Korzystanie z poszycia bazowego i miniskopu wstępnie zakotwiczonego z soczewką obiektywową do badań nad stanami przejściowymi wapnia u myszy

Ten miniskop może zmniejszyć problem kurczenia się cementu dentystycznego podczas zabiegu płytki bazowej i zwiększyć wskaźnik powodzenia zapisów sygnałów fluorescencyjnych w miniskopie w konfiguracji o dwóch długościach. Jeśli nie można zaobserwować przejściowego stanu fluorescencji podczas posiewu podstawowego, sprawdź ekspresję wskaźnika wapnia i położenie soczewki przekaźnikowej na wycinku mózgu. Zacznij od zamontowania wewnętrznej igły cewnika dożylnego o rozmiarze 20 i średnicy jednego milimetra na ramieniu stereotaktycznym.

Opuść cewnik do brzusznego amonisa kukurydzianego 1 do obszaru docelowego. Następnie opuść igłę do mikroiniekcji z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę do brzusznego rogówki 1 i wprowadź 200 nanolitrów wektora wirusowego do obszaru docelowego z prędkością 25 nanolitrów na minutę. Po pozostawieniu wirusa do dyfuzji przez 10 minut, należy wycofać igłę do mikroiniekcji z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę.

Po zdezynfekowaniu soczewki przekaźnikowej należy namoczyć soczewkę w zimnym, wolnym od pirogenów roztworze fizjologicznym do czasu implantacji. Używając zacisku micro bulldog z rurką termokurczliwą, przytrzymaj soczewkę przekaźnika i umieść ją na obszarze docelowym z prędkością od 100 do 200 mikrometrów na minutę. Następnie ustabilizuj soczewkę za pomocą cementu dentystycznego.

Aby ustawić miniskop, przymocuj soczewkę obiektywu na spodzie i zamontuj płytę podstawy na miniskopie. Owiń 10 centymetrów folii parafinowej wokół zewnętrznej strony płytki podstawy. Używając glinki klejącej wielokrotnego użytku, przytrzymaj miniskop z sondą ramienia stereotaktycznego.

Ustaw soczewkę obiektywu na górze soczewki przekaźnika, pozostawiając jak najmniej miejsca między soczewkami. Użyj cementu dentystycznego, aby zabezpieczyć położenie płyty podstawy, tak aby cement dotykał tylko filmu parafinowego. Gdy cement dentystyczny wyschnie, usuń folię parafinową, płytę podstawy i miniskop, utrzymując pustą podstawę cementu dentystycznego.

Uszczelnij soczewkę przekaźnika gumą silikonową do formowania i przykryj gumę silikonową cienką warstwą cementu dentystycznego. Odłącz mysz od instrumentów stereotaktycznych i umieść ją w komorze odzyskiwania. W przypadku podłoża należy ostrożnie przeciąć cienką warstwę dachu z cementu dentystycznego za pomocą kostnego rongeura i usunąć gumę silikonową.

Oczyść powierzchnię soczewki przekaźnika 75% alkoholem. Dokręć ustalającą obok płyty podstawy, aby przymocować ją do dolnej części miniskopu. Ustaw suwak ostrości tak, aby znajdował się w odległości około 2.7 do 3 milimetrów od głównej obudowy.

Po zakończeniu ustawiania podłącz miniskop do karty akwizycji danych i podłącz miniskop do portu USB 3.0 w komputerze. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych opracowane przez zespół UCLA. Dostosuj ekspozycję na 255, wzmocnienie na 64x, a diodę wzbudzenia na 5%Aby połączyć miniskop z oprogramowaniem do akwizycji danych, kliknij przycisk połączenia i oglądaj transmisję na żywo z oprogramowania do akwizycji danych, biorąc pod uwagę margines soczewki przekaźnika jako punkt orientacyjny.

Po znalezieniu soczewki przekaźnika ręcznie dopasuj soczewkę obiektywu miniskopu do soczewki przekaźnika. Dostosowując różne kąty i odległości miniskopu, rozpocznij wyszukiwanie sygnałów fluorescencyjnych. Trzymając miniskop w optymalnej pozycji, przesuń ramię stereotaktyczne w kierunku mini lunety i przyklej miniskop do ramienia stereotaktycznego za pomocą klejącej gliny wielokrotnego użytku.

Wyszukaj najlepszy widok, nieznacznie regulując ramiona X, Y i Z. Wyreguluj kąt między powierzchnią soczewki obiektywu a soczewką przekaźnika, obracając listwę douszną, listwę zębatą lub klej wielokrotnego użytku na osi Z. Ekspresja wirusa i implantacja soczewki są skuteczne, gdy co najmniej jedna komórka przemieściła przejściowe stany fluorescencji podczas powlekania podstawowego.

Mocno przymocuj płytkę podstawy za pomocą najmniejszej możliwej ilości cementu dentystycznego, jednocześnie monitorując obszar zainteresowania, aby upewnić się, że optymalna pozycja się nie zmienia. W reprezentatywnym badaniu procedura posiewu pozorowanego okazała się korzystna, ponieważ skutkowała mniejszym przesunięciem położenia płytki bazowej niż pierwotna procedura. Na przesunięcie płyty bazowej miała również wpływ wysokość cementu dentystycznego.

Płytka podstawowa, która była zakotwiczona 0,5 centymetra nad czaszką, przesunęła się znacznie mniej niż płytka podstawowa, która była zamocowana jeden centymetr nad czaszką. W przykładzie udanego obrazowania podczas procedury posiewu podstawowego u znieczulonego zwierzęcia zaobserwowano przejściowe stany fluorescencji wraz z naczyniami krwionośnymi. Przejściowe stany przejściowe fluorescencji obserwowano pięć dni po zasadzeniu, nawet gdy mysz zachowywała się swobodnie w swojej klatce domowej z niewielkim tylko przesunięciem pozycji.

Następnie przeprowadzono obrazowanie wapnia u myszy. W kilku przypadkach wystąpiły problemy podczas procedury powlekania bazowego, takie jak brak czegokolwiek poza jednolitym tłem lub widocznością marginesów białych krwinek. bez stanów przejściowych fluorescencji.

Ważne jest, aby mocno przymocować płytkę bazową do obszaru docelowego za pomocą jak najmniejszej ilości cementu dentystycznego. Dzięki technice łupkowej naukowcy mogą obserwować podłużnie aktywność neuronalną w tym obszarze. Przy odpowiedniej licencji procedura ta może mieć również zastosowanie do obserwacji sieci neuronowej w polu widzenia.