Name: Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj małoskalowy protokół izolacji błony plazmatycznej do badania białek błonowych w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Metoda umożliwia szybką i ekonomiczną analizę ekspresji białek oraz aktywności ATPaz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie z Nowozelandzkiego Funduszu Marsdena (Grant UOO1305), oraz grant blokowy z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Chulalongkorn, Bangkok, Tajlandia (M. Niimi). Pragną podziękować Uniwersytetowi Otago za zapewnienie G. Madani stypendium doktoranckiego. Autorzy pragną również wyrazić wdzięczność profesorowi Stefanowi Raunserowi i jego współpracownikom, dr Amirowi Apelbaumowi i dr Deivanayagabarathy Vinayagam, za ich wsparcie i nadzór podczas 6-miesięcznej wizyty G. Madani w Instytucie Fizjologii Molekularnej im. Maxa Plancka (MPIMP) w Dortmundzie w Niemczech. Autorzy dziękują również Niemieckiemu Centrali Wymiany Akademickiej (DAAD) za udzielenie G. Madani grantu badawczego (57381332) na wizytę w MPIMP.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo ostatnich postępów w analizie strukturalnej białek błonowych, obecnie nie jest dostępna żadna struktura 3D dla Cdr1 ani żadnego innego transportera PDR. Tak więc zdobycie wiedzy na temat struktury Cdr1 i jej cech biochemicznych jest ważne, ponieważ nie tylko zapewni wgląd w racjonalne projektowanie nowych leków w celu przezwyciężenia oporności na leki za pośrednictwem wypływu, ale także w mechanizm działania ważnej podrodziny białek ABC.
Jednym z głównych wymagań dotyczących charakterys...

Ekstrakcja integralnych białek błonowych z ich rodzimego środowiska lipidowego może znacząco wpłynąć na ich strukturę i funkcję1,2,3,4. Złożony skład lipidowy błon biologicznych5 zapewnia, że mogą zachodzić krytycznie ważne interakcje białko-lipid6. Lipidy utrzymują integralność strukturalną białek błonowych, umożliwiając im w ten sposób prawidłowe funkcjonowanie w miejscu docelowym przedziału błonowego7,8. Dlatego krytycznym pierwszym krokiem w oczyszczaniu białka błonowego jest ekstrakcja białka z jego rodzimego środowiska bez wpływu na jego strukturę i/lub funkcję.
Istnieje wiele przeszkód w scharakteryzowaniu struktury białek błonowych, z których większość jest związana z ich hydrofobową naturą, oraz trudności w wyrażaniu prawidłowo pofałdowanych i funkcjonalnych białek błonowych w ilościach wymaganych do krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM)9,10,11,12. Istnieją trzy typy systemów ekspresji białek błonowych: homologous9, heterologous13,14,15 oraz systemy ekspresji in vitro16,17. Często niskie poziomy ekspresji lub zaporowe koszty wielu systemów ekspresji pozostawiają tylko kilku gospodarzy jako preferowaną opcję do produkcji białek błonowych. Należą do nich gospodarz bakteryjny, Escherichia coli, drożdże S. cerevisiae i Pichia pastoris oraz wyższe eukarionty, takie jak komórki owadów Sf9 lub linie komórkowe ssaków18. Wszystkie technologie ekspresji białek błonowych mają zalety i wady; jednak S. cerevisiae jest prawdopodobnie najlepiej zbadanym eukariotycznym organizmem modelowym nadającym się do produkcji białek błonowych. Jest bardzo wszechstronny dzięki zastosowaniom w inżynierii genetycznej, odkrywaniu leków, biologii syntetycznej i ekspresji eukariotycznych białek błonowych14,19,20,21.
W tym badaniu opatentowana technologia ekspresji białek błonowych S. cerevisiae21, z S. cerevisiae ADΔ14 i ADΔΔ22 jako preferowanymi gospodarzami (Rysunek 1A), do nadekspresji i badania głównej wielolekowej pompy wypływowej Cdr1 albicans. Oba szczepy S. cerevisiae są pochodnymi AD1-8u- 23, które mają usunięte geny ura3 (ADΔ) lub oba geny ura3 (ADΔΔ) w celu wyeliminowania wszelkich fałszywie dodatnich transformantów prototrofów uracylu lub histydyny powstających w wyniku niepożądanej integracji w loci genomu URA3 lub HIS1. Usunięcie 7 głównych wielolekowych pomp wypływowych 23, wskazanych w Rysunek 1A, sprawia, że ADΔΔ jest wyjątkowo wrażliwy na większość ksenobiotyków. Zmutowany czynnik transkrypcyjny Pdr1-3 powoduje konstytutywną nadekspresję heterologicznych białek błonowych, takich jak Cdr1 (czerwone ośmiokąty w <silna klasa = "xfig" >Figura 1A) po integracji heterologicznej kasety transformacyjnej zawierającej ORF (<silna klasa = "xfig" > Figura 1A) w genomowym locus PDR5 (niebieski prostokąt w <silna klasa = "xfig" > Figura 1A) za pomocą dwóch homologicznych zdarzeń rekombinacji. Właściwa lokalizacja błony plazmatycznej C-końcowych białek znakowanych mGFPHis może być potwierdzona za pomocą mikroskopii konfokalnej (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A), a znacznik He może być używany do oczyszczania powinowactwa do niklu znakowanego białka. Klonowanie niektórych transporterów ABC grzybów (np. Candida krusei ABC1) do plazmidów pochodzących z pABC3 nie było jednak możliwe, ponieważ nie można było ich rozmnażać w Escherichia coli ze względu na toksyczność komórek. To skłoniło do opracowania jednoetapowego klonowania białek błonowych14,24 oznaczone na swoim N- lub C-końcu z różnymi znacznikami powinowactwa, epitopami lub reporterami bezpośrednio do S. cerevisiae ADΔΔ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). S. cerevisiae (S. cerevisiae) Szczepy ADΔΔ z nadekspresją różnych mutantów CDR1 mogą być również skutecznie tworzone w ten sposób, używając do pięciu pojedynczych fragmentów PCR, które nakładają się na siebie o 25 pz (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). Korzystając z tego protokołu, wiele interesujących ORF-ów można sklonować, wyrazić i scharakteryzować przy niskich kosztach i wysokiej wydajności w bardzo krótkim czasie. Wydajność przemiany zmniejsza się tylko ~2-krotnie z każdym dodatkowym fragmentem PCR.
Jeśli jest to pożądane, poziomy wyrażeń mogą być również łatwo manipulowane przez projektowanie elementarza, aby przewidywalnie obniżyć poziomy wyrażeń do dowolnego miejsca między 0,1%-50% zwykle wysokich, konstytutywnych poziomów wyrażeń25. Zoptymalizowany, wielofunkcyjny wektor klonowania pochodnych pABC314, pABC3-XLmGFPHis26 (Rysunek 1B) zawiera miejsce cięcia proteazy HRV-3C (X; LEVLFQ|GP), proteaza, która działa lepiej w temperaturze 4 °C niż często stosowana proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV)27. L jest łącznikiem pięciu aminokwasów (GSGGS), mGFP jest monomerycznym mutantem (A206K)28,29 wersja wariantu białka zielonej fluorescencji wzmocnionego drożdżami yEGFP330, a His to łącznik trzech aminokwasów (GGS), po którym następuje znacznik oczyszczania białka o powinowactwie do niklu o sześcio-histydynowym (HHHHHH).
Ta technologia ekspresji została z powodzeniem wykorzystana w odkrywaniu leków i badaniu białek błonowych. Pierwsza struktura docelowego leku azolowego na grzyby, S. cerevisiae Erg1131, została rozwiązana przy użyciu tej technologii. Umożliwiło to również szczegółową charakterystykę Cdr132,33,34 oraz stworzenie cząsteczki Cdr1 z niedoborem cysteiny35 nadającej się do badań sieciowania cysteiny w celu weryfikacji wszelkich przyszłych struktur o wysokiej rozdzielczości. Wiele innych transporterów ABC głównych patogenów grzybowych u ludzi (tj. C. albicans, Candida glabrata, Candida auris, Candida krusei, Candida utilis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei i kompleks gatunków Fusarium solani) również zostało szczegółowo przebadanych przy użyciu tego wyrażenia platforma24,36,37,38,39. Umożliwiło to wygenerowanie panelu pomp wypływowych szczepów S. cerevisiae z nadekspresją<, który został wykorzystany w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych w celu odkrycia nowego podłoża fluorescencyjnej pompy wypływowej Nile red40 i specific41 i sup class="xref">14,33,42,43,44inhibitory pompy wypływowej. Zastosowanie tego systemu umożliwiło również odkrycie clorgyliny jako pierwszego w swoim rodzaju wielolekowego inhibitora pompy wypływowej o szerokim spektrum działania42.
Całkowita solubilizacja białek błonowych i stworzenie jednorodnego preparatu białkowo-micelowego pozbawionego endogennych lipidów, wymaga wysokich stężeń detergentów45. Niestety, to również często dezaktywuje białko błonowe5,8,45,46. Na właściwości monomerów detergentowych i ich agregację w roztworze mają wpływ właściwości fizyczne ogona hydrofobowego, długość i rozgałęzienie łańcucha alkilowego, obecność jądra aromatycznego lub fluoroalkilowego łańcucha bocznego lub liczba jednostek polioksyetylenowych. Dlatego przesiewanie detergentów jest ważnym pierwszym krokiem do określenia najbardziej odpowiedniego detergentu do solubilizacji i oczyszczania białek membranowych.
C. albicans jest głównym ludzkim patogenem grzybiczym u osób z obniżoną odpornością, który może powodować poważne, zagrażające życiu infekcje inwazyjne47, i może stać się odporny na azolowe leki przeciwgrzybicze48,49. Jednym z głównych mechanizmów wielolekowości C. albicans jest nadekspresja Cdr150, który jest transporterem kasety wiążącej ATP (ABC) typu II51 podrodziny ABCG zlokalizowanej w błonie plazmatycznej. Pełnowymiarowe transportery ABCG grzybów (składające się z dwóch domen wiążących nukleotydy [NBD] i dwóch domen transbłonowych [TMD]) są bardziej znane jako transportery plejotropowej oporności na leki (PDR) i charakteryzują się unikalną topologią odwróconej domeny [NBD-TMD]2. Transportery PDR znajdują się tylko w plants52,53 i fungi54. Pomimo ich znaczenia, nie ma żadnych struktur dla transporterów PDR, chociaż ostatnio rozwiązano struktury dla ludzkich transporterów ABCG o połowie rozmiaru, co pomogło stworzyć pierwszy wstępny model dla Cdr133. Nasze ostatnie dowody eksperymentalne sugerują jednak, że ten model jest wadliwy, prawdopodobnie dlatego, że transportery PDR grzybów mają charakterystyczne asymetryczne NBD, co prawdopodobnie skutkuje unikalnym mechanizmem transportu. Struktura Cdr1 o wysokiej rozdzielczości jest zatem niezbędna zarówno do racjonalnego projektowania nowych inhibitorów pompy wypływowej, które mogą pomóc w przezwyciężeniu oporności na leki za pośrednictwem wypływu, jak i do zapewnienia wglądu w mechanizm działania tej ważnej rodziny transporterów ABC.
Celem tego badania było opracowanie wiarygodnych protokołów ekspresji, solubilizacji i oczyszczania Cdr1 w genetycznie zmodyfikowanym gospodarzu ekspresji S. cerevisiae, z ostatecznym celem uzyskania struktury o wysokiej rozdzielczości dla Cdr1. W ramach tego procesu zaprojektowano podwójny znacznik mGFPHis rozszczepialny proteazą (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B) z 16-resztkowym łącznikiem oddzielającym znacznik od C-końca Cdr1, co poprawiło wiązanie dołączonego 6-krotnego znacznika powinowactwa His z żywicą o powinowactwie do niklu i umożliwiło monitorowanie poziomów ekspresji Cdr1 w żywych komórkach i podczas całego procesu oczyszczania. Opracowano również powtarzalny protokół dla preparatów białek błony komórkowej drożdży zawierających około 10% Cdr1 (zgodnie z oszacowaniem za pomocą barwienia Coomassie po SDS-PAGE), który można wykorzystać do biochemicznej charakterystyki Cdr1.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-(N-Morfolino)etano-sulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol (zasada Tris; ultra-czysta)Merck</td><td></td> <td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2,2-didecylopropano-1,3-bis-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>NG310S</td><td>LMNG</td></tr><tr><td>2,2-diheksylopropano-1,3-bis-&beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>NG311S</td><td>OGNG (MNG-OG)</td></tr><tr><td>2,2-dioktylopropano-1,3-bis-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>NG322S</td><td>DMNG</td></tr><tr><td>4-Trans-(4-trans-propylocykloheksyl)-cykloheksyl &alfa;-D-maltopyranozyd</td><td>Glycon Biochemicals GmbH</td><td>D99019-C</td><td>PCC-&alpha;-M</td></tr><tr><td>40% Akrylamid/Bis-akryloamid (37,5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowaty)</td><td>Merck</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>&nbsp; 009002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13106-76-8</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>ATP sól disodowa</td><td>sigma-Aldrich</td><td>A-6419</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>34725-61-6</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td></td></tr><tr><td>CHAPSO</td><td>Anatrace</td><td>C317S</td><td></td></tr><tr><td>CSM</td><td>Formedium</td><td>DCS0019</td><td></td></tr><tr><td>CSM minus uracyl</td><td>Formedium</td><td>DCS0161</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksylo-1-butylo-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>C324S</td><td>CYMAL-4</td></tr><tr><td>Cykloheksylo-1-heptyl-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>C327S</td><td>CYMAL-7</td></tr><tr><td>Cykloheksylo-metylo-&beta;- D-maltopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>C321S</td><td>CYMAL-1</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11024-24-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10197785103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT PCR Odczynnik do czyszczenia produktu</td><td>Zastosowane Biosystems</td><td>78205</td><td>Mieszanina egzonukleazy i fosfatazy</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Formedium</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Merck</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Formedium</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>1003172510</td><td></td></tr><tr><td>KOD Fx Neo</td><td>TOYOBO Co</td><td>KFX-201</td><td>Służy do niezawodnego</td></tr><tr><td>octanu litu (LiAc)</td> do PCR (LiAc)<td>Sigma-Aldrich</td><td>546-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Formedium</td><td>145224-94-8</td><td></td></tr><tr><td>n-dekanoilo-N-hydroksyetylo-glukamid</td><td>Anatrace</td><td>H110S</td><td>HEGA-10</td></tr><tr><td>n-dekanoilo-N-metylo-glukamid</td><td>Anatrace</td><td>M320S</td><td>MEGA-10</td></tr><tr><td>n-decylo-fosfocholina</td><td>Anatrace</td><td>F304S</td><td>Fos-cholina-10</td></tr><tr><td>n-decylo-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D322S</td><td>DM</td></tr><tr><td>n-dodecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian</td><td>Anatrace</td><td>AZ312S</td><td>Anzergent 3-12</td></tr><tr><td>n-dodecyl-N,N-dimetyloamino-tlenek</td><td>Anatrace</td><td>D360S</td><td>LDAO</td></tr><tr><td>n-dodecyl-&alfa;-D-maltopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310HA</td><td>&alpha;-DDM</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td>&beta;-DDM</td></tr><tr><td>n-nonyl-&beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>N324S</td><td>NG</td></tr><tr><td>n-nonylo-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>N330S</td><td>NM</td></tr><tr><td>n-oktadecylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian</td><td>Anatrace</td><td>AZ318S</td><td>Anzergent 3-18</td></tr><tr><td>n-oktylo-N,N-dimetylo-3-amonio-1-propanosulfonian</td><td>Anatrace</td><td>AZ308S</td><td>Anzergent 3-8</td></tr><tr><td>n-oktylo-fosfocholina</td><td>Anatrace</td><td>F300S</td><td>Fos-cholina-8</td></tr><tr><td>n-oktylo-&beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>O311S</td><td>OG</td></tr><tr><td>n-tetradecylo-fosfocholina</td><td>Anatrace</td><td>F312S</td><td>Fos-cholina-14</td></tr><tr><td>n-tetradecylo-&beta;-D-maltopiranozyd</td><td>Anatrace</td><td>T315S</td><td>TDM</td></tr><tr><td>n-tridecylo-fosfocholina</td><td>Anatrace</td><td>F310S</td><td>Fos-cholina-13</td></tr><tr><td>n-tridecyl-&beta;- D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>T323S-n-undecyl</td><td></td></tr><tr><td>-&beta;-D-maltopyranozyd</td><td>Anatrace</td><td>U300S</td><td>UM (UDM)</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametylo-etylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Oktylofenoksypolietylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>TRITON X-100</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Formedium</td><td>3049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Hot Start Flex DNA Polymeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0535S</td> Glikol polietylenowy <td>polimerazy DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>(PEG 3350)</td>Monooleinian polioksyetylenoesorbitanu <td>Sigma-Aldrich</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-65-6</td><td>TWEEN 80</td></tr><tr><td>Azotan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8394</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad</td><td>5000122</td><td>Zestaw do oznaczania białek RC DC II</td></tr><tr><td>QC Koloidalny barwnik Coomassie</td><td>Bio-Rad</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Prism Ultra Drabinka białkowa (10-245 kDa)</td><td>Abcam</td><td>AB116028</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151-21-3</td><td>SDS</td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Monododekanian sacharozy</td><td>Anatrace</td><td>S350S</td><td>DDS</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Formedium</td><td>008013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów</td><td>Formedium</td><td>CYN0402</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sprzęt (typ)</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp; (Eppendorf 5804)</td><td>Wirówka Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Beckman Ultra)</td>Wirówka <td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Sorvall RC6)</td><td>Aparatura Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FSEC (system do chromatografii średniociśnieniowej NGC wyposażony w detektor fluorescencji, autosampler, frakcjonator)</td><td>Obrazowanie żelowe Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(GelDoc EZ Imager)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek (Synergy 2 Multi-Detection)</td>Termocykler PCR <td>BioTek Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(C1000 Touch)</td><td>Zasilacz Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(PowerPac)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE (Mini-PROTEAN Tetra)</td>Inkubator z wytrząsaniem <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Multitron)</td><td>Infors HT, Bottmingen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GE17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV/Visible (Ultraspec 6300 pro)</td><td>Amersham BioSciences UK Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy candida albicans cdr1-mgfphis

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Udana biochemiczna i biofizyczna charakterystyka transporterów ABC zależy w dużej mierze od wyboru heterologicznego systemu ekspresji. W ciągu ostatnich dwóch dekad opracowaliśmy platformę ekspresji białek błonowych drożdży, która została wykorzystana do badania wielu ważnych białek błonowych grzybów. Gospodarz ekspresji Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ jest usunięty w siedmiu głównych endogennych transporterach ABC i zawiera czynnik transkrypcyjny Pdr1-3 z mutacją wzmacniającą funkcję, która umożliwia konstytutywną nadekspresję heterologicznych genów białek błonowych stabilnie zintegrowanych jako pojedyncze kopie w genomowym PDR5 Locus. Stworzenie wszechstronnych wektorów plazmidowych i optymalizacja jednoetapowych strategii klonowania umożliwia szybkie i dokładne klonowanie, mutagenezę i ekspresję heterologicznych transporterów ABC. W tym miejscu opisujemy rozwój i zastosowanie nowego podwójnego znacznika mGFPHis rozszczepialnego proteazą (tj. monomerycznego białka zielonej fluorescencji yEGFP3 wzmocnionego drożdżami połączonego ze znacznikiem oczyszczającym o powinowactwie do sześciu histydyn), który został zaprojektowany w celu uniknięcia możliwej interferencji znacznika z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania i zwiększenia skuteczności wiązania znacznika He z żywicami o powinowactwie do niklu. Fuzja mGFPHis z białkiem błonowym ORF (otwarta ramka odczytu) umożliwia łatwą ocenę ilościową białka poprzez kontrolę żeli poliakrylamidowych i wykrywanie produktów degradacji zachowujących znacznik mGFPHis. Pokazujemy, w jaki sposób ta funkcja ułatwia przesiewanie detergentów pod kątem rozpuszczalności białek błonowych. Przedstawiono protokół wydajnej, szybkiej i niezawodnej izolacji preparatów błony plazmatycznej na małą skalę znakowanego C-końcowo znakowanego wielolekowego transportera wypływu Candida albicans Cdr1 z nadekspresją w S. cerevisiae ADΔΔ. Ten protokół izolacji błon plazmatycznych na małą skalę pozwala na uzyskanie wysokiej jakości błon plazmatycznych w ciągu jednego dnia roboczego. Preparaty błony plazmatycznej można wykorzystać do określenia aktywności enzymatycznej wariantów Cdr1 i Cdr1.

Wysoką częstotliwość transformacji S. cerevisiae ADΔΔ (~4 x 104 transformantów/µg) osiągnięto przy użyciu pYES2 (Rycyna 2B). Zgodnie z oczekiwaniami, kontrola bez DNA (tj. tylko ddH2O) nie dała transformantów, a 1 µg liniowej kasety transformacyjnej CDR1-mGFPHis (Rycyna 1A) dało ~50 transformantów (Rycyna 2C) przy zastosowaniu zoptymalizowanego protokołu transformacji ADΔΔ. Transforma...

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę i podwójny znacznik mGFPHis zapewniają ekonomiczną, szybką, niezawodną i łatwą metodę charakteryzowania białek błonowych w modelowym organizmie eukariotycznym Saccharomyces cerevisiae. Największą zaletą tej technologii jest łatwość i szybkość, z jaką można określić poziomy ekspresji białek błonowych, aktywność ATP i detergent, który najlepiej nadaje się do ich oczyszczania. Ta technologia jest bardzo przyjazna dla użytkownika.Jednak jedną ważną kwestią, o której należy pamiętać, jest zbieranie komórek jako OD 600 z 2, co zapewnia niskie zanieczyszczenie mitochondriów i najwyższą możliwą aktywność ATPazy. Zacznij od wstępnej hodowli pojedynczej kolonii drożdży w 10 mililitrach pożywki YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez siedem do ośmiu godzin przy 200 obrotach na minutę. Użyj 10 mililitrów kultury wstępnej, aby zaszczepić 40 mililitrów świeżej pożywki YPD.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc z prędkością 200 obrotów na minutę, aż gęstość komórek osiągnie OD 600 od jednego do trzech. Następnego dnia zbierz 40 jednostek gęstości optycznej (ODU) logarytmicznych komórek twarzy, wirując z prędkością 4200 razy G na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić i umyć komórki 40 mililitrami lodowatej sterylnej wody podwójnie destylowanej.Powtórz mycie przy użyciu jednego mililitra lodowatej wody z wirowaniem między etapami mycia. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatej sterylnej wody i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej wstępnie schłodzonej na lodzie. Zbieraj komórki w temperaturze 3 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu homogenizującego świeżo uzupełnionego jednym milimolowym fluorkiem metylu sulfonamidonu Neala lub PMSF. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Rozmrażaj komórki na lodzie przez około godzinę.Następnie dodaj lodowato zimne kulki krzemionkowe o średnicy 0,5 milimetra do 500 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby osiągnąć całkowitą objętość jednego mililitra. Aby rozbić komórki, należy wirować zawiesinę komórek z maksymalną intensywnością wstrząsania przez jedną minutę, przez sześć cykli, z trzyminutowym okresem chłodzenia na lodzie po każdym cyklu. Po wirowaniu wykonaj cienki otwór na dnie probówki za pomocą rozgrzanego ostrza skalpela i zbierz homogenat z rozbitych komórek do innej lodowatej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej z niską prędkością wirowania przez 10 sekund.Odwirować homogenat zebranych komórek w temperaturze 5, 156 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Przenieść 450 mikrolitrów supernatantu do lodowato zimnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać jeden mililitr lodowatego buforu homogenizującego uzupełnionego jednym milimolowym świeżym PMSF. Aby zebrać błony plazmatyczne, odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 17 968 razy G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów buforu homogenizującego świeżo uzupełnionego jednym milimolowym PMSF. Następnie poluzuj osad błony plazmatycznej, mieszając końcówką pipety o pojemności 100 mikrolitrów i ponownie zawiesij osad, powtarzając pipetowanie w górę iw dół. Zmierzyć stężenie białka w preparacie błony plazmatycznej za pomocą zestawu do oznaczania białek, który jest kompatybilny z zawierającymi środek redukujący i detergent.Przechowuj błony plazmatyczne w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj je na lodzie do natychmiastowego użycia. Wlej od czterech do pięciu mililitrów żelu separującego do zmontowanego aparatu żelowego w odległości do dwóch centymetrów od góry. Ostrożnie ułóż od jednego do dwóch mililitrów 0,1% SDS na wierzchu i pozwól żelowi poliakrylamidowemu zastygnąć przez 60 minut w temperaturze pokojowej.Po godzinie usuń warstwę 0,1% SDS ze spolimeryzowanego żelu separującego i spłucz żel podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć ślady SDS. Wlej mieszankę żelu do układania w stos na żel separacyjny. Umieść grzebień w żelu do układania w stos i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic grzebienia.Następnie pozostaw żel do układania w stos na 60 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij grzebień, a następnie spłucz szczeliny na żel wodą. Wlej żel do zbiornika żelu i napełnij zbiornik żelu do góry buforem do biegania.Wymieszać od pięciu do 10 mikrolitrów próbek błony plazmatycznej z równymi objętościami dwukrotnie zwiększającymi ilość barwnika obciążającego białko i natychmiast załadować mieszaninę próbek do poszczególnych szczelin żelowych, zanurzonych w działającym buforze. Załaduj markery masy cząsteczkowej białka w zakresie od 10 do 245 kilodaltonów do osobnego gniazda, aby umożliwić oszacowanie wielkości poszczególnych fragmentów białka. Wykonaj elektroforezę żelową przy napięciu 200 woltów, aż niebieski barwnik ładujący dotrze do dna żelu.Zbadaj żel pod kątem fluorescencji GFP w żelu za pomocą systemu obrazowania żelowego. Po obrazowaniu fluorescencyjnym utrwalić białka w 10 do 20 mililitrach roztworu utrwalającego żel białkowy poprzez delikatne mieszanie żelu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płucz dwukrotnie przez 10 minut 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody i umieść żel w 10 mililitrach koloidalnego roztworu barwnika Kumasi, delikatnie wstrząsając przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić pasma białkowe.Aby uzyskać lepszą wizualizację prążków białkowych, należy odbarwić żel raz lub dwa razy w 20 mililitrach podwójnie destylowanej wody przez godzinę przed zarejestrowaniem obrazów za pomocą systemu obrazowania żelu. Wysoką częstość przemian Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta osiągnięto za pomocą plazmidu kontroli pozytywnej PS2. Nie uzyskano transformantów Eurocell Prototron do kontroli ujemnej.Około 50 transformantów prototrofów komórek URA CDR1-mGFPHis uzyskano po inkubacji przekształconych komórek AD Delta Delta na płytkach CSM minus URA przez trzy dni. Wyeliminowano drobny transformant, który nie może rosnąć na płytkach agarowych YPG. Próbki CDR1-mGHPHis o różnych stężeniach oznaczono ilościowo za pomocą fluorescencji w żelu.Intensywność fluorescencji mGFP była liniowa w całym zakresie stężeń z minimalną fluorescencją tła. Zróżnicowanie gęstości komórek wykazało, że złamanie 40 ODU komórek dało najwyższą jakość błon plazmatycznych o najwyższej aktywności ATPazy CDR1. Jednak wydajność błon plazmatycznych rosła proporcjonalnie do wzrostu gęstości komórek.Zdolność 31 detergentów o różnych właściwościach do rozpuszczania CDR1-mGHPHis z surowych błon plazmatycznych komórek AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis przetestowano za pomocą karty charakterystyki. Beta i alfa DDM oraz fos-cholina 13 były najlepszymi detergentami do rozpuszczania CDR1-mGHPHis. Jednak fos-cholina 13 powoduje częściową hydrolizę CDR1-mGHPHis.Surowe białko błony plazmatycznej rozpuszczone za pomocą 1% detergentu oddzielono za pomocą kolumny wykluczającej o rozmiarze superos six 10 300 GL. Chromatogramy maltozydów i białek ekstrahowanych LMNG wykazały, że większość CDR1-mGHPHis wymyka się jako ładnie ukształtowany pik Gaussa na 15,5 milimetra, CDR1-mGHPH jest rozpuszczany z detergentami zawierającymi glukozę, o których mówi się, że jest zagregowanym lub szerokim zagregowanym pikiem. Wyższe piki dla DDM wskazują, że duża część rozpuszczonego DMN G CDR1-mGHPHis może być zdenaturowana.W chromatogramach FSCC dla obudniczojonowych foscholiny i dwóch niejonowych detergentów tylko digitonina i dały podobny chromatogram do DDM. Fos-cholina 13 dawała symetryczny pik o ostrym kształcie, ale nawiązywała do znacznie mniejszej objętości elucji niż w przypadku DDM. Zoptymalizowany podwójny znacznik poprawił również wydajność oczyszczania i pomógł określić lokalizację, transport i stabilność termiczną białek błonowych.Technologia ekspresji heterologicznej może być również stosowana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i szczegółowej charakterystyce wielu innych białek błonowych.

small-scale-plasma-membrane-preparation-for-analysis-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy prostą, szybką i niezawodną metodę tworzenia biofilmów Candida albicans z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotytacyjnych oraz jej przydatność w badaniu wrażliwości komórek wewnątrz biofilmów na środki przeciwgrzybicze.

Metoda z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki mikrotytrującej do monitorowania tworzenia się i badania wrażliwości przeciwgrzybiczej biofilmów Candida albicans

Opracowaliśmy platformę wysokiej gęstości do mikromacierzy, składającą się z 3D nano-biofilmów C. albicans, nazwaną CaBChip. Profil wrażliwości leków testowanych na CaBChip jest porównywalny z konwencjonalnym modelem płytki 96-dołkowej, co sugeruje, że chip grzybiczy jest idealnie dostosowany do prawdziwie wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych.

Chip do hodowli biofilmu Candida albicans (CaBChip) do wysokoprzepustowego przesiewu leków przeciwgrzybiczych

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Ten protokół opisuje użycie konfigurowalnego zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego do wizualizacji tworzenia biofilmu u Candida albicans w warunkach fizjologicznych gospodarza.

Wizualizacja tworzenia się biofilmu u Candida albicans za pomocą zautomatyzowanego urządzenia mikroprzepływowego

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół badania oddychania mitochondrialnego i funkcji glikolitycznej u Candida Albicans za pomocą dodatkowego analizatora strumienia.

Badanie bioenergetyczne Candida albicans przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Celem tego protokołu jest wizualizacja kształtu i lokalizacji komórek Candida albicans w przewodzie pokarmowym ssaków.

Wizualizacja Candida albicans w mysim przewodzie pokarmowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Aby zobaczyć i określić ilościowo wewnętrzne cechy biofilmów Candida albicans, przygotowujemy nienaruszone próbki stałe, które są klarowane przez dopasowanie współczynnika załamania. Następnie można wykorzystać optyczną mikroskopię przekrojową do uzyskania trójwymiarowych danych obrazowych na całej grubości biofilmu.

Oczyszczanie i obrazowanie biofilmów Candida albicans

Test ex vivo opisany w tym badaniu z wykorzystaniem ekstraktów homogenatu jelitowego i barwienia immunofluorescencyjnego stanowi nowatorską metodę badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym. Metoda ta może być wykorzystana do badania sygnałów środowiskowych regulujących przemianę morfogenetyczną w jelitach.

Test ex vivo do badania morfogenezy strzępek Candida albicans w przewodzie pokarmowym

Ten protokół opisuje eksperymentalną metodę i proces analizy danych dla rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN) w ludzkim patogenie grzybowym Candida albicans.

Profilowanie całego genomu interakcji wiążących czynnik transkrypcyjny-DNA u Candida albicans: kompleksowa metoda CUT&RUN i przepływ pracy analizy danych

Protokół ten stanowi zoptymalizowany, szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu planarialnej Schmidtea mediterranea jako modelu do badania interakcji gospodarz-patogen podczas infekcji grzybiczej. Metoda opiera się na wcześniejszej procedurze infekowania planarii ludzkim patogenem grzybowym Candida albicans, dostarczając szczegółowych wskazówek mających na celu zwiększenie powtarzalności i spójności eksperymentów.

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Poznaj małoskalowy protokół izolacji błony plazmatycznej do badania białek błonowych w organizmie modelowym Saccharomyces cerevisiae. Metoda umożliwia szybką i ekonomiczną analizę ekspresji białek oraz aktywności ATPaz.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Przeglądaj więcej filmów