Name: Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Poznaj metodę izolacji endosomów recyklingowych z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości. Technika ta umożliwia badanie transportu białek poprzez szlaki endocytarne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Research Grants Council Hong Kong, programu bezpośrednich grantów CUHK, United College endowment fund oraz TUYF Charitable Trust. Dane liczbowe w tej pracy zostały zaadaptowane z naszej poprzedniej publikacji "ARF6-Rac1 wzrost neurytów za pośrednictwem sygnalizacji jest wzmacniany przez adaptor neuronalny FE65 poprzez orkiestrację ARF6 i ELMO1" opublikowaną w czasopiśmie FASEB w październiku 2020 r.

1. Hodowla i transfekcja komórek ssaków
<ol>
	<li>Płytka 2 x 106 komórek w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Do każdej transfekcji należy użyć czterech szalek. 
	UWAGA: Wymagana liczba komórek może się różnić w zależności od linii komórkowych. Optymalizacja może być konieczna przed przejściem do etapu izolacji.</li>
	<li>Następnego dnia należy przetransfekować komórki lipofetaminą zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Wyrzucić pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji.</li>
	<li>Umyj komórki lodowatym PBS (10 mM fosforanów sodu, 2,68 mM chlorku potasu, 140 mM chlorku sodu) dwukrotnie.</li>
	<li>Dodaj 1 ml lodowatego PBS+ (PBS uzupełnionego 0,5x koktajlem inhibitorów proteazy i 0,5x koktajlem inhibitorów fosfatazy) do każdego dania.</li>
	<li>Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Granulować komórki przez odwirowanie za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o sile 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforu homogenizacyjnego (HB; 250 mM sacharozy, 3 mM imidazol o pH 7,4, 1 mM EDTA uzupełniony 0,03 mM cykloheksymidem, 1x koktajl inhibitora proteazy i 1x koktajl inhibitora fosfatazy).</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 1 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml HB.</li>
	<li>Homogenizuj komórki za pomocą homogenizatora Dounce przez 15-20 uderzeń. 
	UWAGA: Można zastosować inne metody homogenizacji, na przykład przepuszczenie próbki przez strzykawkę. Skuteczność homogenizacji można ujawnić, obserwując homogenat pod mikroskopem z kontrastem fazowym.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. 
	UWAGA: Zebrać 50 μl homogenatu z 12,5 μl 5x buforu próbki i oznaczyć go jako lizat całkowity.</li>
	<li>Dodać 0,7 ml HB do homogenatu.</li>
	<li>Wirować rozcieńczony homogenat w temperaturze 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Osad zawiera jądra i nieuszkodzone komórki.</li>
	<li>Zebrać 1,5 ml supernatantu i powtórzyć krok 2.12 jeden raz.</li>
	<li>Zebrać 1,4 ml supernatantu i oznaczyć go jako supernatant postjądrowy (PNS).</li>
</ol>
3. Przygotowanie kolumny gradientu gęstości
<ol>
	<li>Przenieś 1,2 ml PNS do probówki ultrawirówkowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml 62% roztworu sacharozy (2,351 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) do próbki i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. 
	UWAGA: Otrzymany roztwór to 40,6% roztwór sacharozy.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 3,3 ml 35% roztworu sacharozy (1,177 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) na wierzch próbki.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 2,2 ml 25% roztworu sacharozy (0,806 M sacharozy, 3 mM imidazolu o pH 7,4) na wierzch 35% roztworu sacharozy. 
	UWAGA: Współczynnik załamania światła 62%, 40,6%, 35% i 25% roztworów sacharozy w temperaturze pokojowej wynosi odpowiednio 1,44, 1,40, 1,39 i 1,37. Współczynniki załamania światła roztworów sacharozy można sprawdzić za pomocą refraktometru, aby zapewnić precyzję i spójność eksperymentu.</li>
	<li>Napełnij probówkę do ultrawirowania HB. 
	UWAGA: Przygotować kolumnę gradientu gęstości należy tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Frakcjonowanie i odzysk frakcji zawierającej endosomy z recyklingu
<ol>
	<li>Odwirować kolumnę przy 210 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zbierz 12 frakcji (po 1 ml każda), zaczynając od góry gradientu. 
	UWAGA: Endosomy do recyklingu powinny znajdować się na granicy między 35% a 25% roztworami sacharozy. Zebrane frakcje można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć wszystkie frakcje 1 ml buforu rozcieńczającego (3 mM imidazol o pH 7,4, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Odwirować rozcieńczoną próbkę o masie 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 50 μl 1x buforu do próbki w celu zebrania frakcji.</li>
	<li>Przeanalizuj zawartość białka we frakcjach metodą western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

Powyższy protokół przedstawia procedury izolowania endosomów recyklingowych z hodowanych komórek za pomocą ultrawirowania. Niezawodność tej metody została wykazana w najnowszej publikacji22, udowadniając, że endosomy recyklingowe są z powodzeniem izolowane z innych organelli (ryc. 1), takich jak aparat Golgiego i mitochondria. Aby uzyskać dobry wynik separacji, należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków. Podczas przygotowywania roztworów sacharozy zaleca się wal...

Endosomalny transport jest niezbędnym procesem fizjologicznym, który implikuje różne zdarzenia biologiczne1, na przykład transport receptorów sygnałowych, kanałów jonowych i cząsteczek adhezyjnych. Białka zlokalizowane na błonie plazmatycznej są internalizowane przez endocytozę2. Zinternalizowane białka są następnie sortowane według wczesnej klasy endosome<sup="xref">3. Niektóre z białek są kierowane do lizosomów w celu degradacji4. Jednak znaczna ilość białek jest zawracana z powrotem na powierzchnię komórki w wyniku szybkiego recyklingu i powolnych procesów recyklingu. W szybkim recyklingu białka opuszczają wczesne endosomy i bezpośrednio wracają do błony plazmatycznej. I odwrotnie, w powolnym recyklingu białka są najpierw sortowane do przedziału recyklingu endocytarnego, a następnie transportowane z powrotem do błony plazmatycznej. Różne białka ładunkowe, na przykład klatryna, kompleks retromerów, kompleks retriever i białko zespołu Wiskotta-Aldricha oraz kompleks homologu SCAR (WASH), uczestniczą w takich procesach recyklingu błonowego4,5,6,7,8,9. Równowaga między endocytozą a recyklingiem ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórki i przyczynia się do różnych zdarzeń komórkowych10, na przykład adhezji komórek, migracji komórek, polaryzacji komórek i transdukcji sygnału.
ARF6, mała GTPaza, jest zgłoszonym regulatorem transportu endocytarnego7,11,12. Co ciekawe, różne grupy badawcze zilustrowały znaczenie ARF6 w recyklingu endocytarnym13,14,15,16,17. Badanie ma na celu zbadanie związku między wzrostem neurytów za pośrednictwem ARF6 a recyklingiem endocytarnym. Poprzedni raport sugeruje, że aktywacja ARF6 jest wcześniejsza od aktywności Rac1 poprzez działanie na ELMO1-dedykator cytokinezy 1 (DOCK180) complex18. Jednak sposób, w jaki ARF6 wyzwala sygnalizację Rac1 za pośrednictwem ELMO1-DOCK180, pozostaje niejasny. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości wykorzystano do zbadania roli recyklingu endocytarnego za pośrednictwem ARF6 w takim procesie. W ten sposób uzyskano frakcję zawierającą endosom do recyklingu z lizatów komórkowych19. Frakcję poddano Western blot w celu analizy zawartości białka. Wyniki badań wykazały, że w obecności FE65, białka adaptorowego wzbogaconego w mózg, aktywny ARF6 znacznie zwiększył poziom ELMO1 we frakcji zawierającej recycling endosomy. Poniższy protokół obejmuje procedury dotyczące: (1) transfekcji komórek ssaków; 2) przygotowanie próbek i kolumn gradientu gęstości; oraz (3) otrzymanie frakcji zawierającej endosomy do recyklingu.

<table><tbody><tr><td>1 ml, grubościenna probówka polipropylenowa Open-Top, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie do hodowli tkankowych</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, certyfikowana bezpłatna cienkościenna ultraprzezroczysta probówka z otwartym dachem, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Bufor do próbek</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>4850S Przeciwciało</td><td>monoklonalne królika do wykrywania COX IV.</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder, 7 ml</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z przeciwciałem</td><td>HyClone</td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 o niskiej zawartości glukozy (B-7)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-271519</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania ELMO1.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit Przeciwciało</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>Przeciwciało poliklonalne Goat do wykrywania FE65.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, HyClone klasy badawczej</td><td></td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne GAPDH (6C5)</td><td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania GAPDH.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageLab</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Pomiar natężenia pasma</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-&beta;-COP</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania &beta;-COP.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) mysia technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb <td>2276S</td><td>Mysie przeciwciało monoklonalne do wykrywania białek znakowanych myc.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, sól disodowa, dwuwodzian</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>tabletki PBS</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne swoiste dla RAB11A</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Królicze przeciwciało poliklonalne do wykrywania Rab11.</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor uchylno-kubełkowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Rotor stałokątowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomalny transport jest niezbędnym procesem komórkowym, który reguluje szeroki zakres zdarzeń biologicznych. Białka są internalizowane z błony plazmatycznej, a następnie transportowane do wczesnych endosomów. Zinternalizowane białka mogą być przenoszone do lizosomu w celu degradacji lub zawracane z powrotem do błony plazmatycznej. Solidny szlak recyklingu endocytarnego jest wymagany, aby zrównoważyć usuwanie materiałów błonowych z endocytozy. Doniesiono, że różne białka regulują ten szlak, w tym czynnik ADP-rybozylacji 6 (ARF6). Ultrawirowanie w gradiencie gęstości jest klasyczną metodą frakcjonowania komórek. Po odwirowaniu organelle są sedymentowane na ich powierzchni izopiknicznej. Frakcje są zbierane i wykorzystywane do innych dalszych zastosowań. Opisano tutaj protokół uzyskiwania frakcji zawierającej endosom do recyklingu z transfekowanych komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradionym gradiacji gęstości. Wyizolowane frakcje poddano standardowemu Western blot w celu analizy zawartości białka. Stosując tę metodę, stwierdziliśmy, że celowanie w błonę plazmatyczną pochłaniania i ruchliwości komórek 1 (ELMO1), czynnika wymiany nukleotydów guaninowych z substratem toksyny botulinowej C3 (Rac1) związanego z Ras, odbywa się poprzez recykling endocytarny za pośrednictwem ARF6.

Po frakcjonowaniu nieprzetransfekowanych komórek HEK293 za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości, zebrane zostało 12 frakcji, zaczynając od góry gradientu. Zebrane frakcje rozcieńczono buforem do rozcieńczania w stosunku 1:1 i poddano drugiej rundzie wirowania. Następnie próbki poddano analizie western blotting w celu zbadania zawartości białek. Jak pokazano na Rysunku 1, marker recyklingowych endosomów Rab11 został wykryty we frakcji 720. Badano również inne ma...

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu przygotowania endosomów do recyklingu z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiacji gęstości sacharozy.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Protokół ten pomaga w izolowaniu endosomów recyklingu zawierających frakcję z transfekowanych komórek ssaków, aby ułatwić badanie transportu białek poprzez transport endocytarny. Technika ta jest łatwa w obsłudze i ma zastosowanie zarówno do próbek tkanek, jak i komórek. Procedurę zademonstruje pani Zhai Yu Qi, doktorantka z Laboratorium Dr. Lao.Na początek połóż 2 razy 10 do 6 komórek w 100-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Następnego dnia należy przetransfekować komórki lipofekcją zgodnie z zaleceniami producenta. Aby pobrać komórki, należy wyrzucić pożywkę hodowlaną 48 godzin po transfekcji i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym PBS.Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS uzupełnionego 0,5-krotnym koktajlem inhibitorów proteazy w 0,5-krotnym koktajlu inhibitorów fosfatazy do każdego dania. Następnie za pomocą skrobaka do komórek zbierz komórki i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. komórki przez odwirowanie za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego.Wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu homogenizacyjnego. Ponownie zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu homogenizacyjnego. Homogenizuj komórki za pomocą homogenizatora Dounce za pomocą 15 do 20 pociągnięć.Następnie przenieś homogonat do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Dodać 700 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do homogonacji. Następnie odwiruj rozcieńczony homogonat i zbierz 1,5 mililitra supernatantu.Ponownie odkręć zebrany supernatant, a następnie zbierz 1,4 mililitra supernatantu i oznacz go jako supernatant postjądrowy. Aby przygotować kolumnę gradientu gęstości, przenieś 1,2 mililitra supernatantu pojądrowego do probówki ultrawirówkowej. Następnie dodać jeden mililitr 62% roztworu sacharozy do próbki i dobrze wymieszać, delikatnie pipetując.Następnie ostrożnie dodaj 3,3 mililitra 35% roztworu sacharozy na wierzch próbki, a następnie 2,2 mililitra 25% roztworu sacharozy na wierzch 35% roztworu sacharozy. Na koniec napełnij probówkę ultrawirówki do góry buforem homogenizacyjnym. Odwiruj kolumnę gradientu gęstości i ostrożnie zbierz 12 frakcji po 1 mililitrze każda, zaczynając od góry gradientu.Następnie rozcieńczyć wszystkie frakcje jednym mililitrem buforu rozcieńczającego i odwirować rozcieńczone próbki. Po odwirowaniu odessać supernatant i dodać 50 mikrolitrów buforu do próbek 1X w celu zebrania frakcji. Recyklingowy marker endosomu Rab11 wykryto we frakcji siódmej.Badano również inne markery subkomórkowe, w tym beta COP, COX IV, GAPDH, EEA1, Rab 7 i Lamp1. Pozytywny sygnał EEA1 wykryto również we frakcji siódmej. Zmierzone intensywności pasm GAPDH, Cox IV i Rab11 zarówno we frakcji siódmej, jak i w supernatancie postjądrowym są pokazane tutaj.Po transeksacji komórek HEC293 z ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L lub ELMO1 ARF6Q67L FE65 nie stwierdzono żadnych zmian w dystrybucji ELMO1 z nadekspresją ARF6Q67L i FE65. Poziom ELMO1 we frakcji siódmej porównano między różnymi transfekcjami i stwierdzono, że jest podwyższony po kotransfekcji ARF6Q67L. Dalszy wzrost zaobserwowano, gdy zarówno ARF6Q67L, jak i FE65 ulegały jednoczesnej ekspresji.I odwrotnie, wybicie FE65 zmniejszyło wzbogacenie Elmo1 za pośrednictwem ARF6 we frakcji siódmej. Uzyskaną frakcję można wykorzystać do późniejszej analizy. Na przykład western blotting w celu wizualizacji zmian poziomu białka we frakcji.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

W tym filmie opisujemy prosty i skuteczny protokół wykorzystujący wirowanie gradientowe do izolowania pojedynczych jąder. Po wyizolowaniu jądra te można wykorzystać do sekwencjonowania i analizy genomu.

Oczyszczanie jąder oparte na wirowaniu gradientowym: technika otrzymywania ultraczystej frakcji nienaruszonych jąder za pomocą wirowania w gradicynacji gęstości

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Mitochondrialne miejsca kontaktu to kompleksy białkowe, które oddziałują z wewnętrznymi i zewnętrznymi białkami błony mitochondrialnej. Miejsca te są niezbędne do komunikacji między błonami mitochondrialnymi, a tym samym między cytozolem a macierzą mitochondrialną. W tym miejscu opisujemy metodę identyfikacji kandydatów kwalifikujących się do tej konkretnej klasy białek.

Ulepszona metoda izolowania mitochondrialnych miejsc kontaktowych

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Protokół opisuje izolację mikrobiologicznych EV jelitowych od wrażliwych na sól szczurów karmionych HSD za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. EV scharakteryzowano za pomocą śledzenia nanocząstek, testów TEM, LPS/BCA i sekwencjonowania 16S rRNA w celu analizy wielkości, morfologii, składu i pochodzenia mikrobioty.

Separacja i charakterystyka różnicowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych drobnoustrojów jelitowych u szczurów wrażliwych na sól w warunkach diety bogatej w sól

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Poznaj metodę izolacji endosomów recyklingowych z komórek ssaków za pomocą ultrawirowania w gradiencie gęstości. Technika ta umożliwia badanie transportu białek poprzez szlaki endocytarne.

Ultrawirowanie w gradiencie gęstości do badania recyklingu endocytarnego w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów