Name: Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj cyfrową kropelkową reakcję PCR do analizy zdarzeń NHEJ i ilościowego wykrywania mutacji indeli w genetycznie modyfikowanych populacjach komarów Anopheline. Ta metoda oferuje niezawodne i szybkie badanie zmian genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie zostało zapewnione przez University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ jest profesorem Donalda Brena na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

1. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy EDTA/jąder (EDTA/NLS) w proporcji 500 μl NLS i 120 μL EDTA na próbkę. Skalowanie w górę dla wielu próbek. Schłodzić mieszaninę na lodzie. 
	UWAGA: Roztwór stanie się mętny w ciągu 2-5 minut po schłodzeniu, w zależności od objętości.</li>
	<li>Homogenizować próbkę komara za pomocą homogenizatora mechanicznego przez 10-15 s w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 600 μl schłodzonego EDTA/NLS; dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 17,5 μl 20 mg/ml proteinazy K do probówki i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 55 °C. Alternatywnie, inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z wytrząsaniem i wirować próbkę co 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek do próbki o temperaturze pokojowej i energicznie wirować przez 20 sekund.</li>
	<li>Schładzać próbkę przez 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbkę w celu osadzenia białek w temperaturze 15 890 RCF przez 4 minuty.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant zawierający DNA i przenieść go do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 μl izopropanolu.</li>
	<li>Delikatnie wymieszaj roztwór, odwracając probówkę 5-10 razy. Wirować przez 1 minutę przy 15 890 RCF. Ostrożnie zdekantować supernatant, zachowując osad DNA.</li>
	<li>Dodać 600 μl 70% etanolu o temperaturze pokojowej. Umyj granulowane DNA, delikatnie odwracając probówkę.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 15 890 RCF. Ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację za pomocą szklanej końcówki do pipety.</li>
	<li>Odwróć probówkę na czysty papier chłonny i susz granulkę na powietrzu przez 10-15 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić DNA wodą klasy PCR. Użyj 20 μl na pojedynczą próbkę komara lub 100 μl na 10 komarów w puli. 
	UWAGA: Metody ekstrakcji DNA próbek komarów przy użyciu dostępnego na rynku zestawu (patrz tabela materiałów) są zaadaptowane z protokołu producenta dotyczącego izolowania genomowego DNA z komórek kultury tkankowej i tkanek zwierzęcych.</li>
</ol>
2. reakcje ddPCR i przygotowanie do generowania kropel
<ol>
	<li>Określ ilościowo DNA za pomocą fluorometru. 
	UWAGA: Do testu drop-off zaleca się użycie zakresu 3 000-30 000 haploidalnych kopii genomu na reakcję, który jest przeznaczony do wykrywania zdarzeń NHEJ za pomocą sondy znakującej HEX, która wiąże się z sekwencją WT w docelowym miejscu cięcia i nie ulega wyżarzaniu (odpadaniu), jeśli w miejscu docelowym nastąpi delecja lub insercja, wskazujące na obecność wariantu NHEJ.</li>
	<li>Oblicz liczbę kopii, używając haploidalnego genomu, masy i stężenia DNA w ekstrakcie. Odbywa się to poprzez pomnożenie stężenia wyekstrahowanego DNA przez objętość użytą do uzyskania całkowitej masy DNA, a następnie podzielenie go przez masę haploidalnego genomu. Upewnij się, że dodana objętość mieści się w przedziale 1-10 μl. Rozcieńczyć w razie potrzeby, aby znaleźć się w zalecanym zakresie kopii haploidalnego genomu. 
	UWAGA: Szacuje się, że jeden haploidalny genom Anopheles gambiae wynosi 0,27 pg na dorosłego komara10.</li>
	<li>Projektowanie podkładów i sond. Zaprojektuj startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu o temperaturze topnienia startera (Tm) w zakresie 55-60 °C, które otaczają końce 5' i 3' miejsca docelowego gRNA, wytwarzając amplikon 150-400 pz.
	<ol>
		<li>Sonda znakowana HEX (heksachlorofluoresceiną) do wykrywania NHEJ: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do miejsca docelowego i dodaj sondę HEX do końca 5' i BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.</li>
		<li>Sonda znakowana FAM (6-karboksyfluoresceiną) w celach informacyjnych WT: Zaprojektuj oligonukleotyd o długości ~ 15-20 pz komplementarny do konserwatywnego miejsca genomu odległego (około 25 pz) od miejsca docelowego i dodaj sondę FAM do końca 5' i BHQ1 do końca 3'. Tm sondy hydrolizy powinno być o 3-10 °C wyższe niż Tm starterów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie reakcji PCR
<ol>
	<li>Przygotować 25 μl mieszanki próbek ddPCR z następującymi składnikami: ddPCR supermix dla sond (bez UTP): 12,5 μL, startery do przodu i do tyłu (10 μM): 1 μL każda, sondy HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL każda, DNA: 1-5 μL (3 750-37 500 kopii haploidalnego genomu) i woda: do 25 μL.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj reakcje, pipetując wirowo lub zwrotnie (góra i dół) (20x). 
	UWAGA: Jeśli reakcje zachodzą na 96-dołkowej płytce, pipetuj całą objętość w górę i w dół 20 razy, zamiast wirować, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Krótko odwirować próbki, aby osadzić mieszaninę na dnie probówki lub studzienki. 
	UWAGA: Upewnij się, że reakcje zachodzą w temperaturze pokojowej dla wytwarzania kropel. Przygotuj 1x mieszanki ddPCR dla dodatkowych/niewykorzystanych dołków w każdym kartridżu (każdy wkład ma 8 dołków).</li>
</ol>
4. Generowanie kropel
<ol>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 50 μl załaduj 20 μl mieszanki próbek ddPCR do środkowego rzędu wkładu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, góra).</li>
	<li>Załaduj 70 μl oleju do dolnego rzędu. Załaduj 20 μL 1x ddPCR supermix do nieużywanych studzienek. 
	UWAGA: Nie wprowadzaj bąbelków.</li>
	<li>Umieść uszczelkę dotykając tylko krawędzi, unikając środkowego wklęsłego obszaru (Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść płytkę bezpiecznie w generatorze kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć bieg.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 40 μl mieszanki emersyjnej z górnego rzędu wkładu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A, na dole) do płytki 96-dołkowej.
	<ol>
		<li>Pobieraj ciecz przez 3-5 s pod kątem 45-30°. Mieszaninę należy wypychać powoli przez ponad 3 sekundy pod kątem 45° na bok studzienki, pozwalając jej spłynąć po boku. Można przejść do drugiego zatrzymania (całkowitego wydalenia) pipety, aby usunąć cały płyn.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą foliowych zgrzewaczy termicznych zgrzewać płyty przez 5 s w temperaturze 180 °C.</li>
</ol>
5. PCR
<ol>
	<li>Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) i ustaw zalecane warunki PCR, jeśli postępujesz zgodnie z wytycznymi NHEJ dotyczącymi zrzutu, jak następuje:
	<ol>
		<li>Wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 min.</li>
		<li>Ustaw 40 cykli po 94 °C na 30 s na denaturację, 55 °C na 1 minutę na wyżarzanie i 60 °C na 2 minuty na przedłużenie.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 98 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Temperaturę wyżarzania dla określonych podkładów i zestawów sond można zoptymalizować za pomocą gradientu termicznego. Stosuj szybkość narastania 2 °C/s dla wszystkich etapów. Warunki PCR powinny być dostosowane w zależności od każdego projektu i konfiguracji eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Odczyt kropli
<ol>
	<li>Umieść płytkę bezpiecznie w czytniku kropel z dołkiem A-1 w lewym górnym rogu (wygładzony róg, pozostałe trzy są obramowane) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Ustaw płytkę w programie: Wyznaczanie FAM jako znanego kanału referencyjnego i HEX jako nieznanego (Rysunek 2A).</li>
	<li>Przeprowadź eksperyment z czytaniem kropelkowym jako bezpośrednią kwantyfikację. Po zakończeniu przebiegu zmień typ eksperymentu na Drop-Off (DOF) dla analizy (Rysunek 2A).</li>
</ol>
7. Analiza
<ol>
	<li>Wyznacz prawidłowe parametry eksperymentalne (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A): Informacje o próbce, SuperMix, nazwa celu (WT lub NHEJ), typ celu (ref lub nieznany), sygnał Ch1 (HEX lub FAM), sygnał Ch2 (HEX lub FAM) i ręcznie ustaw próg liczby kropel (zaleca się powyżej 10 000 dla wiarygodnych wyników). Oprogramowanie wykona większość analizy z wyznaczonym parametrem.</li>
	<li>Sprawdź liczbę kropel w zakładce Droplet; upewnij się, że wszystkie mają powyżej 10 000 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Sprawdź amplitudę 1 D, aby uzyskać skuteczną separację sygnału od negatywów.</li>
	<li>W Edytorze blach podświetl całą płytę i ustaw Typ eksperymentu na Drop-off.</li>
	<li>Ustaw cel WT jako odniesienie, wyznaczając kanał pierwszy dla FAM i kanał drugi dla HEX.</li>
	<li>Ustaw cel NHEJ jako nieznany, oznaczając kanał pierwszy jako FAM i kanał drugi jako brak.</li>
	<li>Na karcie Amplituda 2D ustaw progi klastra za pomocą narzędzi wykresu dla każdej próbki. Weźmy pod uwagę ogon związany z gromadą WT; jest to normalne dla testów NHEJ (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Na karcie Współczynnik kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu wykresu. Wybierz Obfitość ułamkowa. Wykres będzie teraz wykreślał punkt odpowiadający procentowi zdarzeń NHEJ (Rysunek 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34, 78-83 (2016).</li>
<li>Courtier-Orgogozo, V., Morizot, B., Boëte, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agricultural+pest+control+with+CRISPR-based+gene+drive%3A+time+for+public+debate%3A+Should+we+use+gene+drive+for+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Agricultural pest control with CRISPR-based gene drive: time for public debate: Should we use gene drive for pest control.</a> EMBO Reports. 18 (6), 878-880 (2017).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+and+direct+Sanger+sequencing+for+the+detection+of+the+BRAFV600E+mutation+in+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR and direct Sanger sequencing for the detection of the BRAFV600E mutation in papillary thyroid carcinoma.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 33 (6), 22902(2019).</li>
<li>Dong, L., Wang, S., Fu, B., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+droplet+digital+PCR+and+next+generation+sequencing+for+characterizing+DNA+reference+material+for+KRAS+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of droplet digital PCR and next generation sequencing for characterizing DNA reference material for KRAS mutation detection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9650(2018).</li>
<li>Bell, C. C., Magor, G. W., Gillinder, K. R., Perkins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screening+strategy+for+detecting+CRISPR_Cas9+induced+mutations+using+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR_Cas9 induced mutations using next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 15 (1), 1002(2014).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., Kelsey, A., Pham, T. B., Bennett, E. P., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+droplet+PCR+and+IDAA+for+the+detection+of+CRISPR+indel+edits+in+the+malaria+species+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Digital droplet PCR and IDAA for the detection of CRISPR indel edits in the malaria species Anopheles stephensi.</a> Biotechniques. 68 (4), 172-179 (2020).</li>
<li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298 (5591), 129-149 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Digital-droplet PCR jest skuteczną metodą określania obecności alleli indel wynikających ze zdarzeń NHEJ w systemie napędu genowego opartym na Cas/gRNA i pozwala na ilościowe określenie częstości występowania tych alleli u osób lub populacji. Niektóre kroki protokołu muszą być przestrzegane ze szczególną ostrożnością, aby osiągnąć wiarygodne wyniki. Po pierwsze, ekstrakcja genomowego DNA musi być przeprowadzona ostrożnie, aby zapewnić wysoką jakość i wystarczającą ilość. Dobra ekstrakcja pozwoli na dokładne określenie haploidalnych kopii genomu na reakcję. Z naszego doświadczenia wynika, że dostępny na rynku zestaw (patrz tabela materiałów) zapewniał niezmiennie wysoką jakość ekstrakcji DNA. Jednak ekstrakcje pojedynczych komarów mogą okazać się szczególnie trudne, ponieważ osad DNA staje się trudny do wizualizacji i może być łatwo zassany przez supernatant, jeśli nie będzie ostrożny. Po drugie, startery i sondy muszą być starannie zaprojektowane. Przed zakończeniem eksperymentu ddPCR upewnij się, że zaprojektowane startery dają pojedynczy produkt PCR, wykonując najpierw tradycyjny PCR i wizualizując pojedynczy produkt za pomocą elektroforezy żelowej. Referencyjna sonda FAM musi być również zaprojektowana w taki sposób, aby była komplementarna z wysoce konserwatywną sekwencją. Zapewni to dokładne wykrywanie alleli WT w całej zróżnicowanej populacji. Kombinacje startera/sondy dla każdego unikalnego eksperymentu będą miały różne warunki termocyklera i zaleca się optymalizację tych warunków za pomocą gradientu termicznego.
Istnieją inne metody identyfikacji indeli, takie jak sekwencjonowanie Sangera lub NGS. Sekwencjonowanie Sangera jest ograniczone, ponieważ ma dolną granicę wykrywalności i niską zdolność wykrywania do identyfikacji nowych wariantów. Sekwencjonowanie Sangera jest również pracochłonne i nie jest wysokoprzepustowe. W porównaniu z sekwencjonowaniem Sangera, NGS nie ma takich samych ograniczeń związanych z niską czułością, mocą wykrywania i przepustowością. Kolejną zaletą NGS jest jego zdolność do wykrywania różnych mutacji, od polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) po rearanżacje. Jednak NGS jest bardziej kosztowną i czasochłonną metodą w zastosowaniu do oznaczania indeli związanych z Cas9 / gRNA, ponieważ istnieje tylko jeden region docelowy zainteresowania i najlepiej nadaje się do większych analiz całego genomu. W porównaniu z wyżej wymienionymi metodami, ddPCR charakteryzuje się wysoką przepustowością i krótkim czasem realizacji. Jeśli materiały i instrumenty ddPCR są dostępne we własnym zakresie, 96 próbek można przetworzyć w ciągu 1-2 dni, co sprawia, że dobrze nadaje się do szybkiej analizy dużych prób organizmów modyfikowanych Cas9/gRNA.
Chociaż istnieje wiele korzyści płynących z ddPCR, istnieją również ograniczenia. Po pierwsze, sprzęt do ddPCR nie jest często dostępny w niezależnym środowisku laboratoryjnym. Sprzęt ddPCR może być dostępny wspólnie w większych instytucjach badawczych, ale nie pozwala to na łatwe generowanie i analizę danych poza instytucją. Po drugie, w przeciwieństwie do alternatyw, ddPCR nie zapewnia indywidualnych unikalnych sekwencji zidentyfikowanych mutacji indel. Digital-droplet PCR dostarczy częstotliwości mutacji indel w populacji, ale bez sekwencji nie można określić, czy obecne indele są bardziej skłonne do zachowania, czy zahamowania funkcji genu będącego przedmiotem zainteresowania. Metoda ddPCR jest prawdopodobnie najlepiej przystosowana do analizy dzikich populacji po próbie uwolnienia w terenie organizmu napędowego opartego na Cas9 / gRNA, ponieważ może skutecznie określić częstotliwość wprowadzania transgenu do rodzimej populacji i generowania indeli w populacji w czasie zbliżonym do rzeczywistego. Ze względu na szybki czas realizacji ddPCR, możliwe byłoby cotygodniowe pobieranie próbek i analizowanie populacji w regionie prób terenowych, gdyby materiały były dostępne lokalnie. Koszty początkowe związane z zakupem, importem i konfiguracją sprzętu do ddPCR byłyby wysokie w odległych laboratoriach, ale korzyści płynące z możliwości rygorystycznej oceny dzikiej populacji, która jest poddawana modyfikacji za pomocą systemu napędowego, uzasadniałyby koszty.

Napędy genowe mają ogromny potencjał do kontrolowania populacji owadów o znaczeniu medycznym i rolniczym1,2,3,4,5. Na przykład systemy napędu genowego oparte na nukleazach Cas CRISPR i przewodnikowych RNA (gRNA) mogą być używane do modyfikowania populacji komarów-wektorów poprzez wprowadzenie cech, które nadają oporność pasożytom malarii, co prowadzi do zmniejszenia transmisji i zmniejszenia liczby chorób1,4,5. System gen-napęd kopiuje siebie i związaną z nim cechę z jednego homologicznego chromosomu do drugiego w premejotycznych komórkach rozrodczych, a to zapewnia, że większość potomstwa dziedziczy popęd i tworzy potencjał do długotrwałej i zrównoważonej modyfikacji populacji w terenie. Jednak jedną z wad metod opartych na Cas/gRNA jest możliwość generowania mutacji insercji i delecji (indel) poprzez naprawę DNA niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), co skutkuje generowaniem alleli opornych na napędy, które po zgromadzeniu do wystarczająco wysokiej częstotliwości w populacji mogą powstrzymać rozprzestrzenianie się układu napędowego1,2,3,4. Protokół ten szczegółowo opisuje wysokoprzepustową i niezawodną metodę, która może określić częstość występowania i względną ilość mutacji indel, zarówno na poziomie populacji, jak i indywidualnym, podczas napędu genowego opartego na Cas / gRNA.
Metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) zapewniają niezrównaną rozdzielczość sekwencjonowania. Jednak koszty i wymagania techniczne związane z NGS zabraniają rutynowych testów i ograniczają jego stosowanie jako metody o wysokiej przepustowości do oceny indels6,7,8. Tradycyjne metody kwantyfikacji PCR są od dawna stosowane jako standardowa procedura oceny indeli genomowych; Metody te są jednak pracochłonne, pozyskiwanie danych zajmuje dużo czasu i charakteryzują się wysokim stopniem zmienności. Udowodniono, że Digital-Droplet PCR (ddPCR) jest bardziej czuły w wykrywaniu mutacji niż sekwencjonowanie Sangera w niektórych zastosowaniach i ma niższą granicę wykrywalności niż NGS w innych6,7,8,9. Co więcej, koszt oceny zestawu próbek i czas oczekiwania na uzyskanie wyników jest odpowiednio niższy i szybszy w przypadku ddPCR niż sekwencjonowanie Sangera lub NGS9. Korzystając z systemu podwójnej sondy, test Drop-Off identyfikuje allele NHEJ na podstawie braku sekwencji typu dzikiego (WT) w docelowym miejscu cięcia Cas9 skierowanym na gRNA. W tym teście krótki amplikon zawierający przewidywane miejsce cięcia systemu opartego na Cas / gRNA jest amplifikowany określoną parą starterów. Jedna sonda fluorescencyjna jest zaprojektowana tak, aby wiązać się z konserwatywnym obszarem amplikonu, a inna sonda fluorescencyjna rozpoznaje sekwencję WT w miejscu cięcia. W obecności allelu NHEJ, ten ostatni nie wiąże się z amplikonem.
Użycie ddPCR daje możliwość projektowania starterów do celowania w delecje, różnice między pojedynczymi parami zasad i insercje, co pozwoli na profilowanie NHEJ w analizach populacji komarów9. Biorąc pod uwagę te atrakcyjne cechy, stworzyliśmy protokół ddPCR do wysokoprzepustowego wykrywania indeli generowanych przez system napędu genów oparty na Cas/gRNA u komarów.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Super Mix do sond (bez dUTP)</td><td>Odczynnik do ekstrakcji DNA Bio-Rad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>(np. Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard)</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (pH 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (certyfikowany ACS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A416-500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do lizy jąder (NLS) (zestaw do oczyszczania genomowego DNA)</td> <td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> klasy PCR <td>Można użyć dowolnej certyfikowanej wody klasy PCR</td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek (zestaw do oczyszczania DNA genomowego Wizard)</td> <td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K 20 mg/ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-dołkowa płytka</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>Generator kropel DG8 Kartridż i uszczelki</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>Droplet Generation Olej do sond</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny sondy (np. Sondy FAM/HEX)</td>Sondy <td>Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>są specyficzne dla eksperymentów i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.</td></tr><tr><td>Startery oligonukleotydowe do przodu i do tyłu</td><td>Startery Sigma-Aldrich</td><td>N/A</td><td>są specyficzne dla eksperymentu i można je kupić u dowolnego dostępnego certyfikowanego sprzedawcy.</td></tr><tr><td>< mocny>Sprzęt< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotykowy termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td>Może korzystać z innego termocyklera z funkcją gradientu i głęboką studnią</td></tr></tbody></table>

cyfrowa kropelkowa reakcja pcr w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów anopheline

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Ostatnie postępy w genomice komarów i technologiach inżynierii genetycznej zwiększyły zapotrzebowanie na szybkie i skuteczne metody wykrywania docelowych zmian sekwencji DNA na dużą skalę. W szczególności wykrywanie insercji i delecji (indeli) w miejscach edytowanych genów generowanych przez przewodnik CRISPR RNA (gRNA) / niehomologiczne łączenie końców za pośrednictwem Cas9 jest ważne dla oceny wierności mutagenezy i częstotliwości niezamierzonych zmian. Opisujemy tutaj protokół cyfrowego kropelkowego PCR (ddPCR), który doskonale nadaje się do wysokoprzepustowej analizy NHEJ. Chociaż metoda ta nie generuje danych, które identyfikują pojedynczą zmienność sekwencji, zapewnia ilościowe oszacowanie zmienności sekwencji w populacji. Dodatkowo, przy odpowiednich zasobach, protokół ten może być wdrożony w warunkach laboratoryjnych w terenie łatwiej niż sekwencjonowanie nowej generacji lub sekwencjonowanie Sangera. ddPCR ma również szybszy czas oczekiwania na wyniki niż którakolwiek z tych metod, co pozwala na szybszą i pełniejszą analizę zmienności genetycznej w dzikich populacjach podczas prób terenowych organizmów modyfikowanych genetycznie.

Zastosowanie tej procedury opisano w pracy Carballar-Lejarazú i wsp.9. Analiza ddPCR typu Drop-off wykorzystuje dwie sondy fluorescencyjne do rozróżnienia sekwencji WT i indel: sonda FAM wiąże się z konserwatywną sekwencją w obrębie amplikonu, natomiast sonda HEX jest skierowana przeciwko sekwencji WT w docelowym miejscu (Rysunek 4A). W obecności indel sonda HEX nie zwiąże się z DNA. Reprezentatywne wyniki znajdują się na Rysunku 2, w Tabeli 1 oraz Tabeli 2 pracy Carballar-Lejarazú i wsp.9. Wykazano, że przy zastosowaniu tego protokołu metoda ddPCR pozwala wykryć szeroką gamę zdarzeń NHEJ indukowanych przez CRISPR-Cas9 oraz określić częstotliwość NHEJ w pojedynczej próbce lub próbce zbiorczej. Piętnaście różnych próbek zbiorczych, każda zawierająca 10 komarów, zawierało różne allele NHEJ (Tabela 2 pracy Carballar-Lejarazú i wsp.9). Zostały one przeanalizowane metodą ddPCR zgodnie z protokołem i parametrami przedstawionymi w niniejszym opracowaniu. Wyniki z Tabeli 19 wskazują, że we wszystkich 15 próbkach stwierdzono 100% alleli indel, co zidentyfikowano w analizie Drop-off (Rysunek 4B). W innym eksperymencie, przy użyciu tego protokołu ddPCR, zbadano 11 próbek zbiorczych komarów WT oraz komarów NHEJ o różnym procencie NHEJ (0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 100%), a wyniki (Rysunek 2; Carballar- Lejarazú i wsp.9) wykazały, że zidentyfikowany procent jest zbliżony do wartości uzyskanych za pomocą porównawczej techniki wykrywania indeli poprzez analizę amplikonów (Rysunek 4C).
<img alt="Układ droplet digital PCR: generator, termocykler, czytnik kropelek, do analizy ilościowej DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Układ i procedura eksperymentalna. (A) Przygotowanie wkładu do generowania kropelek. (Góra) Próbki są wypełniane w środkowym rzędzie wkładu, natomiast olej jest wypełniany w rzędzie dolnym. (Dół) Górny rząd wypełniony zemulgowanymi kropelkami po procesie generowania kropelek. (B) Generator kropelek z wkładem wypełnionym próbką i założoną uszczelką. (C) Płytka 96-dołkowa przykryta folią uszczelniającą w termocyklerze. (D) Czytnik kropelek z umieszczoną płytką 96-dołkową, zabezpieczoną metalową pokrywą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Edytor płytki PCR i wykres liczby kropel do analizy ilościowej w eksperymencie ekspresji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Odczyt kropel. (A) Interfejs oprogramowania do odczytu kropel. Pomarańczowe pola wskazują studzienki z próbkami. Szare pola to studzienki puste. Parametry eksperymentalne są konfigurowane w panelu Edit Tools (po prawej stronie). Każdą próbkę można edytować, klikając w odpowiednie pole próbki. Dla Experimental Type wybierz Drop Off (DOF). W informacjach o próbce wpisz odpowiednie dane dla Name (nazwy) i Type (typu) próbki, a także SuperMix. W sekcji Assay Information wybierz Basic Drop-Off. Dla próbki WT wybierz WT jako Target Name, Ref jako Target Type oraz odpowiednio FAM i HEX dla Signal Ch1 i Ch2. Dla próbek NHEJ wpisz odpowiednią nazwę w polu Target Name, wybierz Unknown dla Target Type oraz FAM dla Signal Ch1. Pozostaw Signal Ch2 jako None. (B) Wyniki liczby kropel dla wielu próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres 2D i wykres stosunku/obfitości przedstawiające rozkład indeli oraz analizę procentową zmienności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza testu Drop-Off. (A) Wykres klastrów 2D dla liczby kropel alleli WT i NHEJ. W zakładce 2D Amplitude wszystkie krople są domyślnie niezaklasyfikowane. Na tym rysunku kolory zostały przypisane ręcznie w celu odróżnienia grup. Pomarańczowe kropki stanowią liczbę alleli WT uzyskaną poprzez wiązanie sond FAM i HEX odpowiednio w sekwencji referencyjnej i sekwencji miejsca docelowego. Niebieskie kropki reprezentują wyniki kropel, w których nastąpiło wiązanie FAM do sekwencji referencyjnej, ale brak wiązania HEX w sekwencji miejsca docelowego (stąd tzw. drop-off sondy HEX). Szare kropki to puste krople, w których nie wystąpiło wiązanie ani FAM, ani HEX. (B) Wykresy stosunku/obfitości zdarzeń NHEJ. W zakładce Ratio należy wybrać Fractional Abundance, aby uzyskać wykres z odpowiadającym procentem zdarzeń NHEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu edycji genów CRISPR-Cas9 z primerami ddPCR; tabela wyników indeli i porównanie wykresów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62607/62607fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zastosowanie testu Drop-Off z wykorzystaniem ddPCR do identyfikacji i ilościowego oznaczenia niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w transgenicznej linii Anopheles stephensi, AsMCRkh1. (A) Schematyczny przedstawienie testu ddPCR Drop-Off służącego do wykrywania mutacji w docelowym miejscu DNA z wykorzystaniem systemu podwójnych sond. Amplikon o długości 150-400 bp jest amplifikowany za pomocą primerów forward i reverse. Sonda znakowana FAM jest zaprojektowana tak, aby wiązać się z konserwowaną sekwencją amplikonu, natomiast sonda znakowana HEX wiąże się z docelowym miejscem gRNA typu WT. (B) Wykrywanie różnych typów indeli za pomocą ddPCR. Piętna grupy po 10 komarów AsMCRkh1, zawierające różne typy indeli, w tym insercje, delecje i substytucje, zostały przeanalizowane testem ddPCR Drop-Off. Szczegóły dotyczące mutacji i sekwencji znajdują się w Tabeli 2 oraz Tabeli S3 pracy Carballar et al.9. (C) Ilościowe oznaczenie NHEJ w mieszanych próbkach komarów AsMCRkh1 i WT w różnych stosunkach (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 oraz 0:10) przy użyciu ddPCR oraz porównawczej techniki wykrywania indeli poprzez analizę amplikonów9. Obrazy zaadaptowane z Carballar-Lejarazú et al. Biotechniques. 68(4):172-179 (2020)9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62607/62607fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Starter/Sonda</td>
			<td >Sekwencja (5’ » 3’)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Starter przedni ddPCR</td>
			<td >ATGATCAAATGTCGACCG</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Starter odwrotny ddPCR</td>
			<td >ACCGTACTGGTTGAACA</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Sonda ddPCR HEX (BHQ1)</td>
			<td >[HEX]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1]</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Sonda ddPCR FAM (BHQ1)</td>
			<td >[6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1]</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">HEX: heksachlorofluoresceina, FAM: 6-karboksyfluoresceina, BHQ: Black Hole Quencher</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów i sond.

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Protokół ten zapewnia wysoką przepustowość i wiarygodny skład do analizy NHEJ, która może określić częstość występowania i względną ilość mutacji Indel w populacjach komarów z edytowanymi genami. W porównaniu z sekwencjonowaniem nowej generacji lub sekwencjonowaniem Sangera, ddPCR ma krótszy czas oczekiwania na wyniki, co pozwala na szybką i kompletną analizę zmienności genetycznej w poszukiwaniu organizmów modyfikowanych genetycznie. Metoda ta powinna być ogólnie stosowana do wszystkich systemów doświadczalnych.Procedurę zademonstruje Thai Pham, pracownik naukowy z laboratorium Yanga. Na początek przygotuj 25 mikrolitrów cyfrowej kropelki PCR lub mieszanki próbek ddPCR, dodając ddPCR super mix, startery do przodu i do tyłu, sondy HEX lub FAM, DNA i wodę w proporcjach opisanych w tekście. Następnie dokładnie wymieszaj reakcję przez wirowanie.Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 50 mikrolitrów załaduj 20 mikrolitrów mieszanki próbek ddPCR do środkowego rzędu wkładu. Następnie użyj pipety wielokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów, aby załadować 70 mikrolitrów oleju do dolnego rzędu bez generowania pęcherzyków podczas pipetowania. Umieść uszczelkę, dotykając tylko krawędzi, omijając środkową, wklęsłą powierzchnię, a następnie umieść płytkę bezpiecznie w generatorze kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć bieg.Aby przenieść mieszaninę zanurzeniową z górnego rzędu wkładu do płytki 96-dołkowej, użyj pipety wielokanałowej i upuść 40 mikrolitrów próbki cieczy na trzy do pięciu sekund pod kątem od 30 do 45 stopni. Następnie powoli wyrzucaj mieszaninę do studzienki przez ponad trzy sekundy pod kątem 45 stopni, pozwalając jej opaść z boku, a następnie przejdź do drugiego zatrzymania pipety, aby całkowicie usunąć płyn. Za pomocą foliowych zgrzewów termicznych zgrzewaj płytki na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza.Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i ustaw warunki PCR dla wytycznych dotyczących zrzutu NHEJ, ustawiając początkową denaturację na 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie ustaw 40 cykli w temperaturze 94 stopni Celsjusza na 30 sekund na denaturację, 55 stopni Celsjusza od jednej minuty do wyżarzania i 60 stopni Celsjusza na dwie minuty na przedłużenie. Po 40 cyklach ustaw przytrzymaj na 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, a końcowe przytrzymaj na cztery stopnie Celsjusza.Stosuj szybkość narastania wynoszącą dwa stopnie Celsjusza na sekundę dla wszystkich kroków. Temperatura wyżarzania będzie się różnić w zależności od zastosowanych sond lub podkładu. Umieść płytkę bezpiecznie w czytniku kropel z dobrze opisanym A1 w lewym górnym rogu.Otwórz program i ustaw płytkę, wyznaczając FAM jako znany kanał referencyjny i HEX jako nieznany dla każdej studni. Następnie zmień nazwę każdej próbki. Uruchom eksperyment z odczytem kropli jako bezpośrednią kwantyfikację podczas zapisywania szablonu.Wyznacz prawidłowe parametry eksperymentalne do analizy oprogramowania, a mianowicie informacje o próbce, super mix, nazwę celu, typ celu, kanał sygnałowy pierwszy i kanał drugi. Następnie ustaw próg liczby kropel powyżej 10 000, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Następnie sprawdź liczbę kropel dla każdej studzienki w zakładce kropli, upewniając się, że wszystkie mają powyżej 10 000.Na koniec sprawdź amplitudę 1D, aby uzyskać skuteczną separację sygnału od negatywów. W edytorze blach podświetl całą płytę i ustaw typ eksperymentu na drop-off. Ustaw cel WT jako odniesienie, wyznaczając kanał pierwszy dla FAM i kanał drugi dla HEX.Ustaw cel NHEJ jako nieznany, oznaczając kanał pierwszy jako FAM i kanał drugi jako brak. Na karcie Amplituda 2D ustaw progi klastra za pomocą narzędzi wykresu dla każdej próbki. Ogon jest zwykle związany z klastrem WT dla testów NHEJ.Na karcie współczynnika kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu wykresu i wybierz liczebność ułamkową, aby wykreślić punkt odpowiadający procentowi zdarzeń NHEJ. 15 różnych pobranych próbek 10 komarów, z których każda zawierała różne allele NHEJ, przeanalizowano i zidentyfikowano za pomocą testu drop-off, a wyniki wykazały, że wszystkie 15 próbek zawierało 100% allele Indel. W innym eksperymencie 11 pobranych próbek komarów typu dzikiego i komarów NHEJ o różnym procencie NHEJ zostało zbadanych za pomocą tego protokołu ddPCR.Wyniki pokazały, że zidentyfikowany odsetek był stosunkowo zbliżony do wykrywania Indel za pomocą techniki analizy amplikonowej. Pipetować powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i pozwolić, aby wszystkie zemulgowane kropelki spłynęły po ściankach studzienek.

digital-droplet-pcr-to-detect-indels-mutations-genetically-modified

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Oligonukleotydy można wykorzystać do specyficznej lokalnie podstawienia pojedynczego nukleotydu w transfekowanych genach docelowych zarówno w komórkach Anopheles gambiae, jak i Anopheles stephensi.

Transfekcja i mutagenza genów docelowych w komórkach komarów przy użyciu oligonukleotydów modyfikowanych kwasem nukleinowym typu Locked Nucleic Acid

Opisano szybką i niedrogą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA pasożytów malarii oraz wektorów z okazów komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelex, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazach jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów, a także identyfikację molekularną gatunków bliźniaczych Anopheles za pomocą PCR.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Przedstawione tutaj protokoły ilustrują trzy alternatywne sposoby oceny wydajności genetycznie modyfikowanych komarów przeznaczonych do kontroli wektorów w laboratoryjnych próbach z małymi klatkami. Każdy protokół jest dostosowany do konkretnej modyfikacji, jaką niesie ze sobą szczep komarów (napęd genowy lub nie-genowy) oraz rodzajów mierzonych parametrów.

Badania laboratoryjne w małych klatkach genetycznie modyfikowanych komarów anofeliny

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj cyfrową kropelkową reakcję PCR do analizy zdarzeń NHEJ i ilościowego wykrywania mutacji indeli w genetycznie modyfikowanych populacjach komarów Anopheline. Ta metoda oferuje niezawodne i szybkie badanie zmian genetycznych.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Przeglądaj więcej filmów