjnej, ponieważ lepkość spowoduje zatkanie igieł.</li>
</ol>
5. Przygotowanie igły
<ol>
	<li>Wykonaj igły, ciągnąc 10 cm kapilary kwarcowe za pomocą programowalnego ściągacza do mikropipet.</li>
	<li>Zbadaj igłę pod mikroskopem, aby upewnić się, że końcówka jest dobrze uformowana. Upewnij się, że ustawienie igły na programowalnym ściągaczu daje końcówkę, która zaczyna zwężać się ~0,5 mm od końca końcówki i kończy się drobnym punktem (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 6). Igły, które łatwo się łamią, mają zwykle zbyt długi stożek. 
	UWAGA: Warunki mogą się różnić w zależności od ściągacza igłowego (Autorzy udostępnią na żądanie ustawienia używanego przez nich ściągacza programowalnego. Restrykcje dotyczące czasopism uniemożliwiają nam cytowanie konkretnej marki). Igły można ciągnąć ręcznie, ale wymaga to zestawu umiejętności niedostępnych w większości laboratoriów.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja zarodka
<ol>
	<li>Użyj końcówki do mikroładowarki, aby napełnić igły 2 μl mieszaniny DNA. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8).</li>
	<li>Ważne: Ustaw igłę tak, aby tworzyła kąt 15° z płaszczyzną szkiełka (Rysunek 8).</li>
	<li>Otworzyć końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jaja i wstrzyknąć ją, wkładając końcówkę igły ≤ 10 μm w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej.</li>
	<li>Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie jest zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły.</li>
		<li>Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły nieco się powiększy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.</li>
		<li>Wstrzyknij ~40-50 jaj za pomocą jednej igły. 
		UWAGA: Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje wilgotna przez cały czas. Utrzymać wystarczający nacisk wsteczny na igłę, aby utrzymać ją w czystości. Igłę, której nie można odblokować, należy wymienić na nową. Umieszczanie zarodków, wprowadzanie igły i wstrzykiwanie są łatwiejsze dzięki mikroskopom, które mają współosiowe sterowanie poziomym ruchem etapu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięć spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 ml dejonizowanego H2O (<klasa silna = "xfig">Rysunek 10). 
	UWAGA: Zarodki zaczynają się wykluwać 2 dni po wstrzyknięciu i mogą trwać nawet 3-5 dni. Wyklute larwy w pierwszym stadium rozwojowym należy natychmiast przenieść (sprawdzać 2 razy dziennie) do czystego pojemnika z wodą i pokarmem.</li>
</ol>

<ol><li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeramisco%2C+J+%22Microinjection.+Methods+and+Tools+in+Biosciences+and+Medicine%22">Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine</a>. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Meredith, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+expression+of+an+anti-malarial+gene+in+transgenic+Anopheles+gambiae+significantly+reduces+Plasmodium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections.</a> PLoS One. 6 (1), 14587(2011).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Simões, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anopheles+FBN9+immune+factor+mediates+Plasmodium+species-specific+defense+through+transgenic+fat+body+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Develomental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression.</a> Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).</li>
<li>Arik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Akt+signaling+in+the+mosquito+fat+body+increases+adult+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship.</a> FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).</li>
<li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+olfactory+centres+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature Communications. 7, 13010(2016).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+transgenic+multistage+effector-gene+combinations+for+Plasmodium+falciparum+suppression+in+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles.</a> Science Advances. 6 (20), (2020).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Anopheles+research.+Chapter+3%3A+Specific+Anopheles+techniques.+3.1+Embryonic+Techniques.+3.1.1+Microinjection+methods+for+Anopheles+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BEI+resources%22%5BJournal%5D)">Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos.</a> BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).</li>
<li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).</li>
<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki zwiększonej dostępności precyzyjnych i elastycznych technologii inżynierii genetycznej, takich jak CRISPR/Cas9, organizmy transgeniczne mogą być opracowywane w prostszy i bardziej stabilny sposób niż było to wcześniej możliwe. Narzędzia te pozwoliły naukowcom stworzyć transgeniczne szczepy wektorów komarów, które są bardzo bliskie osiągnięcia pożądanych właściwości odporności na patogeny (modyfikacja populacji) lub dziedzicznej bezpłodności (supresja populacji). Jednak, aby opracować możliwie najbezpieczniejsze i ...

Techniki mikroiniekcji były używane do eksperymentalnego manipulowania organizmami od początku XX wieku1. Mikroiniekcja została wykorzystana do zbadania zarówno podstawowych funkcji biologicznych, jak i / lub wprowadzenia ważnych zmian w biologii pożądanego organizmu. Technika mikroiniekcji jest szczególnie interesująca dla biologów wektorowych i jest szeroko stosowana do manipulowania genomami wektorów2-11. Eksperymenty transgenezy na wektorach stawonogów często mają na celu zmniejszenie wydajności wektorów w przenoszeniu patogenów poprzez wprowadzanie zmian, które zmniejszają przystosowanie wektora lub zwiększają ogniotrwałość przenoszonych patogenów. Komary przenoszą różne ludzkie patogeny i mają znaczący wpływ na zachorowalność i śmiertelność na całym świecie. Komary z rodzaju Anopheles przenoszą ludzkie patogeny pasożytnicze malarii, Plasmodium spp. Eksperymenty inżynierii genetycznej z udziałem Anopheles miały na celu lepsze zrozumienie biologii i zmniejszenie zdolności wektorowej tych komarów w celu opracowania nowych strategii eliminacji malarii.
Wektory komarów, które przyczyniają się do największej liczby infekcji malarią na świecie, znajdują się w kompleksie gatunków Anopheles gambiae. Jednak większość udanych eksperymentów z transgenezą przeprowadzono na nosicielu malarii z subkontynentu indyjskiego, Anopheles stephensi. Chociaż istnieje wiele zaadaptowanych laboratoryjnie szczepów Anopheles gambiae, liczba transgenicznych linii Anopheles gambiae spp. opisana w literaturze nie może się równać z liczbą Anopheles stephensi. Uważa się, że zarodek Anopheles gambiae jest trudniejszy do wstrzyknięcia i osiągnięcia udanej transgenezy niż Anopheles stephensi, chociaż przyczyny tych różnic są nieznane. Protokół ten opisuje metodę, która okazała się niezmiennie skuteczna w osiąganiu transgenezy zarodków Anopheles gambiae poprzez mikroiniekcję. Protokół opiera się na metodzie opracowanej wcześniej przez Hervé Bossina i Marka Benedicta12 z kilkoma dodatkowymi szczegółami i dodanymi zmianami, które zostały uznane za zwiększające efektywność transgenezy.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor do mikroiniekcji</td> <td>-</td><td></td> <td>1 mM bufor NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl Blotting</td></tr><tr><td>membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Starannie i prosto pokrojone na kawałek 2x1 cm</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml (jednorazowa probówka wirówkowa, polipropylen)</td><td>Marka Fisher</td><td></td><td>Końcówki cięte</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana lub podwójnie destylowana (ddH20)&nbsp;</td><td>Mili-Q</td><td></td><td>W butelce do mycia&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Leica MZ12</td><td>Kleszcze do wyrównywania zarodków</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Nr 5 rozmiar&nbsp;</td></tr><tr><td>Szklany pojemnik&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>No. 3140</td><td>125 x 65</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnia szklana&nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>No. 12-549-3</td><td>75x26 mm</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Barnsted Lab-line</td><td>Model nr 150</td><td>28 &deg; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>50 mM</td></tr><tr><td>Lateksowa folia dentystyczna&nbsp;</td><td>Crosstex International</td><td>No. 19302</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>XenoWorks Cyfrowy mikrowtryskiwacz</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z mikroładowarką&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>20 &mikro; L mikroładowarka epT.I.P.S.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instrument XenoWorks</td><td></td><td>Mikropipeta mikromanipulatora</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Deszcz&nbsp;</td><td></td><td>20 &mikro; L</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>Sutter P-2000 ściągacz</td><td></td>do mikropipet</tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>DM 1000 LED lub M165 FC</td><td>Do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Minimalna bibuła filtracyjna z włókna&nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>No. 05-714-4</td><td>Bibuła chromatograficzna, gruba&nbsp;</td></tr><tr><td>Komary&nbsp;</td><td>MR4, BEI Resources</td><td></td><td>Anopheles gambiae, kryte dorosłe samice, karmione krwią 4-5 dni po eklozji</td></tr><tr><td>bufor NaHPO4&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 mM, ph 6,8</td></tr><tr><td>Siatka</td><td></td><td></td><td></td>nylonowa</tr><tr><td>Pędzel Blick</td><td></td><td>nr 05831-7040</td><td>Drobny, rozmiar 4/0</td></tr><tr><td>Szalka</td><td></td><td></td> Petriego <td>Tworzywo sztuczne, (60x15 mm, 90x15 mm)</td></tr><tr><td>Octan</td><td></td><td></td> sodu<td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła kwarcowego 3M&nbsp;</td><td>Nr instrumentu Sutter</td><td> QF100-70-10</td><td>Z żarnikiem, 1 mm OD,&nbsp; ID 0,7 Klasa Water PCR o długości 10 cm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roche</td><td>nr 03315843001</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda mikroiniekcji dla zarodków anopheles gambiae

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Techniki mikroiniekcji zarodków są niezbędne dla wielu badań molekularnych i genetycznych gatunków owadów. Zapewniają one środki do wprowadzania egzogennych fragmentów DNA kodujących interesujące geny, a także korzystne cechy do linii zarodkowej owadów w stabilny i dziedziczny sposób. Powstałe w ten sposób szczepy transgeniczne mogą być badane pod kątem zmian fenotypowych wynikających z ekspresji zintegrowanego DNA, aby odpowiedzieć na podstawowe pytania lub wykorzystać w praktycznych zastosowaniach. Chociaż technologia jest prosta, wymaga od badacza cierpliwości i praktyki, aby osiągnąć poziom umiejętności, który maksymalizuje wydajność. Pokazana jest metoda mikroiniekcji zarodków afrykańskiego komara malarii, Anopheles gambiae. Celem jest dostarczenie egzogennego DNA do zarodka za pomocą mikroiniekcji, tak aby mogło ono zostać pobrane w rozwijających się komórkach linii rozrodczej (biegunowej). Ekspresja z wstrzykniętego DNA transpozaz, integraz, rekombinaz lub innych nukleaz (na przykład białek związanych z CRISPR, Cas) może wywołać zdarzenia, które prowadzą do jego kowalencyjnej insercji do chromosomów. Transgeniczne An. gambiae powstałe w wyniku tych technologii zostały wykorzystane do podstawowych badań składników układu odpornościowego, genów zaangażowanych w odżywianie krwi oraz elementów układu węchowego. Ponadto techniki te zostały wykorzystane do produkcji szczepów An. gambiae o cechach, które mogą pomóc w kontrolowaniu przenoszenia pasożytów malarii.

Reprezentatywny przykład zastosowania opisanego protokołu mikroiniekcji znajduje się w pracy Carballar-Lejarazú i wsp.5Zamierzeniem było wprowadzenie autonomicznego systemu napędu genowego (gene-drive) do linii zarodkowej szczepu laboratoryjnego G3 An. gambiaeSystem został zaprojektowany w celu ukierunkowania na kardynalny locus ortologiczny (Agcd) na trzecim chromosomie u tego gatunku, który koduje peroksydazę hemową katalizującą przekształcenie 3-hydroksykynureniny w k...

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia specyficzną metodę mikroiniekcji dla Anopheles gambiae, która historycznie była trudna do przekształcenia przy użyciu powszechnych technik inżynierii genetycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że niezawodnie tworzy transgeniczne Anopheles gambiae. Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku nowych strategii eliminacji malarii poprzez ułatwianie tworzenia komarów odpowiednich do tłumienia populacji lub modyfikacji populacji dzikich typu Anopheles gambiae.Metodologię tę można łatwo dostosować do różnych gatunków komarów. Nasza technologia mikroiniekcji wymaga cierpliwości i praktyki. Jest krzywa uczenia się.Na początek użyj aspiratora, aby umieścić od 20 do 30 samic w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Upewnij się, że rurka jest rozcięta na obu końcach i pokryta lateksową folią dentystyczną na jednym końcu oraz nylonową siatką i bibułą filtracyjną na drugim, gdzie komary będą składać jaja. Umieść probówkę wypełnioną komarami na małej szalce Petriego wypełnionej podwójnie destylowaną wodą, a następnie umieść probówkę i naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 45 minut.Wyjąć probówkę z inkubatora i włożyć ją do pustej klatki. Delikatnie postukaj w rurkę, aby komary mogły wylecieć. Wyjmij rurkę z klatki, gdy wszystkie komary wylecą.Gdy rurka jest wolna od komarów, odkręć dolny pierścień, zdejmij nylon i za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z jajami z probówki. Umieść bibułę filtracyjną wypełnioną jajami na plastikowej szalce Petriego zawierającej warstwę bibuły filtracyjnej zwilżonej wodą. Umieść membranę na czystym szkiełku podstawowym i za pomocą czystych kleszczyków przykryj membranę kawałkiem bibuły filtracyjnej, pozostawiając około jednego milimetra filtra membranowego odkrytego.Zwilż bibułę filtracyjną wodą dejonizowaną, a następnie za pomocą szczoteczki delikatnie przenieś od 30 do 50 zarodków na krawędź błony i ustaw jaja pionowo wzdłuż membrany. Ustaw jaja w tym samym kierunku, tak aby podczas obserwacji jaj pod mikroskopem mikroiniekcyjnym tylny koniec znajdował się w pozycji dolnej i tworzył z igłą kąt 15 stopni. Wyłóż całą krawędź błony jajkami.Użyj końcówki do mikroładowarki, aby napełnić igły dwoma mikrolitrami mieszaniny DNA. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej. Wyrównaj igłę tak, aby tworzyła kąt 15 stopni z płaszczyzną szkiełka.Otwórz końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jajka, a następnie włóż końcówkę igły na około 10 mikrometrów w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej. Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie została zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły. Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły staje się nieco większy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.Wstrzyknąć około 40 do 50 jaj za pomocą jednej igły. Po zakończeniu wstrzyknięć spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 mililitrami wody dejonizowanej. Korzystając z tego protokołu, autonomiczny system sterowany genami został wprowadzony do linii zarodkowej laboratoryjnego szczepu G3 z Anopheles gambiae.System został zaprojektowany tak, aby celować w ortolog kardynalny lub Agcd na trzecim chromosomie u tego gatunku. Pokazany jest plazmid pCO37. Zawiera endonukleazę Streptococcus pyogenes Cas9 pod kontrolą elementów regulatorowych ortologu genu nanos.Dodatkowo posiada przewodnik RNA pod kontrolą promotora genu U6 i kasetę markera dominującego 3XP3 CFP wyrażającego cyjanowe białko fluorescencyjne. Podejścia molekularne potwierdziły dokładną insercję około 10 kilo par zasad DNA, które oznaczono jako AgNosCd-1. Szeroko zakrojone analizy uzupełniające wykazały, że AgNosCd-1 był wysoce wydajny w napędzie, tworzył niewiele opornych alleli i nie miał dużego obciążenia genetycznego ze względu na integrację i ekspresję systemu napędu genowego.Homozygotyczny napęd genowy zawierający komary były mutantami o utracie funkcji, z larwami, poczwarkami i nowo pojawiającymi się dorosłymi osobnikami o fenotypie czerwonych oczu. Podczas próby zastosowania tego protokołu, utrzymanie w wieku 88 lat ma kluczowe znaczenie dla dobrego wylęgu jasnoszarych jaj i unikania białych jaj.

microinjection-method-for-anopheles-gambiae-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Komary z gatunku Anopheles stephensi są wektorami malarii zamieszkującymi Indie oraz cały obszar Azji. Niniejszy film demonstruje technikę wykonywania mikroiniekcji u tego gatunku z wykorzystaniem transgenów, które nadadzą komarowi odporność na malarię. Większość metodologii przedstawionej w tym filmie ma zastosowanie w technikach mikroiniekcji u innych gatunków komarów.

Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

W tym filmie demonstrujemy integrację transgenu w zarodku Anopheles za pośrednictwem phiC31 za pośrednictwem mikroiniekcji. Metoda ta pomaga wprowadzić pożądane geny do systemu gospodarza do zastosowań badawczych i przemysłowych.

phiC31-Integraza-Medi-Site-Directed Transgene Integration: Technika mikroiniekcji do specyficznej dla miejsca integracji transgenu z wektorem Anopheles

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj metodę mikroiniekcji do wprowadzania obcych genów do zarodków Anopheles gambiae, umożliwiającą tworzenie transgenicznych komarów. Ta technika wspiera badania nad kontrolą wektorów malarii.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Przeglądaj więcej filmów