Name: Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę bazowania miniskopu z wykorzystaniem wstępnie utwardzonego cementu stomatologicznego, która zmniejsza problem kurczenia się cementu i poprawia jakość obrazowania wapnia w mózgu myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (108-2320-B-002 -074, 109-2320-B-002-023-MY2).

<ol><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+activity+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+brain%3A+deep-brain+imaging+techniques+in+conscious+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals.</a> Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Aharoni, D., Hoogland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+investigations+with+open-source+miniaturized+microscopes%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141(2019).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+in+vivo+calcium+imaging+with+a+head-mount+miniaturized+microscope+in+the+amygdala+of+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61659(2020).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Chen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothalamic+switch+for+REM+and+Non-REM+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep.</a> Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Jimenez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety+cells+in+a+hippocampal-hypothalamic+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit.</a> Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).</li>
<li>Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+modulation+and+single-photon+calcium+imaging+in+anterior+cingulate+cortex+reveal+a+mechanism+for+effort-based+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions.</a> Journal of Neuroscience. , 2548(2020).</li>
<li>Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+cortical+Ca2%2B+imaging+in+freely+moving+mice+with+prism+probes+and+miniaturized+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55579(2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+lens+system+for+calcium+imaging+of+neuronal+activity+from+deep+brain+structures+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Corder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amygdalar+neural+ensemble+that+encodes+the+unpleasantness+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain.</a> Science. 363 (6424), 276-281 (2019).</li>
<li>Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+source%2C+wireless+capable+miniature+microscope+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An open source, wireless capable miniature microscope system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001(2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+miniscope+1-photon-based+calcium+imaging+signal+extraction+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings in freely moving rats.</a> Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).</li>
<li>Burger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+AAV+viral+vectors+pseudotyped+with+viral+capsids+from+serotypes+1%2C+2%2C+and+5+display+differential+efficiency+and+cell+tropism+after+delivery+to+different+regions+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system.</a> Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).</li>
<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Research. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
</ol>

Nie jest to badanie wspierane przez przemysł. Autorzy nie informują o finansowych konfliktach interesów.

Niniejszy raport opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny dla badaczy korzystających z dwusoczewkowego systemu miniskopów UCLA. Narzędzia zaprojektowane w naszym protokole są stosunkowo przystępne cenowo dla każdego laboratorium, które chce wypróbować obrazowanie wapnia in vivo . Niektóre protokoły, takie jak wstrzykiwanie wirusa, implantacja soczewek, posiewanie pozorów i powlekanie podstawowe, mogą być również stosowane w innych wersjach systemu miniskopowego w celu poprawy wskaźnika powodzenia obrazowania...

Reportery aktywności fluorescencyjnej są idealne do obrazowania aktywności neuronalnej, ponieważ są czułe i mają duże zakresy dynamiki1,2,3. Dlatego coraz więcej eksperymentów wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do bezpośredniej obserwacji aktywności neuronalnej1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Pierwszy zminiaturyzowany jednofotonowy mikroskop fluorescencyjny (miniskop) został zaprojektowany w 2011 roku przez Marka Schnitzera i wsp.5. Ten miniskop umożliwia naukowcom monitorowanie dynamiki fluorescencji komórek móżdżku u swobodnie zachowujących się zwierząt5 (tj. bez żadnych fizycznych ograniczeń, krępowania głowy, sedacji lub znieczulenia zwierząt). Obecnie technika ta może być stosowana do monitorowania powierzchownych obszarów mózgu, takich jak kora6,8,15,16; obszary podkorowe, takie jak grzbietowy hipokamp8,11,13,14 i striatum6,17; oraz głębokie obszary mózgu, takie jak brzuszny hipokamp14, amygdala10,18 i hypothalamus8,12.
W ostatnich latach opracowano kilka miniskopów o otwartym kodzie źródłowym4,5,6,7,11,13,17,19. Miniskop może być ekonomicznie zmontowany przez badaczy, jeśli będą postępować zgodnie z wytycznymi krok po kroku dostarczonymi przez zespół Miniscope Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA)4,7,11,13. Ponieważ optyczne monitorowanie aktywności neuronalnej jest ograniczone przez ograniczenia transmisji światła7 do i z populacji neuronów będących przedmiotem zainteresowania, zaprojektowano miniskop, który wymaga wstępnego zakotwiczenia soczewki o indeksie refrakcyjnym gradientu (GRIN) (lub soczewki obiektywowej) na dole miniskopu w celu powiększenia pola widzenia, które jest przekazywane z soczewki przekaźnikowej GRIN (lub soczewki przekaźnikowej)6, 7,8,10,16,17. Ta soczewka przekaźnikowa jest wszczepiana do docelowego obszaru mózgu w taki sposób, że aktywność fluorescencyjna docelowego obszaru mózgu jest przekazywana na powierzchnię soczewki przekaźnika6,7,8,10,16,17. Około 1/4 pełnego sinusoidalnego okresu światła przechodzi przez soczewkę obiektywu GRIN (skok ~ 0,25) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A1), co daje powiększony obraz fluorescencyjny6,7. Soczewka obiektywu nie zawsze jest zamocowana na dole miniskopu ani nie jest konieczne wszczepienie soczewki przekaźnikowej6,7,11,13,15. W szczególności istnieją dwie konfiguracje: jedna ze stałą soczewką obiektywu w miniskopie i soczewką przekaźnikową wszczepioną w mózg8,10,12,14,16 (Rysunek 1B1) oraz druga tylko ze zdejmowaną soczewką obiektywu6,7,11,13,15 (Rysunek 1B2). W projekcie opartym na kombinacji obiektywu stałego i wszczepionej soczewki przekaźnikowej, sygnały fluorescencyjne z mózgu są doprowadzane do górnej powierzchni soczewki przekaźnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A1)7,8,10,12,14,16. Następnie soczewka obiektywu może powiększać i przesyłać pole widzenia z górnej powierzchni soczewki przekaźnikowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A2). Z drugiej strony, konstrukcja soczewki GRIN z wymiennym obiektywem jest bardziej elastyczna, co oznacza, że preimplantacja soczewki przekaźnikowej do mózgu nie jest obowiązkowa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B2)6,7,11,13,15. Korzystając z miniskopu opartego na zdejmowanej soczewce obiektywu, badacze nadal muszą wszczepić soczewkę do docelowego obszaru mózgu, ale mogą wszczepić soczewkę obiektywu6,7,11,13,15 lub soczewkę przekaźnikową w mózgu6,7. Wybór obiektywu lub soczewki przekaźnikowej do implantacji determinuje konfigurację miniskopu, której badacz musi użyć. Na przykład miniskop V3 UCLA jest oparty na zdejmowanej konstrukcji soczewki obiektywu GRIN. Badacze mogą zdecydować się na bezpośrednie wszczepienie soczewki obiektywu w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania i zamontowanie "pustego" miniskopu na soczewce obiektywu6,7,11,13,15 (system z jedną soczewką; <silna klasa="xfig">Rysunek 1B2) lub wszczepić soczewkę przekaźnikową do mózgu i zamontować miniskop, który jest wstępnie zakotwiczony w soczewce obiektywu6,7 (system dwusoczewkowy; <silna klasa="xfig">Rysunek 1B1). Miniskop działa następnie jako kamera fluorescencyjna, rejestrując na żywo obrazy fluorescencji neuronów wytwarzanej przez genetycznie kodowany wskaźnik wapnia1,2,3. Po podłączeniu miniskopu do komputera, te obrazy fluorescencyjne mogą być przesyłane do komputera i zapisywane jako klipy wideo. Naukowcy mogą badać aktywność neuronalną, analizując względne zmiany fluorescencji za pomocą niektórych pakietów analitycznych20,21 lub napisać swoje kody do przyszłej analizy.
Miniskop V3 UCLA zapewnia użytkownikom elastyczność w określaniu, czy obrazować aktywność neuronalną za pomocą systemu jedno- czy dwusoczewkowego7. Wybór systemu rejestracji zależy od głębokości i wielkości docelowego obszaru mózgu. Krótko mówiąc, system jednosoczewkowy może obrazować tylko obszar, który jest powierzchowny (mniej niż około 2,5 mm głębokości) i stosunkowo duży (większy niż około 1,8 x 1,8 mm2), ponieważ producenci produkują tylko określony rozmiar soczewki obiektywowej. W przeciwieństwie do tego, system dwóch soczewek może być zastosowany do dowolnego docelowego obszaru mózgu. Jednak cement dentystyczny do przyklejania płytki bazowej ma tendencję do powodowania niewspółosiowości przy zmienionej odległości między soczewkami obiektywu i przekaźnika, co skutkuje słabą jakością obrazu. Jeśli używany jest system dwóch soczewek, dwie odległości robocze muszą być precyzyjnie wybrane, aby osiągnąć optymalną jakość obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Te dwie krytyczne odległości robocze znajdują się między neuronami a dolną powierzchnią soczewki przekaźnika oraz między górną powierzchnią soczewki przekaźnika a dolną powierzchnią soczewki obiektywu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A1). Jakakolwiek niewspółosiowość lub niewłaściwe umieszczenie soczewki poza odległością roboczą powoduje awarię obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C2). W przeciwieństwie do tego, system z jedną soczewką wymaga tylko jednej precyzyjnej odległości roboczej. Jednak rozmiar soczewki obiektywu ogranicza jego zastosowanie do monitorowania głębokich obszarów mózgu (soczewka obiektywu pasująca do miniskopu ma około 1,8 ~ 2,0 mm6,11,13,15). W związku z tym wszczepienie soczewki obiektywnej jest ograniczone do obserwacji powierzchni i stosunkowo dużych obszarów mózgu, takich jak kora6,15 i grzbietowy róg amonisa 1 (CA1) u myszy11,13 . Ponadto duży obszar kory mózgowej musi być odessany, aby celować w grzbietowy CA111,13. Ze względu na ograniczenie konfiguracji z jedną soczewką, która uniemożliwia obrazowanie głębokich obszarów mózgu, komercyjne systemy miniskopowe oferują tylko konstrukcję z kombinacją soczewek obiektywowych i przekaźników (dwusoczewkowych). Z drugiej strony, miniskop V3 UCLA może być zmodyfikowany do systemu jedno- lub dwusoczewkowego, ponieważ jego soczewka obiektywu jest wymienna6,11,13,15. Innymi słowy, użytkownicy miniskopu V3 UCLA mogą korzystać z wymiennej soczewki, wszczepiając ją do mózgu (tworząc system jednosoczewkowy), podczas wykonywania eksperymentów obejmujących powierzchowne obserwacje mózgu (poniżej 2,5 mm głębokości) lub poprzez wstępne zakotwiczenie jej w miniskopie i wszczepienie soczewki przekaźnikowej do mózgu (tworząc system dwóch soczewek), podczas wykonywania eksperymentów obejmujących głębokie obserwacje mózgu. System dwóch soczewek może być również stosowany do powierzchownej obserwacji mózgu, ale badacz musi znać dokładne odległości robocze między soczewką obiektywu a soczewką przekaźnikową. Główną zaletą systemu z jedną soczewką jest to, że istnieje mniejsze prawdopodobieństwo pominięcia odległości roboczych niż w przypadku systemu z dwiema soczewkami, biorąc pod uwagę, że istnieją dwie odległości robocze, które muszą być precyzyjnie wycelowane, aby osiągnąć optymalną jakość obrazowania w systemie dwusoczewkowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Dlatego zalecamy stosowanie systemu jednosoczewkowego do powierzchownych obserwacji mózgu. Jeśli jednak eksperyment wymaga obrazowania w głębokim obszarze mózgu, badacz musi nauczyć się unikać niewspółosiowości dwóch soczewek.
Podstawowy protokół konfiguracji miniskopów z dwoma soczewkami do eksperymentów obejmuje implantację soczewek i baseplate8,10,16,17. Baseplating to przyklejenie płytki bazowej do głowy zwierzęcia, tak aby miniskop mógł być ostatecznie zamontowany na zwierzęciu i nagrywał sygnały fluorescencyjne neuronów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Procedura ta polega na użyciu cementu dentystycznego do przyklejenia płytki bazowej do czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), ale kurczenie się cementu dentystycznego może spowodować niedopuszczalne zmiany odległości między wszczepioną soczewką przekaźnikową a soczewką obiektywu8,17. Jeśli przesunięta odległość między dwoma obiektywami jest zbyt duża, nie można ustawić ostrości na komórkach.
Szczegółowe protokoły eksperymentów z głębokim obrazowaniem wapnia w mózgu przy użyciu miniskopów zostały już opublikowane8,10,16,17. Autorzy tych protokołów korzystali z systemu Inscopix8,10,16 lub innych niestandardowych projektów17 i opisali eksperymentalne procedury selekcji wirusów, chirurgii i mocowania płytki podstawowej. Jednak ich protokoły nie mogą być precyzyjnie stosowane do innych systemów open source, takich jak system V3 UCLA Miniscope, NINscope6 i Finchscope19. Niewspółosiowość dwóch soczewek może wystąpić podczas nagrywania w konfiguracji z dwoma obiektywami za pomocą miniskopu UCLA ze względu na rodzaj cementu dentystycznego, który jest używany do przymocowania płytki bazowej do czaszki8,17 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Obecny protokół jest potrzebny, ponieważ odległość między wszczepioną soczewką przekaźnikową a soczewką obiektywu jest podatna na przesuwanie się z powodu niepożądanego skurczu cementu dentystycznego podczas procedury powlekania podstawy. Podczas powlekania bazowego należy znaleźć optymalną odległość roboczą między wszczepioną soczewką przekaźnika a soczewką obiektywu, regulując odległość między miniskopem a górną częścią soczewki przekaźnika, a następnie przykleić płytkę bazową w tym idealnym miejscu. Po ustawieniu prawidłowej odległości między soczewką obiektywu a wszczepioną soczewką przekaźnikową, można uzyskać pomiary podłużne w rozdzielczości komórkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B; Nagrywanie in vivo). Ponieważ optymalny zakres odległości roboczych soczewki przekaźnikowej jest mały (50 - 350 μm)4,8, nadmierny skurcz cementu podczas utwardzania może utrudnić utrzymanie soczewki obiektywu i wszczepionej soczewki przekaźnikowej w odpowiednim zakresie. Ogólnym celem tego raportu jest opracowanie protokołu mającego na celu zmniejszenie problemów z kurczeniem się8,17, które występują podczas procedury powlekania bazowego, oraz zwiększenie wskaźnika powodzenia miniskopowych zapisów sygnałów fluorescencyjnych w konfiguracji dwusoczewkowej. Udane nagranie miniskopowe definiuje się jako nagranie na żywo zauważalnych względnych zmian we fluorescencji poszczególnych neuronów u swobodnie zachowującego się zwierzęcia. Chociaż różne marki cementu dentystycznego mają różne współczynniki skurczu, badacze mogą wybrać markę, która została wcześniej przetestowana6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22. Jednak nie każda marka jest łatwa do zdobycia w niektórych krajach/regionach ze względu na przepisy importowe dotyczące materiałów medycznych. Dlatego opracowaliśmy metody testowania szybkości skurczu dostępnych cementów dentystycznych i, co ważne, zapewniamy alternatywny protokół, który minimalizuje problem skurczu. Przewagą nad obecnym protokołem powlekania bazowego jest zwiększenie wskaźnika powodzenia obrazowania wapnia za pomocą narzędzi i cementu, które można łatwo uzyskać w laboratoriach. Jako przykład używany jest miniskop UCLA, ale protokół ma również zastosowanie do innych miniskopów. W tym raporcie opisujemy zoptymalizowaną procedurę powlekania podstawowego, a także zalecamy kilka strategii montażu systemu dwóch soczewek miniskopu UCLA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Przedstawiono zarówno przykłady udanej implantacji (n = 3 myszy), jak i przykłady nieudanej implantacji (n = 2 myszy) dla konfiguracji dwusoczewkowej z miniskopem UCLA wraz z omówieniem przyczyn sukcesów i porażek.

<table><tbody><tr><td>Wiertło 0,7 mm</td><td>&nbsp;#19008-07</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej; USA</td><td>na chirurgię</td></tr><tr><td>0.1&ndash; 10 &mu; l końcówki do pipet</td><td>104-Q; QSP</td><td>Fisher Naukowy; Singapur</td><td>do testowania cementu dentystycznego</td></tr><tr><td>20 G IV cathater</td><td>#SR-OX2032CA</td><td>Terumo Corporation; Tokio, Japonia</td><td>do chirurgii</td></tr><tr><td>Igła 27 G</td><td>AGANI, AN*2713R</td><td>Terumo Corporation; Tokio, Japonia</td><td>do operacji</td></tr><tr><td>AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE</td><td>#104487-AAV9; 1,5*10^13</td><td>Preparat wirusowy Addgene; MA, USA</td><td>do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Siarczan</td><td></td> atropiny <td>Astart; Hsinchu, Tajwan</td><td>do chirurgii/poszycia manekina/poszycia podłoża</td></tr><tr><td>Płytka</td><td>bazowa V3</td><td>http://miniscope.org</td><td>do poszycia manekine/podłoża</td></tr><tr><td>BLU TACK</td><td>#30840350</td><td>Bostik; Chelsea, Massachusetts, Stany Zjednoczone</td><td>Klejąca glina wielokrotnego użytku; do chirurgii/poszycia manekine/podłoża</td></tr><tr><td>Bone Rongeur Friedman</td><td>13 cm</td><td>Diener; Tuttlingen, Niemcy</td><td>do powlekania bazowego</td></tr><tr><td>buprenorfiny</td><td></td><td>INDIVIOR; Wielka Brytania</td><td>na chirurgię</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>Zoetis; Exton, PA</td><td>analgezja</td></tr><tr><td>Ceftazydym</td><td></td><td>Tajwan Biotech; Tajwan</td><td>zapobiega infekcji</td></tr><tr><td>Płytka PCB do miniskopu UCLA</td><td>zakupiona na https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq</td><td></td><td>do podłoża</td></tr><tr><td>Zestaw cementu dentystycznego</td><td>Tempron</td><td>GC Corp; Tokio, Japonia</td><td>do testowania cementu dentystycznego</td></tr><tr><td>Zestaw cementu dentystycznego</td><td>Tokuso Curefast</td><td>Tokuyama Dental Corp.; Tokio, Japonia</td><td>do testowania cementu dentystycznego / chirurgii / poszycia manekina / podłoża</td></tr><tr><td>Dual Lab Standard z adapterami myszy i szczurów</td><td>#51673</td><td>Stoelting Co; Illinois, USA</td><td>do zabiegu chirurgicznego/poszycia pozorowanego/podłoża</td></tr><tr><td>maści</td><td></td> Duratear <td>Alcon; Genewa, Szwajcaria</td><td>do chirurgii/poszycia pozoru/podłoża</td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td></td><td>YungShin; Tajwańska</td><td>analgezja</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td>Panion & BF Biotech INC.; Taoyuan, Tajwan</td><td>do chirurgii/poszycia pozorów/powłok bazowych</td></tr><tr><td>Inscopix</td><td>nVista System</td><td>Inscopix; Palo Alto, Kalifornia</td><td>dla porównania z V3 UCLA Miniscope</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td>Pfizer; NY, NY</td><td>do eutanazji</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td></td><td></td><td>zwykła do operacji</td></tr><tr><td>Zaciski Microbulldog</td> <td># 12.102.04</td><td>Dimedo; Tuttlingen, Niemcy</td><td>do implantacji soczewek</td></tr><tr><td>Mikrostrzykawki mikrolitrowe, 2,0 i mikro; L, 25 gauge</td><td>#88400</td><td>Hamilton; Bonaduz, Szwajcaria</td><td>do formowania wtryskowego wirusów</td></tr><tr><td>Kauczuk silikonowy</td><td>ZA22 Thixo</td><td>Zhermack; Badia Polesine, Włochy</td><td>za soczewkę</td></tr> z <tr><td>indeksem gradientu obiektywu (GRIN)</td> do atrapy<td>#64519</td><td>Edmund Optics; NJ, USA</td><td>do powlekania manekine/powlekania bazowego</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>#PM996</td><td>Bemis; Neenah, USA</td><td>dla manekina podstawy</td></tr><tr><td>Przenośne ssanie</td><td>#DF-750</td><td>Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc., Taichung, Tajwan</td><td>do chirurgii</td></tr><tr><td>Relay GRIN lens</td><td>#1050-002177</td><td>Inscopix; Palo Alto, CA, USA</td><td>do poszycia manekina / podstawy</td></tr><tr><td>kotwiące ze stali nierdzewnej</td><td>o średnicy 1,00 mm, długość całkowita 3,00 mm</td><td></td><td>do chirurgii</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>#SL720</td><td>Sage Vison; Nowe Tajpej, Tajwan</td><td>do chirurgii / poszycia pozorów / poszycia bazowego</td></tr><tr><td>Aparat stereotaktyczny</td> <td># 51673</td><td>Stoelting; IL, USA</td><td>do chirurgii / poszycia manekina / podłoża</td></tr><tr><td>Klej utwardzający UV #</td> <td>3321</td><td>Loctite; D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td>do testowania cementu dentystycznego</td></tr><tr><td>V3 UCLA Miniskop</td><td>zakupiony w dniu https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components</td><td></td><td>do zabiegu chirurgicznego/poszycia poszycia maneki/podłoża</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>X1126</td><td>Sigma-Aldrich; St. Louis, MO</td><td>do eutanazji</td></tr><tr><td>Spray z pompką Xylocaine 10%</td><td></td><td>AstraZeneca; S&ouml; dert&auml; lje, Szwecja</td><td>na zabieg chirurgiczny</td></tr></tbody></table>

korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice

Neurobiolodzy używają miniaturowych mikroskopów (miniskopów) do obserwacji aktywności neuronalnej u swobodnie zachowujących się zwierząt. Zespół Miniskopów Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA) zapewnia naukowcom otwarte zasoby do samodzielnego budowania miniskopów. Miniskop V3 UCLA jest jednym z najpopularniejszych obecnie używanych miniskopów typu open source. Pozwala na obrazowanie przejściowych stanów fluorescencji emitowanych przez genetycznie zmodyfikowane neurony przez soczewkę obiektywną wszczepioną w korę powierzchowną (system jednosoczewkowy) lub w głębokich obszarach mózgu poprzez kombinację soczewki przekaźnikowej wszczepionej w głęboki mózg i soczewki obiektywnej, która jest wstępnie zakotwiczona w miniskopie w celu obserwacji przekazywanego obrazu (system dwusoczewkowy). Nawet w optymalnych warunkach (gdy neurony wyrażają wskaźniki fluorescencji, a soczewka przekaźnikowa została prawidłowo wszczepiona), zmiana objętości cementu dentystycznego między płytką bazową a jej przyczepieniem do czaszki po utwardzeniu cementu może spowodować niewspółosiowość ze zmienioną odległością między soczewkami obiektywu i przekaźnika, co skutkuje słabą jakością obrazu. Płytka bazowa to płytka, która pomaga zamontować miniskop na czaszce i ustala odległość roboczą między obiektywem a soczewkami przekaźnikowymi. W ten sposób zmiany objętości cementu dentystycznego wokół płytki podstawy zmieniają odległość między soczewkami. Niniejszy protokół ma na celu zminimalizowanie problemu niewspółosiowości spowodowanego zmianami objętości cementu dentystycznego. Protokół zmniejsza niewspółosiowość poprzez zbudowanie początkowego fundamentu z cementu dentystycznego podczas implantacji soczewki przekaźnikowej. Czas rekonwalescencji po implantacji jest wystarczający, aby fundament z cementu dentystycznego całkowicie utwardził płytę podstawy, dzięki czemu płytkę podstawy można zacementować na tym rusztowaniu przy użyciu jak najmniejszej ilości nowego cementu. W niniejszym artykule opisujemy strategie baseplatingu u myszy, aby umożliwić obrazowanie aktywności neuronalnej za pomocą soczewki obiektywu zakotwiczonej w miniskopie.

Ocena zmiany objętości cementu dentystycznego 
Ponieważ objętość cementu dentystycznego zmienia się podczas procesu utwardzania, może to znacząco wpłynąć na jakość obrazowania, biorąc pod uwagę, że odległość robocza soczewki GRIN wynosi około 50 do 350 µm4,8. W związku z tym w niniejszym przypadku, przed procedurą implantacji i montażu płytki bazowej, przetestowano dwa dostępne komercyjnie cementy dentystyczne: Tempron oraz Tokuso (<strong cla...

Kurczenie się cementu dentystycznego podczas utwardzania powoduje przemieszczenie płyty podstawy. Protokół ten minimalizuje problem poprzez stworzenie początkowego fundamentu z cementu dentystycznego, który pozostawia miejsce na zacementowanie płyty podstawy. Kilka tygodni później płyta podstawy może zostać zacementowana na rusztowaniu przy użyciu niewielkiej ilości nowego cementu, zmniejszając w ten sposób skurcz.

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Neuroscientists use miniature microscopes (miniscopes) to observe neuronal activity in freely behaving animals. The University of California, Los Angeles ...

Ten miniskop może zmniejszyć problem kurczenia się cementu dentystycznego podczas zabiegu płytki bazowej i zwiększyć wskaźnik powodzenia zapisów sygnałów fluorescencyjnych w miniskopie w konfiguracji o dwóch długościach. Jeśli nie można zaobserwować przejściowego stanu fluorescencji podczas posiewu podstawowego, sprawdź ekspresję wskaźnika wapnia i położenie soczewki przekaźnikowej na wycinku mózgu. Zacznij od zamontowania wewnętrznej igły cewnika dożylnego o rozmiarze 20 i średnicy jednego milimetra na ramieniu stereotaktycznym.Opuść cewnik do brzusznego amonisa kukurydzianego 1 do obszaru docelowego. Następnie opuść igłę do mikroiniekcji z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę do brzusznego rogówki 1 i wprowadź 200 nanolitrów wektora wirusowego do obszaru docelowego z prędkością 25 nanolitrów na minutę. Po pozostawieniu wirusa do dyfuzji przez 10 minut, należy wycofać igłę do mikroiniekcji z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę.Po zdezynfekowaniu soczewki przekaźnikowej należy namoczyć soczewkę w zimnym, wolnym od pirogenów roztworze fizjologicznym do czasu implantacji. Używając zacisku micro bulldog z rurką termokurczliwą, przytrzymaj soczewkę przekaźnika i umieść ją na obszarze docelowym z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę. Następnie ustabilizuj soczewkę za pomocą cementu dentystycznego.Aby ustawić miniskop, przymocuj soczewkę obiektywu na spodzie i zamontuj płytę podstawy na miniskopie. Owiń 10 centymetrów folii parafinowej wokół zewnętrznej strony płytki podstawy. Używając glinki klejącej wielokrotnego użytku, przytrzymaj miniskop z sondą ramienia stereotaktycznego.Ustaw soczewkę obiektywu na górze soczewki przekaźnika, pozostawiając jak najmniej miejsca między soczewkami. Użyj cementu dentystycznego, aby zabezpieczyć położenie płyty podstawy, tak aby cement dotykał tylko filmu parafinowego. Gdy cement dentystyczny wyschnie, usuń folię parafinową, płytę podstawy i miniskop, utrzymując pustą podstawę cementu dentystycznego.Uszczelnij soczewkę przekaźnika gumą silikonową do formowania i przykryj gumę silikonową cienką warstwą cementu dentystycznego. Odłącz mysz od instrumentów stereotaktycznych i umieść ją w komorze odzyskiwania. W przypadku podłoża należy ostrożnie przeciąć cienką warstwę dachu z cementu dentystycznego za pomocą kostnego rongeura i usunąć gumę silikonową.Oczyść powierzchnię soczewki przekaźnika 75% alkoholem. Dokręć ustalającą obok płyty podstawy, aby przymocować ją do dolnej części miniskopu. Ustaw suwak ostrości tak, aby znajdował się w odległości około 2.7 do 3 milimetrów od głównej obudowy.Po zakończeniu ustawiania podłącz miniskop do karty akwizycji danych i podłącz miniskop do portu USB 3.0 w komputerze. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych opracowane przez zespół UCLA. Dostosuj ekspozycję na 255, wzmocnienie na 64x, a diodę wzbudzenia na 5%Aby połączyć miniskop z oprogramowaniem do akwizycji danych, kliknij przycisk połączenia i oglądaj transmisję na żywo z oprogramowania do akwizycji danych, biorąc pod uwagę margines soczewki przekaźnika jako punkt orientacyjny.Po znalezieniu soczewki przekaźnika ręcznie dopasuj soczewkę obiektywu miniskopu do soczewki przekaźnika. Dostosowując różne kąty i odległości miniskopu, rozpocznij wyszukiwanie sygnałów fluorescencyjnych. Trzymając miniskop w optymalnej pozycji, przesuń ramię stereotaktyczne w kierunku mini lunety i przyklej miniskop do ramienia stereotaktycznego za pomocą klejącej gliny wielokrotnego użytku.Wyszukaj najlepszy widok, nieznacznie regulując ramiona X, Y i Z. Wyreguluj kąt między powierzchnią soczewki obiektywu a soczewką przekaźnika, obracając listwę douszną, listwę zębatą lub klej wielokrotnego użytku na osi Z. Ekspresja wirusa i implantacja soczewki są skuteczne, gdy co najmniej jedna komórka przemieściła przejściowe stany fluorescencji podczas powlekania podstawowego.Mocno przymocuj płytkę podstawy za pomocą najmniejszej możliwej ilości cementu dentystycznego, jednocześnie monitorując obszar zainteresowania, aby upewnić się, że optymalna pozycja się nie zmienia. W reprezentatywnym badaniu procedura posiewu pozorowanego okazała się korzystna, ponieważ skutkowała mniejszym przesunięciem położenia płytki bazowej niż pierwotna procedura. Na przesunięcie płyty bazowej miała również wpływ wysokość cementu dentystycznego.Płytka podstawowa, która była zakotwiczona 0,5 centymetra nad czaszką, przesunęła się znacznie mniej niż płytka podstawowa, która była zamocowana jeden centymetr nad czaszką. W przykładzie udanego obrazowania podczas procedury posiewu podstawowego u znieczulonego zwierzęcia zaobserwowano przejściowe stany fluorescencji wraz z naczyniami krwionośnymi. Przejściowe stany przejściowe fluorescencji obserwowano pięć dni po zasadzeniu, nawet gdy mysz zachowywała się swobodnie w swojej klatce domowej z niewielkim tylko przesunięciem pozycji.Następnie przeprowadzono obrazowanie wapnia u myszy. W kilku przypadkach wystąpiły problemy podczas procedury powlekania bazowego, takie jak brak czegokolwiek poza jednolitym tłem lub widocznością marginesów białych krwinek. bez stanów przejściowych fluorescencji.Ważne jest, aby mocno przymocować płytkę bazową do obszaru docelowego za pomocą jak najmniejszej ilości cementu dentystycznego. Dzięki technice łupkowej naukowcy mogą obserwować podłużnie aktywność neuronalną w tym obszarze. Przy odpowiedniej licencji procedura ta może mieć również zastosowanie do obserwacji sieci neuronowej w polu widzenia.

using-baseplating-miniscope-preanchored-with-an-objective-lens-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Ten protokół bada zależność między mózgiem a zachowaniem w hipokampie CA1 u myszy poruszających się po smugach zapachu. Zapewniamy protokół krok po kroku, w tym operację w celu uzyskania dostępu do obrazowania hipokampa, trening behawioralny, rejestrację i przetwarzanie mózgu w miniskopie GCaMP6f oraz dane behawioralne w celu dekodowania pozycji myszy na podstawie aktywności neuronalnej ROI.

Miniskop rejestrujący sygnały wapnia w hipokampie myszy poruszających się po pióropuszu zapachowym

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj metodę bazowania miniskopu z wykorzystaniem wstępnie utwardzonego cementu stomatologicznego, która zmniejsza problem kurczenia się cementu i poprawia jakość obrazowania wapnia w mózgu myszy.

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Przeglądaj więcej filmów