Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości. Ten film zademonstruje protokół skutecznego i bezpiecznego preparowania mięśni EDL i płaszczkowatych przy użyciu powtarzalnego podejścia. Ten film nauczy również, jak uzyskać całe połączenia nerwowo-mięśniowe w celu rozpoznania komponentów synaptycznych z integralnością 3D, aby umożliwić dokładną analizę morfometryczną.

Do wypreparowania mięśni potrzebne są te narzędzia chirurgiczne. Aby rozpocząć zabieg, ułóż zwierzę brzuchem skierowanym do góry. Wykonaj wstępne nacięcie za pomocą ostrza chirurgicznego między palcami u nóg w kierunku kończyn tylnych.

Zdejmij skórę, ciągnąc w górę, aż prawe kolano zostanie odsłonięte. Aby znaleźć EDL, podążaj za ścięgnami stopy do więzadła pierścieniowego. To więzadło okrąża dwa ścięgna.

Przetnij więzadło nożyczkami Uniband między dwoma ścięgnami. Zidentyfikuj ścięgno EDL, podnosząc oba i sprawdzając, które z nich sprawia, że palce u nóg poruszają się w górę. Przetnij ścięgno nożyczkami.

Trzymając ścięgno pęsetą biologiczną, zacznij powoli oddzielać mięsień EDL od innych mięśni kończyn tylnych. Oddzielenie mięśnia bez powodowania uszkodzeń można wykonać, wykonując różne nacięcia na pozostałych mięśniach bocznych, aby otworzyć drogę między nimi, jednocześnie przytrzymując i podnosząc mięsień z rozszczepiającej się części ścięgna EDL. Aby całkowicie odizolować mięsień, przetnij ścięgno przymocowane do kolana szczura za pomocą nożyczek Uniband.

Zanurz wycięty mięsień w roztworze utrwalającym i pozostaw na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest mieć wydłużony mięsień. Aby to zrobić, użyj kartonu i zszywek, aby przymocować mięsień do utrwalenia.

Aby wyizolować mięsień płaszczkowaty, odwróć zwierzę. Przez skórę przetnij ścięgno piętowe za pomocą ostrza chirurgicznego. Za pomocą pęsety biologicznej i nożyczek Uniband oddziel mięsień brzuchaty łydki od kości, tworząc muskularną pokrywę.

Płaszczkowaty będzie znajdował się po wewnętrznej stronie muskularnej powieki. Można go zidentyfikować, ponieważ jest czerwony i płaski. Za pomocą pęsety biologicznej sięgnij i unieś ścięgno płaszczkowate, które leży nad mięśniem brzuchatym łydki.

Przetnij ścięgno nożyczkami Uniband. Podnieś cały mięsień, jednocześnie przecinając niektóre słabe punkty przyczepu. Na koniec, aby całkowicie uwolnić mięsień płaszczkowaty, przetnij pęcherzyk płaszczkowaty, który tworzy ścięgno piętowe.

Powtórz krok fiksacji, tak jak w przypadku mięśnia EDL. Aby skorzystać z tej metody, ważne jest, aby przymocować zszywki do ścięgien, a nie do mięśnia. Po upływie 24-godzinnego okresu utrwalania należy przepłukać mięśnie roztworem DPBS przed rozpoczęciem izolowania włókien mięśniowych.

Aby wyizolować włókna, delikatnie przytrzymaj jedno ze ścięgien jedną parą pęsety biologicznej. Następnie za pomocą drugiej pary pęsety biologicznej zacznij powoli ściskać ścięgno, aby oddzielić włókna mięśniowe. Aby wyizolować włókna, powoli pociągnij w górę w kierunku przeciwległego ścięgna mięśniowego.

Konieczne będzie powtórzenie tej czynności kilka razy, aż do uzyskania wielu, małych, izolowanych wiązek. Po rozdzieleniu na małe, odizolowane wiązki, umieść je ostrożnie w wstępnie przygotowanym silanizowanym szkiełku. Konieczne jest utrzymanie porządku we wszystkich włóknach, aby nie zachodziły na siebie.

W tym momencie włókna można pozostawić do wyschnięcia na powietrzu na 24 godziny. Po 24 godzinach rozpocznij barwienie immunologiczne. Aby stworzyć wodoodporną barierę, użyj pisaka PAP, aby otoczyć izolowane włókna mięśniowe we wstępnie przygotowanym szkiełku.

Jest to przykład obrazu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, który można uzyskać zgodnie z opisanym tutaj protokołem. W lewym górnym rogu pokazany jest element postsynaptyczny, a w prawym górnym element presynaptyczny, podczas gdy dolne obrazy pokazują komponenty synaptyczne schematyzowane w celu zilustrowania parametrów, które zostaną wykorzystane do analizy morfometrycznej. Drugi slajd pokazuje łączenie się sygnałów pre- i postsynaptycznych z barwieniem jąder API.

Różnice między połączeniami nerwowo-mięśniowymi zwierząt transgenicznych i nietransgenicznych są wyraźnie widoczne. Analiza morfometryczna połączeń nerwowo-mięśniowych wykazuje dowody na sygnał postsynaptyczny u zwierząt transgenicznych i wydaje się być bardziej zwarta, głównie ze względu na zmniejszoną całkowitą powierzchnię połączenia nerwowo-mięśniowego. Jak pokazano tutaj, obszar presynaptyczny połączenia nerwowo-mięśniowego zwierzęcia transgenicznego jest zmniejszony.

Najmniejszą wykrytą instytucją był ten, który stwierdzono z antyfosforylowanym sygnałem neurofilamentu, jak pokazano na przykład na obrazie B. Ostatni obraz przedstawia wyniki dotyczące stanu połączeń nerwowo-mięśniowych w całości zamontowanych. Za pomocą wskaźnika pokrycia ustalono, że transgeniczne połączenia nerwowo-mięśniowe są częściowo odnerwione.

Może również określić, że zasięg i nexus ufosforylowanego neurofilamentu jest niższy niż uzyskany po wykryciu neurofilamentu nieufosforylowanego. Proponowany protokół pozwala na uzyskanie wysokiej jakości preparatów połączeń nerwowo-mięśniowych z wolnych i szybkich włókien mięśniowych. Składniki przed- i postsynaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego zidentyfikowano za pomocą specyficznych sond lub przeciwciał, a następnie zobrazowano w mikroskopii konfokalnej lub konfokalnej o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając analizę morfometryczną w skali mikrometrycznej.