Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę i podwójny znacznik mGFPHis zapewniają ekonomiczną, szybką, niezawodną i łatwą metodę charakteryzowania białek błonowych w modelowym organizmie eukariotycznym Saccharomyces cerevisiae. Największą zaletą tej technologii jest łatwość i szybkość, z jaką można określić poziomy ekspresji białek błonowych, aktywność ATP i detergent, który najlepiej nadaje się do ich oczyszczania. Ta technologia jest bardzo przyjazna dla użytkownika.

Jednak jedną ważną kwestią, o której należy pamiętać, jest zbieranie komórek jako OD 600 z 2, co zapewnia niskie zanieczyszczenie mitochondriów i najwyższą możliwą aktywność ATPazy. Zacznij od wstępnej hodowli pojedynczej kolonii drożdży w 10 mililitrach pożywki YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez siedem do ośmiu godzin przy 200 obrotach na minutę. Użyj 10 mililitrów kultury wstępnej, aby zaszczepić 40 mililitrów świeżej pożywki YPD.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc z prędkością 200 obrotów na minutę, aż gęstość komórek osiągnie OD 600 od jednego do trzech. Następnego dnia zbierz 40 jednostek gęstości optycznej (ODU) logarytmicznych komórek twarzy, wirując z prędkością 4200 razy G na pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić i umyć komórki 40 mililitrami lodowatej sterylnej wody podwójnie destylowanej.

Powtórz mycie przy użyciu jednego mililitra lodowatej wody z wirowaniem między etapami mycia. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatej sterylnej wody i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej wstępnie schłodzonej na lodzie. Zbieraj komórki w temperaturze 3 300 razy G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach buforu homogenizującego świeżo uzupełnionego jednym milimolowym fluorkiem metylu sulfonamidonu Neala lub PMSF. Zawiesinę komórek należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Rozmrażaj komórki na lodzie przez około godzinę.

Następnie dodaj lodowato zimne kulki krzemionkowe o średnicy 0,5 milimetra do 500 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby osiągnąć całkowitą objętość jednego mililitra. Aby rozbić komórki, należy wirować zawiesinę komórek z maksymalną intensywnością wstrząsania przez jedną minutę, przez sześć cykli, z trzyminutowym okresem chłodzenia na lodzie po każdym cyklu. Po wirowaniu wykonaj cienki otwór na dnie probówki za pomocą rozgrzanego ostrza skalpela i zbierz homogenat z rozbitych komórek do innej lodowatej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej z niską prędkością wirowania przez 10 sekund.

Odwirować homogenat zebranych komórek w temperaturze 5, 156 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórek. Przenieść 450 mikrolitrów supernatantu do lodowato zimnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodać jeden mililitr lodowatego buforu homogenizującego uzupełnionego jednym milimolowym świeżym PMSF. Aby zebrać błony plazmatyczne, odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 17 968 razy G przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów buforu homogenizującego świeżo uzupełnionego jednym milimolowym PMSF. Następnie poluzuj osad błony plazmatycznej, mieszając końcówką pipety o pojemności 100 mikrolitrów i ponownie zawiesij osad, powtarzając pipetowanie w górę iw dół. Zmierzyć stężenie białka w preparacie błony plazmatycznej za pomocą zestawu do oznaczania białek, który jest kompatybilny z zawierającymi środek redukujący i detergent.

Przechowuj błony plazmatyczne w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub trzymaj je na lodzie do natychmiastowego użycia. Wlej od czterech do pięciu mililitrów żelu separującego do zmontowanego aparatu żelowego w odległości do dwóch centymetrów od góry. Ostrożnie ułóż od jednego do dwóch mililitrów 0,1% SDS na wierzchu i pozwól żelowi poliakrylamidowemu zastygnąć przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

Po godzinie usuń warstwę 0,1% SDS ze spolimeryzowanego żelu separującego i spłucz żel podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć ślady SDS. Wlej mieszankę żelu do układania w stos na żel separacyjny. Umieść grzebień w żelu do układania w stos i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z okolic grzebienia.

Następnie pozostaw żel do układania w stos na 60 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij grzebień, a następnie spłucz szczeliny na żel wodą. Wlej żel do zbiornika żelu i napełnij zbiornik żelu do góry buforem do biegania.

Wymieszać od pięciu do 10 mikrolitrów próbek błony plazmatycznej z równymi objętościami dwukrotnie zwiększającymi ilość barwnika obciążającego białko i natychmiast załadować mieszaninę próbek do poszczególnych szczelin żelowych, zanurzonych w działającym buforze. Załaduj markery masy cząsteczkowej białka w zakresie od 10 do 245 kilodaltonów do osobnego gniazda, aby umożliwić oszacowanie wielkości poszczególnych fragmentów białka. Wykonaj elektroforezę żelową przy napięciu 200 woltów, aż niebieski barwnik ładujący dotrze do dna żelu.

Zbadaj żel pod kątem fluorescencji GFP w żelu za pomocą systemu obrazowania żelowego. Po obrazowaniu fluorescencyjnym utrwalić białka w 10 do 20 mililitrach roztworu utrwalającego żel białkowy poprzez delikatne mieszanie żelu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie płucz dwukrotnie przez 10 minut 10 mililitrami podwójnie destylowanej wody i umieść żel w 10 mililitrach koloidalnego roztworu barwnika Kumasi, delikatnie wstrząsając przez godzinę w temperaturze pokojowej, aby uwidocznić pasma białkowe.

Aby uzyskać lepszą wizualizację prążków białkowych, należy odbarwić żel raz lub dwa razy w 20 mililitrach podwójnie destylowanej wody przez godzinę przed zarejestrowaniem obrazów za pomocą systemu obrazowania żelu. Wysoką częstość przemian Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta osiągnięto za pomocą plazmidu kontroli pozytywnej PS2. Nie uzyskano transformantów Eurocell Prototron do kontroli ujemnej.

Około 50 transformantów prototrofów komórek URA CDR1-mGFPHis uzyskano po inkubacji przekształconych komórek AD Delta Delta na płytkach CSM minus URA przez trzy dni. Wyeliminowano drobny transformant, który nie może rosnąć na płytkach agarowych YPG. Próbki CDR1-mGHPHis o różnych stężeniach oznaczono ilościowo za pomocą fluorescencji w żelu.

Intensywność fluorescencji mGFP była liniowa w całym zakresie stężeń z minimalną fluorescencją tła. Zróżnicowanie gęstości komórek wykazało, że złamanie 40 ODU komórek dało najwyższą jakość błon plazmatycznych o najwyższej aktywności ATPazy CDR1. Jednak wydajność błon plazmatycznych rosła proporcjonalnie do wzrostu gęstości komórek.

Zdolność 31 detergentów o różnych właściwościach do rozpuszczania CDR1-mGHPHis z surowych błon plazmatycznych komórek AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis przetestowano za pomocą karty charakterystyki. Beta i alfa DDM oraz fos-cholina 13 były najlepszymi detergentami do rozpuszczania CDR1-mGHPHis. Jednak fos-cholina 13 powoduje częściową hydrolizę CDR1-mGHPHis.

Surowe białko błony plazmatycznej rozpuszczone za pomocą 1% detergentu oddzielono za pomocą kolumny wykluczającej o rozmiarze superos six 10 300 GL. Chromatogramy maltozydów i białek ekstrahowanych LMNG wykazały, że większość CDR1-mGHPHis wymyka się jako ładnie ukształtowany pik Gaussa na 15,5 milimetra, CDR1-mGHPH jest rozpuszczany z detergentami zawierającymi glukozę, o których mówi się, że jest zagregowanym lub szerokim zagregowanym pikiem. Wyższe piki dla DDM wskazują, że duża część rozpuszczonego DMN G CDR1-mGHPHis może być zdenaturowana.

W chromatogramach FSCC dla obudniczojonowych foscholiny i dwóch niejonowych detergentów tylko digitonina i dały podobny chromatogram do DDM. Fos-cholina 13 dawała symetryczny pik o ostrym kształcie, ale nawiązywała do znacznie mniejszej objętości elucji niż w przypadku DDM. Zoptymalizowany podwójny znacznik poprawił również wydajność oczyszczania i pomógł określić lokalizację, transport i stabilność termiczną białek błonowych.

Technologia ekspresji heterologicznej może być również stosowana w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i szczegółowej charakterystyce wielu innych białek błonowych.