Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków
30 czerwca 2021
Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu przygotowania endosomów do recyklingu z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiacji gęstości sacharozy.
Protokół ten pomaga w izolowaniu endosomów recyklingu zawierających frakcję z transfekowanych komórek ssaków, aby ułatwić badanie transportu białek poprzez transport endocytarny. Technika ta jest łatwa w obsłudze i ma zastosowanie zarówno do próbek tkanek, jak i komórek. Procedurę zademonstruje pani Zhai Yu Qi, doktorantka z Laboratorium Dr. Lao.
Na początek połóż 2 razy 10 do 6 komórek w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Następnego dnia należy przetransfekować komórki lipofekcją zgodnie z zaleceniami producenta. Aby pobrać komórki, należy wyrzucić pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS uzupełnionego 0,5-krotnym koktajlem inhibitorów proteazy w 0,5-krotnym koktajlu inhibitorów fosfatazy do każdego dania. Następnie za pomocą skrobaka do komórek zbierz komórki i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. komórki przez odwirowanie za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego.
Wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu homogenizacyjnego. Ponownie zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu homogenizacyjnego. Homogenizuj komórki za pomocą homogenizatora Dounce za pomocą 15 do 20 pociągnięć.
Następnie przenieś homogonat do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Dodać 700 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do homogonacji. Następnie odwiruj rozcieńczony homogonat i zbierz 1,5 mililitra supernatantu.
Ponownie odkręć zebrany supernatant, a następnie zbierz 1,4 mililitra supernatantu i oznacz go jako supernatant postjądrowy. Aby przygotować kolumnę gradientu gęstości, przenieś 1,2 mililitra supernatantu pojądrowego do probówki ultrawirówkowej. Następnie dodać jeden mililitr 62% roztworu sacharozy do próbki i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując.
Następnie ostrożnie dodaj 3,3 mililitra 35% roztworu sacharozy na wierzch próbki, a następnie 2,2 mililitra 25% roztworu sacharozy na wierzch 35% roztworu sacharozy. Na koniec napełnij probówkę ultrawirówki do góry buforem homogenizacyjnym. Odwiruj kolumnę gradientu gęstości i ostrożnie zbierz 12 frakcji po 1 mililitrze każda, zaczynając od góry gradientu.
Następnie rozcieńczyć wszystkie frakcje jednym mililitrem buforu rozcieńczającego i odwirować rozcieńczone próbki. Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 50 mikrolitrów buforu do próbek 1X w celu zebrania frakcji. Recyklingowy marker endosomu Rab11 wykryto we frakcji siódmej.
Badano również inne markery subkomórkowe, w tym beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 i Lamp1. Pozytywny sygnał EEA1 wykryto również we frakcji siódmej. Zmierzone intensywności pasm GAPDH, Cox IV i Rab11 zarówno we frakcji siódmej, jak i w supernatancie postjądrowym są pokazane tutaj.
Po transeksacji komórek HEC293 z ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L lub ELMO1 ARF6Q67L FE65 nie stwierdzono żadnych zmian w dystrybucji ELMO1 z nadekspresją ARF6Q67L i FE65. Poziom ELMO1 we frakcji siódmej porównano między różnymi transfekcjami i stwierdzono, że jest podwyższony po kotransfekcji ARF6Q67L. Dalszy wzrost zaobserwowano, gdy zarówno ARF6Q67L, jak i FE65 ulegały jednoczesnej ekspresji.
I odwrotnie, wybicie FE65 zmniejszyło wzbogacenie Elmo1 za pośrednictwem ARF6 we frakcji siódmej. Uzyskaną frakcję można wykorzystać do późniejszej analizy. Na przykład western blotting w celu wizualizacji zmian poziomu białka we frakcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przygotowania endosomów recyklingujących z komórek ssaków z wykorzystaniem ultrawirowania w gradientach gęstości sacharozy. Technika ta została opracowana w celu ułatwienia badania transportu białek poprzez szlaki endocytyczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Endocytoza
- Transport białek
Wstęp
- Endosomy recyklingujące odgrywają kluczową rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym.
- Zrozumienie transportu białek jest niezbędne do poznania różnych procesów komórkowych.
- Ultracentryfugacja jest powszechnie stosowaną techniką izolowania składników komórkowych.
- Niniejszy protokół ma zastosowanie zarówno do próbek tkanek, jak i komórek.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnej metody izolacji endosomów recyklingujących.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów transportu endocytycznego.
- Wsparcie przyszłych badań nad dynamiką białek w komórkach.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek ssaków za pomocą Lipofectamine.
- Zbiór komórek 48 godzin po transfekcji.
- Przemywanie komórek lodowatym PBS.
- Wykorzystanie ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy w celu izolacji.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja endosomów recyklingujących z transfekowanych komórek.
- Prezentacja protokołu przeprowadzona przez doktoranta.
- Ułatwienie dalszych badań nad transportem białek.
- Walidacja możliwości zastosowania metody dla różnych typów próbek.
Wnioski
- Protokół zapewnia prosty sposób izolacji endosomów recyklingujących.
- Oczekuje się, że pomoże on w zrozumieniu transportu białek.
- Metodę tę można wykorzystać w różnych kontekstach badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja endosomów recyklingujących umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w przypadku celów transportu endocytycznego poprzez dostarczenie ilościowych danych z frakcjonowania subkomórkowego. Wspiera to walidację celów oraz rozwój testów dla białek regulujących recykling białek błonowych, takich jak efektory ARF6. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących poprzez powiązanie lokalizacji białka z funkcjonalnymi szlakami recyklingu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących regulatorów recyklingu endocytycznego, takich jak ARF6 i ELMO1.
- Wartość operacyjna: Dostarcza danych z frakcjonowania w celu wyjaśnienia mechanizmów transportu białek specyficznych dla danej ścieżki.
- Wartość naukowa: Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez walidację zaangażowania celu w frakcjach endosomów recyklingujących.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych frakcji zawierających endosomy recyklingujące do dalszej analizy metodą Western blot.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie standaryzowanej, powtarzalnej izolacji organelli do ilościowego pomiaru białek.
- Wartość naukowa: Ułatwienie przygotowania testów do przesiewania związków modulujących recykling endocytyczny.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy dane dotyczące transportu wewnątrzkomórkowego z fazy odkrywania z modelami przedklinicznymi poprzez izolację frakcji pozytywnej pod kątem Rab11.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od frakcjonowania subkomórkowego do walidacji funkcjonalnej w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wartość naukowa: Wspiera postępy z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez potwierdzenie lokalizacji celu w szlakach recyklingu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków poprzez izolację frakcji subkomórkowych, które dostarczają informacji niezbędnych do walidacji celu oraz podejmowania decyzji w zakresie identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulatorów recyklingu endocytowego poprzez frakcjonowanie i analizę markerów.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów dzięki standaryzowanej izolacji frakcji Rab11-dodatnich w celu ilościowego oznaczenia białek.
- Analityka: Generuje ilościowe wyniki Western blot z frakcji w celu porównania wzbogacenia białek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy dane z frakcjonowania z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację izolacji endosomów recyklingujących.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia platformę do powtarzalnego frakcjonowania subkomórkowego w wielu projektach walidacji celów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach transportu wewnątrzkomórkowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odtwarzalność i skalowalność izolacji organelli dla spójnej analizy w kolejnych etapach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie danych o lokalizacji subkomórkowej dla celów w szlaku recyklingu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące wzbogacenia w endosomy recyklingujące.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli komórkowej, transfekcji i ultrawirowania.
- Zależne od dostępu do wirówek z rotorami z koszykami wahadłowymi oraz ultrawirowarek do rozdziału w gradiencie gęstości.
- Wymaga standaryzacji protokołów frakcjonowania pomiędzy zespołami w celu uzyskania porównywalnych wyników izolacji frakcji Rab11.
- Wymaga adaptacji paneli markerów (np. Rab11, EEA1) dla różnych typów komórek lub szlaków transportu wewnątrzkomórkowego.
- Ograniczone koniecznością zastosowania markerów walidacyjnych w celu potwierdzenia czystości frakcji przed dalszymi aplikacjami.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
