Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae
July 7th, 2021
Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.
Protokół ten jest istotny, ponieważ zapewnia specyficzną metodę mikroiniekcji dla Anopheles gambiae, która historycznie była trudna do przekształcenia przy użyciu powszechnych technik inżynierii genetycznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że niezawodnie tworzy transgeniczne Anopheles gambiae. Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku nowych strategii eliminacji malarii poprzez ułatwianie tworzenia komarów odpowiednich do tłumienia populacji lub modyfikacji populacji dzikich typu Anopheles gambiae.
Metodologię tę można łatwo dostosować do różnych gatunków komarów. Nasza technologia mikroiniekcji wymaga cierpliwości i praktyki. Jest krzywa uczenia się.
Na początek użyj aspiratora, aby umieścić od 20 do 30 samic w przezroczystej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Upewnij się, że rurka jest rozcięta na obu końcach i pokryta lateksową folią dentystyczną na jednym końcu oraz nylonową siatką i bibułą filtracyjną na drugim, gdzie komary będą składać jaja. Umieść probówkę wypełnioną komarami na małej szalce Petriego wypełnionej podwójnie destylowaną wodą, a następnie umieść probówkę i naczynie w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 45 minut.
Wyjąć probówkę z inkubatora i włożyć ją do pustej klatki. Delikatnie postukaj w rurkę, aby komary mogły wylecieć. Wyjmij rurkę z klatki, gdy wszystkie komary wylecą.
Gdy rurka jest wolna od komarów, odkręć dolny pierścień, zdejmij nylon i za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij bibułę filtracyjną z jajami z probówki. Umieść bibułę filtracyjną wypełnioną jajami na plastikowej szalce Petriego zawierającej warstwę bibuły filtracyjnej zwilżonej wodą. Umieść membranę na czystym szkiełku podstawowym i za pomocą czystych kleszczyków przykryj membranę kawałkiem bibuły filtracyjnej, pozostawiając około jednego milimetra filtra membranowego odkrytego.
Zwilż bibułę filtracyjną wodą dejonizowaną, a następnie za pomocą szczoteczki delikatnie przenieś od 30 do 50 zarodków na krawędź błony i ustaw jaja pionowo wzdłuż membrany. Ustaw jaja w tym samym kierunku, tak aby podczas obserwacji jaj pod mikroskopem mikroiniekcyjnym tylny koniec znajdował się w pozycji dolnej i tworzył z igłą kąt 15 stopni. Wyłóż całą krawędź błony jajkami.
Użyj końcówki do mikroładowarki, aby napełnić igły dwoma mikrolitrami mieszaniny DNA. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej. Wyrównaj igłę tak, aby tworzyła kąt 15 stopni z płaszczyzną szkiełka.
Otwórz końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jajka, a następnie włóż końcówkę igły na około 10 mikrometrów w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej. Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.
Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie została zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły. Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły staje się nieco większy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.
Wstrzyknąć około 40 do 50 jaj za pomocą jednej igły. Po zakończeniu wstrzyknięć spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 mililitrami wody dejonizowanej. Korzystając z tego protokołu, autonomiczny system sterowany genami został wprowadzony do linii zarodkowej laboratoryjnego szczepu G3 z Anopheles gambiae.
System został zaprojektowany tak, aby celować w ortolog kardynalny lub Agcd na trzecim chromosomie u tego gatunku. Pokazany jest plazmid pCO37. Zawiera endonukleazę Streptococcus pyogenes Cas9 pod kontrolą elementów regulatorowych ortologu genu nanos.
Dodatkowo posiada przewodnik RNA pod kontrolą promotora genu U6 i kasetę markera dominującego 3XP3 CFP wyrażającego cyjanowe białko fluorescencyjne. Podejścia molekularne potwierdziły dokładną insercję około 10 kilo par zasad DNA, które oznaczono jako AgNosCd-1. Szeroko zakrojone analizy uzupełniające wykazały, że AgNosCd-1 był wysoce wydajny w napędzie, tworzył niewiele opornych alleli i nie miał dużego obciążenia genetycznego ze względu na integrację i ekspresję systemu napędu genowego.
Homozygotyczny napęd genowy zawierający komary były mutantami o utracie funkcji, z larwami, poczwarkami i nowo pojawiającymi się dorosłymi osobnikami o fenotypie czerwonych oczu. Podczas próby zastosowania tego protokołu, utrzymanie w wieku 88 lat ma kluczowe znaczenie dla dobrego wylęgu jasnoszarych jaj i unikania białych jaj.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę mikroiniekcji do wprowadzania egzogennych genów do zarodków Anopheles gambiae, ułatwiającą wytwarzanie transformowanych komarów. Ta metoda radzi sobie z historycznymi wyzwaniami transformacji tego gatunku za pomocą konwencjonalnych podejść do inżynierii genetycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria genetyczna
- Entomologia
- Kontrola wektorów
Tło
- Anopheles gambiae jest kluczowym wektorem malarii.
- Transformacja tego gatunku była trudna za pomocą standardowych technik.
- Mikroiniekcja oferuje niezawodną metodę tworzenia komarów transgenicznych.
- Ta technika może być dostosowana dla innych gatunków komarów.
Cel badania
- Opracowanie specyficznego protokołu mikroiniekcji dla Anopheles gambiae.
- Możliwość tworzenia genetycznie zmodyfikowanych komarów do kontroli malarii.
- Dostarczenie niezawodnej metody dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Mikroiniekcja konstrukcji DNA do zarodków.
- Zastosowanie specyficznych technik opracowane przez laboratorium Jamesa.
- Dostosowanie metody dla różnych gatunków komarów.
- Szkolenie i praktyka w celu opanowania techniki.
Główne wyniki
- Udana generacja transgenicznych Anopheles gambiae.
- Wykazana niezawodność metody mikroiniekcji.
- Potencjalne zastosowania w strategiach eliminacji malarii.
- Ułatwione modyfikowanie populacji komarów dzikich.
Wnioski
- Technika mikroiniekcji jest skuteczna w introdukcji genów.
- Ta metoda może znacząco wspomóc badania nad kontrolą wektorów.
- Dalsze badania mogą eksplorować jej zastosowanie u innych gatunków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microinjection of Anopheles gambiae embryos enables stable germline transformation, addressing a longstanding bottleneck in vector control research. This technique supports the development of gene drive systems for malaria elimination by facilitating heritable genetic modifications in a key disease vector. Reliable embryo injection enhances predictive confidence in target validation and preclinical modeling of transmission-interrupting strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes involved in blood-feeding, immunity, and olfaction through stable transgene expression.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate transgenic lines for target de-risking in vector-borne disease programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Creates standardized transgenic mosquito strains for phenotypic screening of antiparasitic or transmission-blocking compounds.
- Operational Value: Supports assay readiness by delivering consistent genetic backgrounds for high-throughput evaluation of gene drive efficacy.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of gene drive performance, resistance allele formation, and genetic load in controlled laboratory settings prior to field trials.
- Operational Value: Facilitates preclinical validation of transmission-reducing traits in Anopheles gambiae strains under standardized insectary conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The microinjection method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling target validation, strain generation, and functional assessment of genetic interventions for malaria control.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in pathogen transmission and host-seeking behaviors via germline transformation.
- Screening: Generates isogenic transgenic lines for reproducible evaluation of gene drive components and effector genes.
- Analytics: Enables quantitative measurement of transgene expression, drive efficiency, and phenotypic outcomes such as eye color or fertility.
- Translational Research: Connects molecular constructs to organismal phenotypes in a disease-relevant system for risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform technology adaptable across mosquito species for sustained vector control pipeline support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through heritable gene expression and phenotypic readouts.
- Operational Value: Standardized embryo handling and injection protocols improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage vector control programs by enabling early assessment of gene drive properties.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions based on drive efficiency, resistance profiles, and fitness costs in transgenic strains.
Implementation Considerations
- Expertise in mosquito embryology and microinjection instrumentation is required for successful embryo manipulation.
- Access to microinjection systems, pressure pumps, and microscopy setups with coaxial stage controls is essential.
- Standardization of embryo alignment, needle angle, and injection volume across teams ensures consistent transgenic outcomes.
- Adaptation to other mosquito species may require optimization of incubation timing, embryo staging, and membrane preparation.
- Success depends on user proficiency due to the technical learning curve inherent in delicate embryo handling.
