Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline
28 czerwca 2021
Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.
Protokół ten zapewnia wysoką przepustowość i wiarygodny skład do analizy NHEJ, która może określić częstość występowania i względną ilość mutacji Indel w populacjach komarów z edytowanymi genami. W porównaniu z sekwencjonowaniem nowej generacji lub sekwencjonowaniem Sangera, ddPCR ma krótszy czas oczekiwania na wyniki, co pozwala na szybką i kompletną analizę zmienności genetycznej w poszukiwaniu organizmów modyfikowanych genetycznie. Metoda ta powinna być ogólnie stosowana do wszystkich systemów doświadczalnych.
Procedurę zademonstruje Thai Pham, pracownik naukowy z laboratorium Yanga. Na początek przygotuj 25 mikrolitrów cyfrowej kropelki PCR lub mieszanki próbek ddPCR, dodając ddPCR super mix, startery do przodu i do tyłu, sondy HEX lub FAM, DNA i wodę w proporcjach opisanych w tekście. Następnie dokładnie wymieszaj reakcję przez wirowanie.
Za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 50 mikrolitrów załaduj 20 mikrolitrów mieszanki próbek ddPCR do środkowego rzędu wkładu. Następnie użyj pipety wielokanałowej o pojemności 200 mikrolitrów, aby załadować 70 mikrolitrów oleju do dolnego rzędu bez generowania pęcherzyków podczas pipetowania. Umieść uszczelkę, dotykając tylko krawędzi, omijając środkową, wklęsłą powierzchnię, a następnie umieść płytkę bezpiecznie w generatorze kropel i zamknij pokrywę, aby rozpocząć bieg.
Aby przenieść mieszaninę zanurzeniową z górnego rzędu wkładu do płytki 96-dołkowej, użyj pipety wielokanałowej i upuść 40 mikrolitrów próbki cieczy na trzy do pięciu sekund pod kątem od 30 do 45 stopni. Następnie powoli wyrzucaj mieszaninę do studzienki przez ponad trzy sekundy pod kątem 45 stopni, pozwalając jej opaść z boku, a następnie przejdź do drugiego zatrzymania pipety, aby całkowicie usunąć płyn. Za pomocą foliowych zgrzewów termicznych zgrzewaj płytki na pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza.
Umieść zapieczętowaną płytkę w termocyklerze i ustaw warunki PCR dla wytycznych dotyczących zrzutu NHEJ, ustawiając początkową denaturację na 95 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie ustaw 40 cykli w temperaturze 94 stopni Celsjusza na 30 sekund na denaturację, 55 stopni Celsjusza od jednej minuty do wyżarzania i 60 stopni Celsjusza na dwie minuty na przedłużenie. Po 40 cyklach ustaw przytrzymaj na 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, a końcowe przytrzymaj na cztery stopnie Celsjusza.
Stosuj szybkość narastania wynoszącą dwa stopnie Celsjusza na sekundę dla wszystkich kroków. Temperatura wyżarzania będzie się różnić w zależności od zastosowanych sond lub podkładu. Umieść płytkę bezpiecznie w czytniku kropel z dobrze opisanym A1 w lewym górnym rogu.
Otwórz program i ustaw płytkę, wyznaczając FAM jako znany kanał referencyjny i HEX jako nieznany dla każdej studni. Następnie zmień nazwę każdej próbki. Uruchom eksperyment z odczytem kropli jako bezpośrednią kwantyfikację podczas zapisywania szablonu.
Wyznacz prawidłowe parametry eksperymentalne do analizy oprogramowania, a mianowicie informacje o próbce, super mix, nazwę celu, typ celu, kanał sygnałowy pierwszy i kanał drugi. Następnie ustaw próg liczby kropel powyżej 10 000, aby uzyskać wiarygodne wyniki. Następnie sprawdź liczbę kropel dla każdej studzienki w zakładce kropli, upewniając się, że wszystkie mają powyżej 10 000.
Na koniec sprawdź amplitudę 1D, aby uzyskać skuteczną separację sygnału od negatywów. W edytorze blach podświetl całą płytę i ustaw typ eksperymentu na drop-off. Ustaw cel WT jako odniesienie, wyznaczając kanał pierwszy dla FAM i kanał drugi dla HEX.
Ustaw cel NHEJ jako nieznany, oznaczając kanał pierwszy jako FAM i kanał drugi jako brak. Na karcie Amplituda 2D ustaw progi klastra za pomocą narzędzi wykresu dla każdej próbki. Ogon jest zwykle związany z klastrem WT dla testów NHEJ.
Na karcie współczynnika kliknij ikonę koła zębatego w prawym górnym rogu wykresu i wybierz liczebność ułamkową, aby wykreślić punkt odpowiadający procentowi zdarzeń NHEJ. 15 różnych pobranych próbek 10 komarów, z których każda zawierała różne allele NHEJ, przeanalizowano i zidentyfikowano za pomocą testu drop-off, a wyniki wykazały, że wszystkie 15 próbek zawierało 100% allele Indel. W innym eksperymencie 11 pobranych próbek komarów typu dzikiego i komarów NHEJ o różnym procencie NHEJ zostało zbadanych za pomocą tego protokołu ddPCR.
Wyniki pokazały, że zidentyfikowany odsetek był stosunkowo zbliżony do wykrywania Indel za pomocą techniki analizy amplikonowej. Pipetować powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, i pozwolić, aby wszystkie zemulgowane kropelki spłynęły po ściankach studzienek.
Przegląd
Ten protokół opisuje kroki dla cyfrowej PCR kropletkowej (ddPCR) w celu analizy zdarzeń łączenia niehomologowych końców (NHEJ) po rozcięciu przez Cas9. Zapewnia niezawodną metodę ilościowego określania mutacji Indel w genetycznie modyfikowanych organizmach.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria genetyczna
- Biologia molekularna
- Genomika
Tło
- NHEJ jest krytycznym mechanizmem naprawy DNA.
- ddPCR oferuje zalety w porównaniu z tradycyjnymi metodami sekwencjonowania.
- Szybka analiza jest niezbędna dla zastosowań w terenie w modyfikacji genetycznej.
- Ta metoda jest stosowana w różnych systemach eksperymentalnych.
Cel badania
- Aby dostarczyć szczegółowego protokołu dla analizy zdarzeń NHEJ za pomocą ddPCR.
- Aby ułatwić ilościowe określanie różnic genetycznych w modyfikowanych organizmach.
- Aby wykazać skuteczność ddPCR w identyfikacji mutacji Indel.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszanki próbek ddPCR z określonymi reagentami.
- Ładowanie próbek do generatora kropelek i termocyklera.
- Ustawienie warunków PCR dla analizy NHEJ.
- Korzystanie z oprogramowania do odczytu kropelek i analizy danych.
Główne wyniki
- Wszystkie analizowane próbki wykazały 100% alleli Indel.
- Wyniki ddPCR były porównywalne z technikami analizy amplikonów.
- Osiągnięto niezawodne ilościowe określenie zdarzeń NHEJ.
- Metoda wykazała skuteczność w analizie różnic genetycznych.
Wnioski
- ddPCR jest niezawodnym narzędziem do analizy zdarzeń NHEJ.
- Protokół można dostosować do różnych badań genetycznych.
- Szybki czas realizacji zwiększa możliwości badawcze w genetyce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Digital-droplet PCR (ddPCR) enables rapid, quantitative detection of indel mutations in genetically modified mosquito populations, supporting high-throughput assessment of CRISPR-Cas9 editing fidelity. This method provides a field-deployable alternative to sequencing with faster turnaround, facilitating timely decision-making in gene drive and vector control programs. By delivering population-level mutation frequency data, ddPCR aids in de-risking genetic constructs and evaluating off-target potential during preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies indel mutation prevalence to assess CRISPR-Cas9 editing efficiency and mutagenesis consistency in target genomes.
- Operational Value: Enables rapid screening of edited mosquito pools to confirm on-target activity before advancing to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative NHEJ event data without requiring individual sequence identification, supporting scalable mutation burden assessment.
- Operational Value: Compatible with field-site laboratory implementation, reducing dependency on centralized sequencing infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures indel allele frequency across pooled samples to correlate genetic variation with phenotypic outcomes in gene drive systems.
- Operational Value: Delivers results faster than Sanger or next-generation sequencing, accelerating iteration cycles in preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ddPCR fits into the discovery continuum by enabling quantitative mutation analysis after gene editing and before phenotypic screening, supporting go/no-go decisions based on editing precision.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying NHEJ-derived indels as a proxy for editing efficiency at target loci.
- Screening: Provides standardized, reproducible quantification of mutation frequency across large sample sets for assay readiness.
- Analytics: Outputs fractional abundance of NHEJ events, allowing comparison of editing conditions and guide RNA performance.
- Translational Research: Enables continuity from edited construct validation to population-level genetic stability assessment.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across insect and other model systems for consistent NHEJ analysis in genetic engineering workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in editing fidelity through quantitative indel detection, reducing mechanistic ambiguity in gene-edited systems.
- Operational Value: High-throughput capability with minimal hands-on time and rapid results, improving lab throughput.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by establishing mutation frequency thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene drive constructs based on validated editing precision.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ddPCR setup, including sample preparation, droplet generation, and PCR optimization.
- Dependent on access to droplet generator, thermocycler, and fluorescence reader with appropriate channel configuration.
- Necessitates standardized primer and probe design for accurate target discrimination in NHEJ assays.
- Must account for variability in annealing temperature based on probe chemistry to ensure signal separation.
- Limited to relative quantification; does not provide allele-specific sequence information without complementary methods.
