Name: Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Naucz się rozwarstwiania pojedynczych włókien mięśni szkieletowych szczura do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych. Ta metoda umożliwia wykrywanie subtelnych zmian patologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wielkie podziękowania dla CSIC i PEDECIBA za wsparcie finansowe udzielone tej pracy; dla Natalii Rosano za jej poprawki w rękopisie; dla Marcelo Casacuberta, który stworzył film i dla Nicolása Bolatto za użyczenie swojego głosu.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Ustawy Narodowej nr 18611 o opiece nad zwierzętami wykorzystywanymi do celów doświadczalnych. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Etyczną (CEUA IIBCE, Protokół nr 004/09/2015).
1. Rozwarstwienie mięśni (Dzień 1)
UWAGA: Zanim zaczniesz, przygotuj 40 ml 0,5% paraformaldehydu (PFA), pH 7,4 w soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Opcjonalnie przygotuj 20 ml 4% PFA. Przygotować 5 ml porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C. W dniu rozbioru rozmrozić 4% podwielokrotność i dodać 35 ml DPBS, aby uzyskać 40 ml 0,5% PFA.
<ol>
	<li>Izolacja EDL (mięsień szybkokurczliwy)
	<ol>
		<li>Poddaj szczura eutanazji. Ułóż zwierzę z brzuchem skierowanym do góry. Wykonaj wstępne nacięcie za pomocą ostrza chirurgicznego między palcami u nóg w kierunku kończyny tylnej. 
		UWAGA: W tym przypadku podano dootrzewnowe wstrzyknięcie 90:10 mg/kg ketaminy:ksylazyny w celu eutanazji szczura, ale dozwolone są również inne opcje znieczulenia.</li>
		<li>Zdejmij skórę, ciągnąc ją do góry, aż kolano szczura zostanie odsłonięte.</li>
		<li>Aby znaleźć EDL, podążaj za ścięgnami stopy aż do więzadła pierścieniowego. To więzadło okrąża dwa ścięgna. Przetnij więzadło między dwoma ścięgnami za pomocą nożyczek jednopasmowych (lub podobnych). Zidentyfikuj ścięgno EDL, unosząc oba i wybierz ten, który sprawia, że palce u nóg poruszają się w górę.</li>
		<li>Przetnij ścięgno nożyczkami uniband. Następnie, trzymając ścięgno delikatną pęsetą biologiczną, zacznij powoli oddzielać mięsień EDL od mięśnia piszczelowego przedniego, strzałkowego brevis i mięśnia strzałkowego długiego class<="xref">40 (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Upewnij się, że mięsień jest oddzielony bez żadnych uszkodzeń. Zrób to, przecinając resztę mięśni bocznych, aby otworzyć drogę między nimi (EDL nie ma powierzchownej lokalizacji), jednocześnie trzymając i podnosząc mięsień EDL.</li>
		<li>Aby całkowicie odizolować mięsień, przetnij ścięgno przyczepione do kolana szczura za pomocą nożyczek uniband.</li>
		<li>Zanurzyć wypreparowany mięsień w 5 ml 0,5% PFA i pozostawić na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Opcjonalnie zszyć mięsień w kawałku tektury i obrócić go mięśniem skierowanym w dół. Następnie zanurz go całkowicie w 8 ml roztworu utrwalającego. Ten krok pomaga w utrzymaniu wydłużonego mięśnia podczas procesu utrwalania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mięśnia płaszczkowatego (mięsień wolnokurczliwy)
	<ol>
		<li>Odwróć zwierzę (brzuch jest teraz skierowany w dół). Przez skórę przetnij ścięgno piętowe za pomocą ostrza chirurgicznego.</li>
		<li>Za pomocą pęsety biologicznej i nożyczek uniband oddziel mięsień brzuchaty łydki od kości, tworząc "muskularną pokrywę". Płaszczkowaty będzie znajdował się po wewnętrznej stronie muskularnej powieki. Można go zidentyfikować, ponieważ ma czerwony kolor i płaską morfologię.</li>
		<li>Za pomocą pęsety biologicznej dosięgnij i unieś ścięgno płaszczkowate, które leży nad mięśniem brzuchatym łydki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Przetnij ścięgno nożyczkami uniband. Podnieś cały mięsień, jednocześnie przecinając niektóre słabe punkty przyczepu (tj. elementy nerwowo-naczyniowe). Na koniec, aby całkowicie uwolnić mięsień płaszczkowaty, przetnij pęczek płaszczkowaty, który tworzy ścięgno piętowe, za pomocą nożyczek uniband.</li>
		<li>Powtórz krok 1.1.6, aby naprawić wycięty mięsień płaszczkowaty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie drażnionego błonnika (Dzień 2)
<ol>
	<li>Po 24 godzinach utrwalenia przepłukać mięśnie 6 ml roztworu DPBS 3x po 10 minut przed wyizolowaniem włókien mięśniowych.</li>
	<li>Aby wyizolować włókna, umieść mięsień na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego delikatnie przytrzymaj jedno ze ścięgien jedną parą pęsety biologicznej. Następnie, za pomocą innej pęsety biologicznej, zacznij powoli szczypać ścięgno, aby oddzielić włókna mięśniowe. Następnie powoli pociągnij uszczypniętą tkankę w górę w kierunku przeciwległego ścięgna mięśniowego. Konieczne będzie powtórzenie tej czynności kilka razy, aż do uzyskania wielu małych, izolowanych wiązek.</li>
	<li>Umieść je ostrożnie na wstępnie przygotowanym szkiełku (silanizowanym). Konieczne jest utrzymanie wszystkich włókien w porządku, aby nie zachodziły na siebie. W tym momencie susz włókna na powietrzu przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych (dzień 3) 
	UWAGA: Wszystkie kroki zostały wykonane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Najskuteczniejszym sposobem usunięcia różnych roztworów bez odrywania włókien od szkiełka jest użycie strzykawki insulinowej.
	<ol>
		<li>Aby rozpocząć proces barwienia immunologicznego, należy otoczyć wysuszone izolowane włókna mięśniowe pisakiem, aby stworzyć wodoodporną barierę.</li>
		<li>Aby nawodnić włókna mięśniowe, dodaj 200 μl wody destylowanej przez 5 minut, a następnie zmień wodę na 200 μl DPBS na kolejne 5 minut inkubacji. W tym momencie rozpocznij znakowanie immunofluorescencyjne.</li>
		<li>Inkubować włókna z 300 μl buforu blokującego (BB) zawierającego 50 mM glicyny, 1% BSA i 1% Triton X-100 przez 30 minut.</li>
		<li>Zastąp BB przeciwciałem pierwszorzędowym w stężeniu sugerowanym przez producentów. Użyj kulki, aby rozcieńczyć przeciwciało. W tym eksperymencie użyto 400 μl SMI 32 lub SMI 31, które rozpoznawały niefosforylowany (Nf) lub fosforylowany (Phos-Nf) neurofilament H w rozcieńczeniu 1/800 w celu wykrycia składnika presynaptycznego NMJ. 
		UWAGA: Decydując się na rozpoznanie całego elementu presynaptycznego zamiast oceny fosforylacji neurofilamentów, wybierz przeciwciała przeciwko synapsynie, synaptofizynie lub SV2a, które były wcześniej z powodzeniem stosowane.</li>
		<li>Inkubować włókna z pierwotnym rozcieńczeniem przeciwciała w temperaturze 4 °C przez noc (opcjonalnie inkubację można przeprowadzić w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę). W obu przypadkach ważne będzie wykonanie inkubacji w wilgotnej komorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunofluorescencja: Drugorzędowa inkubacja przeciwciał (dzień 4)
	<ol>
		<li>Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przepłucz włókna 3x po 10 minut 500 μL DPBS i ostatni raz BB.</li>
		<li>Usuń to ostatnie płukanie i dodaj znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w BB. W tym eksperymencie użyto 500 μl koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu 1/1000 w BB. Aby wyświetlić element postsynaptyczny NMJ, do drugorzędowego rozcieńczenia przeciwciała dodano koniugat biotyny 1:300 ><α-bungarotoksyny (Btx) biotyny-XX.
		UWAGA: Dodatek Btx-biotyny XX pozwala na uzyskanie lepszych obrazów stosunku sygnału do szumu po wykryciu za pomocą streptawidyny, która wzmacnia sygnał. Ponadto koniugacja streptawidyny z różnymi fluoroforami zwiększyła kombinacje kolorów w testach wspólnego znakowania. Alternatywnie, znakowane fluorescencyjnie Btx pozwala na uzyskanie obrazów o podobnej jakości.</li>
		<li>Inkubować przeciwciało drugorzędowe i Btx przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub 1 godzinę w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Usunąć przeciwciało drugorzędowe i Btx. Przemyć 3x po 10 minut 500 μL DPBS i ostatnie płukanie BB.</li>
		<li>Inkubować z 500 μl streptawidyny Alexa Fluor 555 w rozcieńczeniu 1:1000 z BB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W tym momencie, jeśli jest to pożądane, dodaj sondę, aby przeciwdziałać barwieniu jąder, taką jak diaminofenylindol o końcowym stężeniu 1 μg/ml.</li>
		<li>Usunąć roztwór inkubacyjny i przemyć włókna 3x po 10 minut 500 μl DPBS. Następnie zamontuj włókna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Umieść 4 kropki przezroczystego lakieru do paznokci na szkiełku mikroskopowym tak, jakby były wierzchołkami kwadratu. Pozostaw do wyschnięcia na 1-2 minuty. Będą to punkty, w których szkiełka nakrywkowe będą spoczywać, co pomoże uniknąć zgniecenia tkanki.</li>
		<li>Usuń ostatnie pranie DPBS i dodaj wystarczającą ilość materiału montażowego (~ 200 μL), aby pokryć włókna; unikać suszenia. 
		UWAGA: Aby przygotować 10 ml mieszanki pożywek montażowych, użyj Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol w proporcji 4:1 (v:v).</li>
		<li>Użyj końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby ostrożnie rozprowadzić materiał montażowy na włóknach, aby zapewnić całkowite zanurzenie ich wszystkich. Przed umieszczeniem szkła nakrywkowego usuń pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe na próbkach, starając się zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Ten ruch można wykonać za pomocą kleszczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia i analiza morfometryczna
<ol>
	<li>Zobrazuj drażnione preparaty włókien za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej.</li>
	<li>Wykonaj serię odcinków optycznych (stosy Z 30 μm) w całej synapsie w odstępie jednego mikrometra. Aby ustawić stos, użyj sygnału Btx. Wyobraź sobie co najmniej 15-20 NMJ dla każdego stanu mięśni w rozdzielczości 2048 x 2048 px. Metoda ta została wybrana w celu uzyskania obrazów o wystarczającej jakości optycznej i rozdzielczości do analizy morfometrycznej.</li>
	<li>Aby wykonać pomiary, użyj obrazów projekcyjnych stosów z dowolnym oprogramowaniem analitycznym. 
	UWAGA: Chociaż wyjaśniona analiza morfometryczna została przeprowadzona ręcznie, istnieją dwa niedawno opracowane narzędzia oparte na obrazie J do badania wielu różnych aspektów pre i postsynaptycznej morfologii NMJ33,34.</li>
	<li>Aby uzyskać wartości całkowitego obszaru NMJ, wybierz zewnętrzną krawędź (zewnętrzny kontur zabarwionego obszaru, patrz Rysunek 2) płyty końcowej za pomocą narzędzia Photoshop Magnetic lasso i określ liczbę wybranych pikseli w oknie Histogramu. Następnie obszary pikseli można przekonwertować na mikrometry kwadratowe przy użyciu skali określonej przez oprogramowanie konfokalne.</li>
	<li>Za pomocą tego samego narzędzia lasso wybierz wewnętrzną krawędź (kontury poplamionego obszaru w obrębie płyty końcowej, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2) i określ niepoplamiony obszar w całej strukturze (lub pusty obszar), jak opisano powyżej (krok 4.4.). Wartości obszaru postsynaptycznego zostaną uzyskane po odjęciu całkowitej powierzchni od pustego obszaru każdego NMJ.</li>
	<li>Uzyskaj obszar presynaptyczny, który definiuje się jako obszar z immunofluorescencją anty-neurofilamentową, w podobny sposób, jak całkowity obszar NMJ. 
	UWAGA: Wszystkie te parametry wykorzystano do określenia wskaźnika gęstości postsynaptycznej (obszar postsynaptyczny/obszar całkowity) oraz pokrycia NMJ (obszar presynaptyczny/obszar postsynaptyczny). Wyższy wskaźnik gęstości postsynaptycznej oznacza gęstszą - lub bardziej zwartą - płytkę końcową, podczas gdy mniejsze pokrycie NMJ odzwierciedla znacznie gorszą interakcję między zakończeniem nerwowym a płytką końcową (obie zgodne z procesem denerwacji). W przedstawionym przypadku, ponieważ uodpornione i nieufosforylowane formy neurofilamentów wykryto na poziomie zakończeń nerwowych, obliczono stosunek fosforylowanych/niefosforylowanych sygnałów presynaptycznych oraz stosunek pokrycia fosforylowanego/niefosforylowanego.</li>
</ol>

<ol><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+efficacy+and+synaptic+depression+by+glial+cells+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 21, 847-855 (1998).</li>
<li>Cappello, V., Francolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+Dismantling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).</li>
<li>Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+decreased+activity+elicits+specific+morphological+adaptations+of+the+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).</li>
<li>Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitual+exercise+enhances+neuromuscular+transmission+efficacy+of+rat+soleus+muscle+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ.</a> Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).</li>
<li>Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+influences+adaptations+of+the+neuromuscular+junction+to+endurance+training%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training.</a> Neuroscience. 190, 56-66 (2011).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Arnold, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+remodeling+of+the+neuromuscular+junction+by+skeletal+muscle+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α.</a> Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).</li>
<li>Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+presynaptic+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+repeatedly+observed+in+living+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice.</a> Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).</li>
<li>Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+early+morphological+changes+at+denervated+and+paralyzed+endplates+in+fast+and+slow+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse.</a> Brain Research. 248, 382-386 (1982).</li>
<li>Rosenheimer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+stress+and+exercise+on+age+related+changes+in+end-plates+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture.</a> Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+endurance+exercise+on+the+morphology+of+mouse+neuromuscular+junctions+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing.</a> Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).</li>
<li>Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+terminal+morphologic+plasticity+induced+by+small+changes+in+the+locomotor+activity+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat.</a> Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).</li>
<li>Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exercise+training+of+different+intensities+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology.</a> Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).</li>
<li>Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exercise+in+maintaining+the+integrity+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+alters+the+morphology+of+fast-+and+slow-twitch+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction.</a> International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).</li>
<li>Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+modulates+neuromuscular+junction+of+C57BL%5C6N+in+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice.</a> Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).</li>
<li>Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+physical+training+on+morphology+of+motor+nerve+terminals+in+rat+extensor+digitorum+longus+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles.</a> Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).</li>
<li>Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+training+increases+acetylcholine+receptor+quantity+at+neuromuscular+junctions+of+adult+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle.</a> Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).</li>
<li>Deschenes, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+resistance+training+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology.</a> Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).</li>
<li>Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+as+an+Entity+of+Nerve-Muscle+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication.</a> Cells. 8 (8), 906-921 (2019).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis-A+model+of+corticofugal+axonal+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread.</a> Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+Evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man.</a> Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).</li>
<li>Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type+classifications%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type classifications.</a> Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+variability+is+greater+at+developing+than+mature+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions.</a> Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Waerhaug, O., Lømo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+causing+different+properties+at+neuromuscular+junctions+in+fast+and+slow+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles.</a> Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+postsynaptic+folds+to+the+safety+factor+for+neuromuscular+transmission+in+rat+fast-+and+slow-twitch+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles.</a> Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-Analyser%3A+high-throughput+morphological+screening+of+neuromuscular+junctions+identifies+subtle+changes+in+mouse+neuromuscular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levator+auris+longus+preparation+for+examination+of+mammalian+neuromuscular+transmission+under+voltage+clamp+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57482(2018).</li>
<li>Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+adult+mouse+muscle-nerve+preparation+for+studying+the+firing+properties+of+muscle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51948(2014).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4460(2013).</li>
<li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51162(2014).</li>
<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non-phosphorylated+neurofilaments%3A+cross-species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+and+development+of+compartmentalized+innervation+in+rat+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle.</a> Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).</li>
<li>Cipriani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+a+mouse+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+4C%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072(2018).</li>
<li>Boido, M., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junctions+as+key+contributors+and+therapeutic+targets+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół preparacji dwóch mięśni szkieletowych szczura (jednego wolnokurczliwego, a drugiego szybkokurczliwego), izolacji mięśni włóknistych oraz immunofluorescencyjnego wykrywania markerów pre i postsynaptycznych w celu ilościowej oceny zmian NMJ oraz procesów składania/demontażu. Ten rodzaj protokołu może być przydatny w modelach gryzoni41,42 do oceny NMJ podczas procesów fizjologicznych lub patologicznych, czego przykła...

Połączenie nerwowo-mięśniowe ssaków (NMJ) to duża cholinergiczna trójdzielna synapsa składająca się z zakończenia nerwowego neuronu ruchowego, błony postsynaptycznej na włóknie mięśnia szkieletowego i końcowych komórek Schwanna1,2,3. Synapsa ta wykazuje wysoką plastyczność morfologiczną i funkcjonalną4,5,6,7,8, nawet w wieku dorosłym, kiedy NMJ mogą ulegać dynamicznym modyfikacjom strukturalnym. Na przykład, niektórzy badacze wykazali, że zakończenia nerwów ruchowych nieustannie zmieniają swój kształt w skali mikrometrowej9. Doniesiono również, że morfologia NMJ reaguje na wymagania funkcjonalne, zmienione użytkowanie, starzenie się, ćwiczenia lub zmiany aktywności lokomotorycznej4,10,11,12,13,14,15. Tak więc trening i brak użycia stanowią niezbędny bodziec do modyfikacji niektórych cech NMJ, takich jak jego rozmiar, długość, dyspersja pęcherzyków synaptycznych i receptorów, a także rozgałęzienie zakończeń nerwowych14,16,17,18,19,20.
Ponadto, wykazano, że jakakolwiek zmiana strukturalna lub degeneracja tego ważnego połączenia może spowodować śmierć komórek neuronu ruchowego i zanik mięśni21. Uważa się również, że zmieniona komunikacja między nerwami i mięśniami może być odpowiedzialna za fizjologiczne zmiany NMJ związane z wiekiem i prawdopodobnie za jego zniszczenie w stanach patologicznych. Demontaż połączeń nerwowo-mięśniowych odgrywa kluczową rolę w wystąpieniu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS), choroby neurodegeneracyjnej, która stanowi jeden z najlepszych przykładów upośledzonej interakcji mięśniowo-nerwowej3. Pomimo licznych badań przeprowadzonych nad dysfunkcją neuronu ruchowego, nadal toczy się dyskusja, czy pogorszenie obserwowane w ALS występuje z powodu bezpośredniego uszkodzenia neuronu ruchowego, a następnie rozciąga się na projekcje korowo-rdzeniowe22; lub czy należy to uznać za dystalną aksonopatię, w której zwyrodnienie zaczyna się w zakończeniach nerwowych i postępuje w kierunku neuronu ruchowego somas23,24. Biorąc pod uwagę złożoność patologii ALS, logiczne jest uznanie, że zachodzi mieszanka niezależnych procesów. Ponieważ NMJ jest głównym graczem w fizjopatologicznej interakcji między mięśniami a nerwami, jego destabilizacja stanowi kluczowy punkt w pochodzeniu choroby, który jest istotny do analizy.
Układ nerwowo-mięśniowy ssaków jest funkcjonalnie zorganizowany w odrębne jednostki motoryczne, składające się z neuronu ruchowego i włókien mięśniowych, które są unerwione wyłącznie przez jego zakończenie nerwowe. Każda jednostka motoryczna ma włókna o podobnych lub identycznych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych25. Selektywna rekrutacja neuronów ruchowych pozwala zoptymalizować reakcję mięśni na wymagania funkcjonalne. Teraz jasne jest, że mięśnie szkieletowe ssaków składają się z czterech różnych typów włókien. Niektóre mięśnie są nazwane zgodnie z cechami ich najliczniejszego rodzaju włókna. Na przykład mięsień płaszczkowaty (mięsień tylny kończyny biorący udział w utrzymaniu postawy ciała) ma większość jednostek wolnokurczliwych (typ 1) i jest rozpoznawany jako mięsień wolny. Zamiast tego prostownik długi palca (EDL) składa się zasadniczo z jednostek o podobnych właściwościach szybkokurczliwych (włókna typu 2) i jest znany jako szybki mięsień wyspecjalizowany w ruchach fazowych potrzebnych do poruszania się. Innymi słowy, chociaż dorosłe mięśnie są z natury plastyczne ze względu na wpływy hormonalne i nerwowe, ich skład włókien determinuje zdolność do wykonywania różnych czynności, co widać u mięśnia płaszczkowatego, który doświadcza ciągłej aktywności o niskiej intensywności i EDL, który wykazuje szybszy pojedynczy skurcz. Inne cechy, które są zmienne między różnymi typami włókien mięśniowych, są związane z ich budową (zawartość mitochondriów, wydłużenie retikulum sarkoplazmatycznego, grubość linii Z), zawartość ATPazy miozyny i skład łańcucha ciężkiego miozyny26,27,28,29.
Dla gryzoni NMJ istnieją znaczące różnice między mięśniami28,29. Analizy morfometryczne przeprowadzone w mięśniu płaszczkowatym i EDL od szczurów wykazały dodatnią korelację między obszarem synaptycznym a średnicą włókien (tj. obszar synaptyczny w wolnych włóknach płaszczkowatych jest większy niż w szybkich włóknach EDL), ale stosunek między powierzchnią NMJ a rozmiarem włókien jest podobny w obu mięśniach30,31. Ponadto, w odniesieniu do zakończeń nerwowych, bezwzględne obszary płytki końcowej we włóknach typu 1 były niższe niż we włóknach typu 2, podczas gdy normalizacja przez średnicę włókien sprawiła, że obszary zakończeń nerwowych we włóknach typu 1 były największe<klasa sup="xref">32.
Jednak bardzo niewiele badań skupia się na analizie morfometrycznej, aby pokazać dowody zmian w niektórych składnikach NMJ33,34. Tak więc, ze względu na znaczenie NMJ w funkcjonowaniu organizmu, którego morfologia i fizjologia są zmieniane w różnych patologiach, ważne jest, aby zoptymalizować protokoły preparacji różnych typów mięśni o jakości wystarczającej do umożliwienia wizualizacji całej struktury NMJ. Konieczna jest również ocena występowania zmian pre lub postsynaptycznych w różnych sytuacjach lub warunkach eksperymentalnych, takich jak starzenie się lub ćwiczenia35,36,37,38. Ponadto pomocne może być udowodnienie bardziej subtelnych zmian w składnikach NMJ, takich jak zmieniona fosforylacja neurofilamentów w końcowych zakończeniach nerwowych, jak opisano w ALS39.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z chłodnym oświetleniem świetlnym</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Platforma bujana</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkła nakrywkowe (24 x 32 mm)</td><td>Preparaty mikroskopowe Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus)</td><td>Pęseta PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>FST</td><td></td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Nożyczki 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrza chirurgiczne #10</td><td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa sterylna strzykawka (1 ml)</td><td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP długopis</td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l lub 200 &mu; l pipeta</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H szczury</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-neurofilament H (NF-H), Fosforylowane przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>Poprzednio Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-neurofilament H (NF-H), niefosforylowane przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>poprzednio Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 koza anty-mysia IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, koniugat biotyny-XX</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, Alexa Fluor 555 koniugat</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminophenylindol (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest wyspecjalizowanym punktem kontaktu między nerwem ruchowym a mięśniem szkieletowym. Ta synapsa obwodowa wykazuje wysoką plastyczność morfologiczną i funkcjonalną. W wielu zaburzeniach układu nerwowego NMJ jest wczesnym patologicznym celem powodującym niewydolność neuroprzekaźnictwa, osłabienie, atrofię, a nawet śmierć włókien mięśniowych. Ze względu na swoje znaczenie, możliwość ilościowej oceny niektórych aspektów relacji między komponentami NMJ może pomóc w zrozumieniu procesów związanych z jego montażem/demontażem. Pierwszą przeszkodą podczas pracy z mięśniami jest zdobycie wiedzy technicznej, aby szybko zidentyfikować i przeanalizować bez uszkadzania ich włókien. Drugim wyzwaniem jest wykorzystanie wysokiej jakości metod detekcji w celu uzyskania obrazów NMJ, które można wykorzystać do przeprowadzenia analizy ilościowej. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół preparowania mięśni prostownika długiego palca i płaszczkowatego mięśni grzbietowych szczurów. Wyjaśnia również zastosowanie immunofluorescencji do wizualizacji elementów pre i postsynaptycznych NMJ z całą górą. Uzyskane wyniki pokazują, że technika ta może być wykorzystana do ustalenia mikroskopowej anatomii synapsy i identyfikacji subtelnych zmian w stanie niektórych jej składników w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.

Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę izolacji i immunostainowania włókien mięśniowych pochodzących z dwóch różnych typów mięśni (mięśni szybkokurczliwych i wolnokurczliwych, patrz Rycina 1). Wykorzystując odpowiednie markery i/lub sondy, można wykrywać i oceniać komponenty połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) z punktu widzenia ilościowego, aby ocenić niektóre zmiany morfologiczne, które mogą wystąpić w następstwie postępu choroby lub specyficznego leczenia farmakologicznego. W niniej...

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości. Ten film zademonstruje protokół skutecznego i bezpiecznego preparowania mięśni EDL i płaszczkowatych przy użyciu powtarzalnego podejścia. Ten film nauczy również, jak uzyskać całe połączenia nerwowo-mięśniowe w celu rozpoznania komponentów synaptycznych z integralnością 3D, aby umożliwić dokładną analizę morfometryczną.Do wypreparowania mięśni potrzebne są te narzędzia chirurgiczne. Aby rozpocząć zabieg, ułóż zwierzę brzuchem skierowanym do góry. Wykonaj wstępne nacięcie za pomocą ostrza chirurgicznego między palcami u nóg w kierunku kończyn tylnych.Zdejmij skórę, ciągnąc w górę, aż prawe kolano zostanie odsłonięte. Aby znaleźć EDL, podążaj za ścięgnami stopy do więzadła pierścieniowego. To więzadło okrąża dwa ścięgna.Przetnij więzadło nożyczkami Uniband między dwoma ścięgnami. Zidentyfikuj ścięgno EDL, podnosząc oba i sprawdzając, które z nich sprawia, że palce u nóg poruszają się w górę. Przetnij ścięgno nożyczkami.Trzymając ścięgno pęsetą biologiczną, zacznij powoli oddzielać mięsień EDL od innych mięśni kończyn tylnych. Oddzielenie mięśnia bez powodowania uszkodzeń można wykonać, wykonując różne nacięcia na pozostałych mięśniach bocznych, aby otworzyć drogę między nimi, jednocześnie przytrzymując i podnosząc mięsień z rozszczepiającej się części ścięgna EDL. Aby całkowicie odizolować mięsień, przetnij ścięgno przymocowane do kolana szczura za pomocą nożyczek Uniband.Zanurz wycięty mięsień w roztworze utrwalającym i pozostaw na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ogólnie rzecz biorąc, dobrze jest mieć wydłużony mięsień. Aby to zrobić, użyj kartonu i zszywek, aby przymocować mięsień do utrwalenia.Aby wyizolować mięsień płaszczkowaty, odwróć zwierzę. Przez skórę przetnij ścięgno piętowe za pomocą ostrza chirurgicznego. Za pomocą pęsety biologicznej i nożyczek Uniband oddziel mięsień brzuchaty łydki od kości, tworząc muskularną pokrywę.Płaszczkowaty będzie znajdował się po wewnętrznej stronie muskularnej powieki. Można go zidentyfikować, ponieważ jest czerwony i płaski. Za pomocą pęsety biologicznej sięgnij i unieś ścięgno płaszczkowate, które leży nad mięśniem brzuchatym łydki.Przetnij ścięgno nożyczkami Uniband. Podnieś cały mięsień, jednocześnie przecinając niektóre słabe punkty przyczepu. Na koniec, aby całkowicie uwolnić mięsień płaszczkowaty, przetnij pęcherzyk płaszczkowaty, który tworzy ścięgno piętowe.Powtórz krok fiksacji, tak jak w przypadku mięśnia EDL. Aby skorzystać z tej metody, ważne jest, aby przymocować zszywki do ścięgien, a nie do mięśnia. Po upływie 24-godzinnego okresu utrwalania należy przepłukać mięśnie roztworem DPBS przed rozpoczęciem izolowania włókien mięśniowych.Aby wyizolować włókna, delikatnie przytrzymaj jedno ze ścięgien jedną parą pęsety biologicznej. Następnie za pomocą drugiej pary pęsety biologicznej zacznij powoli ściskać ścięgno, aby oddzielić włókna mięśniowe. Aby wyizolować włókna, powoli pociągnij w górę w kierunku przeciwległego ścięgna mięśniowego.Konieczne będzie powtórzenie tej czynności kilka razy, aż do uzyskania wielu, małych, izolowanych wiązek. Po rozdzieleniu na małe, odizolowane wiązki, umieść je ostrożnie w wstępnie przygotowanym silanizowanym szkiełku. Konieczne jest utrzymanie porządku we wszystkich włóknach, aby nie zachodziły na siebie.W tym momencie włókna można pozostawić do wyschnięcia na powietrzu na 24 godziny. Po 24 godzinach rozpocznij barwienie immunologiczne. Aby stworzyć wodoodporną barierę, użyj pisaka PAP, aby otoczyć izolowane włókna mięśniowe we wstępnie przygotowanym szkiełku.Jest to przykład obrazu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, który można uzyskać zgodnie z opisanym tutaj protokołem. W lewym górnym rogu pokazany jest element postsynaptyczny, a w prawym górnym element presynaptyczny, podczas gdy dolne obrazy pokazują komponenty synaptyczne schematyzowane w celu zilustrowania parametrów, które zostaną wykorzystane do analizy morfometrycznej. Drugi slajd pokazuje łączenie się sygnałów pre- i postsynaptycznych z barwieniem jąder API.Różnice między połączeniami nerwowo-mięśniowymi zwierząt transgenicznych i nietransgenicznych są wyraźnie widoczne. Analiza morfometryczna połączeń nerwowo-mięśniowych wykazuje dowody na sygnał postsynaptyczny u zwierząt transgenicznych i wydaje się być bardziej zwarta, głównie ze względu na zmniejszoną całkowitą powierzchnię połączenia nerwowo-mięśniowego. Jak pokazano tutaj, obszar presynaptyczny połączenia nerwowo-mięśniowego zwierzęcia transgenicznego jest zmniejszony.Najmniejszą wykrytą instytucją był ten, który stwierdzono z antyfosforylowanym sygnałem neurofilamentu, jak pokazano na przykład na obrazie B. Ostatni obraz przedstawia wyniki dotyczące stanu połączeń nerwowo-mięśniowych w całości zamontowanych. Za pomocą wskaźnika pokrycia ustalono, że transgeniczne połączenia nerwowo-mięśniowe są częściowo odnerwione.Może również określić, że zasięg i nexus ufosforylowanego neurofilamentu jest niższy niż uzyskany po wykryciu neurofilamentu nieufosforylowanego. Proponowany protokół pozwala na uzyskanie wysokiej jakości preparatów połączeń nerwowo-mięśniowych z wolnych i szybkich włókien mięśniowych. Składniki przed- i postsynaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego zidentyfikowano za pomocą specyficznych sond lub przeciwciał, a następnie zobrazowano w mikroskopii konfokalnej lub konfokalnej o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając analizę morfometryczną w skali mikrometrycznej.

dissection-single-skeletal-muscle-fibers-for-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

W tym filmie demonstrujemy protokół do preparacji mięśnia poprzecznego brzucha myszy i używamy immunofluorescencji i mikroskopii do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych.

Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Naucz się rozwarstwiania pojedynczych włókien mięśni szkieletowych szczura do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych. Ta metoda umożliwia wykrywanie subtelnych zmian patologicznych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości (Wideo) | JoVE Journal

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Przeglądaj więcej filmów