Name: Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę ekspansji limfocytów T gamma-delta z aferezy dla terapii przeciwnowotworowej. Protokół umożliwia uzyskanie czystego produktu komórkowego z ponad 200 000-krotnym wzbogaceniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Celluracions-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity z Moffitt Cancer Center za udostępnienie funduszy na rozwój tego protokołu. Dziękujemy również dr Claudio Anasettiemu za jego nieocenioną pomoc i wskazówki w tym projekcie. Na koniec dziękujemy dr Justinowi Boucherowi za jego spostrzeżenia i recenzję manuskryptu.

UWAGA: Uzyskano zgodę IRB i uzyskano świadomą zgodę od darczyńców.
1. Izolacja limfocytów
<ol>
	<li>Przenieść produkt do aferezy do pomieszczenia czystego. 
	UWAGA: Walidacja procesu została przeprowadzona przy użyciu normalnej aferezy dawcy od zewnętrznego dostawcy komercyjnego zgodnego z przepisami dotyczącymi pobierania surowego materiału komórkowego.</li>
	<li>Zbierz próbki do testów sterylności, liczby komórek i fenotypowania komórek.</li>
	<li>Elutriować na urządzeniu wirującym przeciwprądowym przy użyciu pierwotnego podłoża ze zbilansowanego roztworu soli Hanksa z 1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA) i wtórnym podłożem roztworu soli (0,9% chlorku sodu do wstrzykiwań USP) lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS). Ustawić prędkość wirowania elutriacyjnego na 900 × g i zbierać frakcje w zależności od natężenia przepływu i czasu.</li>
	<li>Pobrać próbki z frakcji 2 i wykonać następujące testy: 2 ml do badania sterylności; 0,5 ml do badania liczby i żywotności komórek przy użyciu pomarańczy akrydynowej/jodku propidyny (AO/PI); 5 × 106 komórek do fenotypowania komórek metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Ekspandować czystą frakcję limfocytów (frakcję 2) komórek w hodowli w temperaturze 10 × 106 komórek/cm2 w bioreaktorze o pojemności 1 l w układzie zamkniętym z 5 μmol/l kwasu zoledronowego i 300 j.m./ml IL-2.</li>
	<li>Inkubować przez siedem dni w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Zubożenie limfocytów T alfa-beta (αβ)
<ol>
	<li>Pobrać komórki z kolby bioreaktora o pojemności 1 l w układzie zamkniętym. Sterylnie przyspawać opakowanie transferowe o pojemności 1 litra do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym i użyć odpowiedniej pompy farmaceutycznej do przeniesienia komórek do opakowania transferowego.</li>
	<li>Pobrać następujące próbki: 10 ml do sterylności zużytego podłoża; 0,5 ml komórek do zliczania i żywotności komórek przy użyciu AO/PI; 5 × 106 komórek do cytometrii przepływowej</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki na ~ 5 × 108 komórek/ml w buforze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub buforze (PBS/kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) + 0,5% HSA i biotynylowanym przeciwciałie specyficznym TCR αβ.</li>
	<li>Umieścić shaker w lodówce i inkubować komórki w temperaturze 2-8 °C przez około 15 minut z wytrząsaniem.</li>
	<li>Umyj komórki łącznie 600 ml buforu PBS/EDTA + 0,5% HSA. Odwirować w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała w temperaturze 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C. Zawiesić ~5 × 108 komórek/ml w buforze PBS/EDTA + 0,5% HSA z mikrogranulkami specyficznymi dla antybiotyny (7,5 ml/1 fiolkę).</li>
	<li>Umieścić shaker w lodówce i inkubować komórki w temperaturze 2-8 °C przez około 15 minut z wytrząsaniem. Po inkubacji odwirować komórki w temperaturze 200–500 × g przez 15 minut w temperaturze 2–8 °C w celu usunięcia niezwiązanych mikrogranulek. Ponownie zawieś ~6 × 107 komórek/ml w buforze PBS/EDTA + 0,5% HSA i przenieś je do worka transferowego.</li>
	<li>Zainstaluj zestaw przewodów w magnetycznym urządzeniu do separacji komórek klasy klinicznej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, umieść opakowania z buforem PBS/EDTA i pakiet transferowy z produktem komórkowym w instrumencie i nabij go zgodnie z instrukcjami instrumentu.</li>
	<li>Wybierz protokół Depletion 1.2 dla wyczerpania znakowanych limfocytów T αβ.</li>
	<li>Odwirować frakcję docelową (wzbogacone limfocyty T γδ) i ponownie zawiesić komórki w pożywce uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB.</li>
	<li>Weź próbkę o objętości 0,5 ml i wykonaj zliczanie komórek i żywotność za pomocą barwienia AO/PI. Doprowadź komórki do końcowego stężenia około 1 × 106 komórek/ml. Pobrać próbkę składającą się z 5 × 106 komórek produktu do fenotypowania cytometrii przepływowej po wyczerpaniu.</li>
</ol>
3. Współkultura z APC
<ol>
	<li>Napromieniować 5 × 107 aAPC/kolbę o ciśnieniu 100 Gy na przyrząd do generowania promieniowania rentgenowskiego.</li>
	<li>Stosować aAPC w kohodowli w stosunku 10:1 z limfocytami T γδ. Umieścić napromieniowane aAPC (5 × 107 komórek/kolbę) i limfocyty T γδ (5 × 106 komórek/kolbę) umieścić w 1 l kolbach bioreaktora z systemem zamkniętym z 1 l pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB. Wysiewać do 10 kolb.</li>
	<li>Namnażać komórki w hodowli przez 10 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Monitoruj poziom glukozy i mleczanu co 3-4 dni za pomocą pasków, glukometru i glukometru.</li>
	<li>Jeśli poziom glukozy spadnie do 250 mg/dl, należy zmniejszyć objętość w kolbie do 200 ml za pomocą pompy farmaceutycznej poprzez sterylne spawanie opakowania transferowego o pojemności 1 litra do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym.</li>
	<li>Wymieszaj komórki w pozostałych 200 ml i weź 0,5 ml próbki do zliczenia komórek i pomiaru żywotności za pomocą barwienia AO-PI. Jeśli liczba komórek wynosi ≥109, podzielić jedną kolbę na dwie kolby i napełnić każdą kolbę do objętości 1 l AIM-V uzupełnionym 10% ludzką surowicą AB. Jeśli liczba komórek wynosi <109, nakarm komórki świeżym litrem pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB.</li>
	<li>Powtórzyć krok 3.6 dla wszystkich kolb i umieścić je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Powtarzaj kroki 3.4-3.7 co 3 do 4 dni.</li>
</ol>
4. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Pod koniec 10 dni w kokulturze należy zebrać wszystkie kolby bioreaktora. Zbierz po 1 kolbie bioreaktora na raz i zbierz wszystkie komórki w opakowaniu transferowym o odpowiedniej wielkości. Sterylnie zespawać pakiet transferowy do czerwonej linii bioreaktora w układzie zamkniętym i użyć pompy farmaceutycznej do przeniesienia komórek do pakietu transferowego.</li>
	<li>Usunąć następujące próbki kontroli jakości: 1% produktu leczniczego (DP) dla sterylności przez posiew krwi i barwienie metodą Grama; 0,5 ml dla zliczania i żywotności komórek przy użyciu AO/PI; 5-10 × 106 komórek do cytometrii przepływowej (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1 dla strategii bramkowania); 0,5 ml dla endotoksyny; 0,5 ml dla barwienia metodą Grama; 106 komórek wzbogaconych o 10 ml zużytej pożywki do badania Mykoplazmy.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj komórki w roztworze zrównoważonego roztworu krystaloidu + 0,5% HSA o stężeniu 200-500 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić je ponownie w docelowej objętości 100-300 ml zrównoważonego roztworu krystaloidu + 0,5% HSA.</li>
</ol>
5. Testowanie wersji
<ol>
	<li>Przeprowadzić badania kontroli jakości limfocytów T γδ DP pod kątem: czystości i tożsamości metodą cytometrii przepływowej (żywe/martwe, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); żywotności przez barwienie AO/PI; endotoksyny; Badanie mykoplazmy metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR); bezpłodność przez barwienie metodą Grama oraz tlenowe i beztlenowe posiewy krwi; resztkowy test K562 metodą cytometrii przepływowej (CD3-CD16-CD56-CD71+).</li>
</ol>

<ol><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%3A+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li>
<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li>
<li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment%2C+risk+factors%2C+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li>
<li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph%2B+leukemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700(2011).</li>
<li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3%CE%B4+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-%CE%B1%CE%B2%2B%2FCD19%2B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li>
<li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+T+cell+receptor%3A+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li>
<li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+V%CE%B39V%CE%B42+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Laboratorium Terapii Komórkowej Moffit opracowało protokół z dwufazową ekspansją limfocytów T γδ o wysokiej czystości do stosowania jako DP w badaniach klinicznych. Protokół ten zapewnia metodę produkcji zgodnie z wytycznymi cGMP w zamkniętym systemie, który daje wysoce czystą limfocyt T γδ DP, która jest z powodzeniem aktywowana i namnażana przez kwas zoledronowy i aAPC WCB. Protokół ten został zatwierdzony przez FDA do produkcji allogenicznego limfocytu T γδ DP dla pacjentów z AML. Korzystając ze zdrowych dawców, udało nam się powiększyć małą populację limfocytów T γδ dawcy w ciągu zaledwie 7 dni z 2,06 ± 0,45% do 54,45 ± 28,34%. Po 7-dniowej ekspansji kwasem zoledronowym zaobserwowano, że donor 2 miał wzrost populacji NK.
Kwas zoledronowy hamuje syntazę difosforanu farnezylu (FDPS) w monocytach, co z kolei prowadzi do akumulacji pirofosforanu izopentenylu (IPP), co jest skorelowane ze znacznym wzrostem proliferacji limfocytów T i naturalnych komórek NK 7,8,9. Ta zwiększona populacja NK utrudniadrugą fazę ekspansji za pomocą aAPC, ponieważ aAPC przyczynią się tylko do dalszej ekspansji komórek NK. Z tego powodu kryteria dawstwa zostały zmodyfikowane tak, aby wykluczyć dawców o wysokiej populacji NK. Po wyczerpaniu limfocytów T αβ, limfocyty T γδ zostały dodatkowo wzbogacone do 76,61 ± 27,51%. Ten unikalny protokół obejmuje drugą ekspansję wykorzystującą aAPC wyprodukowane przez Moffit do celowania w receptory CD8, CD28 i CD127L w komórkach T γδ. Ta druga faza ekspansji z aAPC dała DP z ≥65% dla limfocytów T CD3 + TCR γδ +, ≤1% TCRαβ T i <35% komórek NK CD3-CD16 + CD56 +. Ze względu na zastosowanie transporterów opancerzonych pochodzących z K562 konieczne było wykazanie, że stanowią one <1% produktu końcowego.
Firma Moffit CTF opracowała test cytometrii przepływowej stosowany jako kryteria uwalniania do pomiaru procentu pozostałych komórek K562 w końcowym DP. Ten test cytometrii przepływowej łagodzi wszystkie problemy związane z wykorzystaniem antygenów powierzchniowych komórek do identyfikacji komórek K562. Ponieważ aktywowane limfocyty T mogą wyrażać CD71, opracowaliśmy strategię wykluczenia wszystkich limfocytów T i komórek NK poprzez bramkowanie na populacjach CD3-CD56- i CD16, a następnie badanie komórek CD71 +, które byłyby wyłącznie komórkami K562. Protokół ten pokazuje, że limfocyt T γδ DP daje 0,48 ± 0,42% pozostałych komórek K562 i spełnia wszystkie kryteria uwalniania ≥70% żywotności, ujemności Mykoplazmy metodą PCR, braku organizmów widocznych w barwieniu metodą Grama, ≤2 EU/ml endotoksyny i braku końcowej (14 dni) sterylności posiewu krwi we wzroście.

Nawrót białaczki jest główną przyczyną śmiertelności po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (HCT) u pacjentów z AML1,2,3. Lepsze przeżycie wolne od białaczki odnotowano wraz ze zwiększonym odzyskiwaniem limfocytów T γδ we krwi po HCT bez zwiększonego ryzyka choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD)4. Zdolność limfocytów T γδ do rozpoznawania antygenów w sposób niezależny od MHC i rozwijania silnych funkcji cytolitycznych i efektorowych podobnych do Th1 sprawia, że ta niewielka subpopulacja limfocytów T jest idealna do leczenia pacjentów z AML poddawanych przeszczepowi allogenicznemu zagrożonych nawrotem5. Biorąc pod uwagę, że limfocyty T Vγ9Vδ2 stanowią niewielki podzbiór limfocytów T w zakresie od 0,5% do 5% limfocytów T na peryferii6, postanowiliśmy stworzyć solidny system do rozszerzenia tej rzadkiej populacji komórek krwi w celu osiągnięcia potencjalnie terapeutycznych dawek do badań klinicznych.
Chociaż innym udało się rozwinąć limfocyty T γδ za pomocą kwasu zoledronowego, a nawet aAPC, my opracowaliśmy proces, który potencjalnie może zwiększyć limfocyty T γδ o 229 749 razy. Ekspansja jest dwufazowa: najpierw limfocyty uzyskuje się przez elutriację za pomocą przyrządu do separacji. Sprzęt zapewnia zamknięty system, który umożliwia separację komórek na podstawie ich rozmiaru, kształtu i gęstości za pomocą wirowania przeciwprądowego. Po wzbogaceniu na limfocyty, selektywną ekspansję limfocytów T Vγ9Vδ2 uzyskuje się poprzez leczenie kwasem zoledronowym i IL-2 przez 7 dni. Bezpośrednio po tym zabiegu limfocyty T TCR-αβ są wyczerpywane za pomocą technologii mikrokulek, co pozwala na późniejszą ekspansję limfocytów T γδ za pomocą aAPC pochodzących z K562.
Do walidacji procesu użyto tylko 5 × 106 limfocytów T γδ ekspandowanych kwasem zoledronowym do ekspansji kokultury fazy 2 z aAPC. W tej drugiej fazie ekspansji limfocyty T γδ są aktywowane przy użyciu aktualnego Banku Komórek Roboczych (WCB) zgodnego z Dobrymi Praktykami Produkcyjnymi (cGMP) genetycznie modyfikowanych aAPC pochodzących z K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) wyprodukowany w Moffitt. Uzasadnienie tej dwufazowej ekspansji opiera się na zdolności kwasu zoledronowego do hamowania syntazy difosforanu farnezylu (FDPS) w monocytach, co prowadzi do akumulacji pirofosforanu izopentenylu, który bezpośrednio stymuluje komórki Vγ2Vδ2. W drugiej fazie ekspansji aAPC pochodzące z K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) zapewniają silną stymulację wszystkich limfocytów T. Jednak produkt komórkowy został już wzbogacony o limfocyty T γδ, co spowodowało silną ekspansję limfocytów T γδ.
Dzięki zastosowaniu specjalnego sprzętu i kolb, proces ten jest funkcjonalnie zamkniętym systemem, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto bioreaktor o pojemności 1 l w systemie zamkniętym umożliwia maksymalny wzrost i ekspansję komórek w całkowitej objętości 1 l podłoża przy minimalnym zapotrzebowaniu na karmienie. Zaletą metody Moffitt jest to, że zapewnia ona szybki, powtarzalny i wysoce wykonalny system GMP do wytwarzania wysoce czystego, pochodzącego od dawcy produktu z komórek T γδ do podawania allogenicznego. Metodę tę można zastosować do każdego badania klinicznego, które ma na celu wykorzystanie ludzkich limfocytów T γδ eksprymujących receptory limfocytów T Vγ2Vδ2 jako immunoterapii adoptywnej w celu pośredniczenia w odporności na drobnoustroje i nowotwory u pacjentów z rakiem z częściową i całkowitą remisją. Ponadto stanowi solidną platformę do rozwoju i produkcji limfocytów T γδ z dodatnim receptorem antygenu chimerycznego (CAR+).

<table><tbody><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli</td><td>R& D</td><td>285-GMP</td><td></td></tr><tr><td>Albumina ludzka 25%</td> <td>Grifolis</td><td>65483-16-071</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte A</td><td>Fisher</td><td>2B2543Q</td><td></td></tr><tr><td>Kwas zoledronowy (Zometa)</td> <td>Hos pira</td><td>4215-04-8</td><td>Lek zatwierdzony przez FDA</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>CS10</td><td>ROZTWORY BIOLIFE</td><td>210374</td><td></td></tr><tr><td>3 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>20 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 100 ml</td><td>JMS</td><td>992861</td><td></td></tr><tr><td>18g Igła</td><td>Fisher</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials 1,8 ml</td><td>Fisher</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 5 ml</td><td>Fisher</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 50 ml</td><td>Fisher</td><td>1367610Q</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 100 ml</td><td>Fisher</td><td>07-200-620</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowa</td><td>Fisher</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>250 ml stożkowa</td><td>Fisher</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>600 ml Pakiet transferowy</td><td>TERUMO BCT INC</td><td>1BBT060CB71</td><td></td></tr><tr><td>4" Zestaw do transferu osocza</td><td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td><td>03-220-90</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw węży Elutra</td><td>TerumoBCT</td><td>70800</td><td></td></tr><tr><td>100 MCS GREX</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td>81100-CS</td><td></td></tr><tr><td>Ashton Sterylny system</td> <td>dozowania płynów PumpmaticFisher Scientific</td><td>22-246660</td><td></td></tr><tr><td>Osłona pompy akacjowej</td><td>MPS Medical In</td><td>17789HP3MLL</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-070-525</td><td></td></tr><tr><td>Dornase Alpha</td><td>Genentech, Inc</td><td>50242-100-40/186-0055</td><td>Zatwierdzony przez FDA lek</td></tr><tr><td>1000 ml 0,22 um Filtr</td><td>Fisher</td><td>157-0020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr krwi 170um</td><td>B. Zestaw węży Braun</td><td>V2500</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACs</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-090-719</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS TCR&alpha;/&beta; Zestaw</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-021-301</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw krwi grupy Y</td><td>Fenwal</td><td>FWL4C2498H</td><td></td></tr><tr><td>75 ml Kolba</td><td>Fisher</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Prometheus</td><td>65483-116-071</td><td>Zatwierdzony przez FDA lek</td></tr><tr><td>AIM-V</td><td>Fisher</td><td>0870112BK</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica AB</td><td>Gemini Bio-Product</td><td>100H41T</td><td></td></tr><tr><td>3-litrowy pakiet transferowy</td><td>Independent Medical Associates</td><td>T3109</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>5991040</td><td></td></tr><tr><td>CF-250</td><td>KOLBio</td><td>CF-250</td><td></td></tr><tr><td>Elutra</td><td>TERUMOBCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GatheRex Płynna obsługa, pompa do zbierania komórek</td><td>WILSON WOLF MFG Inkubator</td> CO2 CORP <td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Vios</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekspansja i wzbogacanie limfocytów t gamma-delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Chociaż limfocyty T Vγ9Vδ2 stanowią niewielki podzbiór limfocytów T, ta populacja jest poszukiwana ze względu na jej zdolność do rozpoznawania antygenów w sposób niezależny od głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) i rozwijania silnej funkcji efektora cytolitycznego, co czyni ją idealnym kandydatem do immunoterapii raka. Ze względu na niską częstotliwość limfocytów T Gamma-Delta (γδ) we krwi obwodowej, opracowaliśmy skuteczny protokół do znacznego rozszerzenia produktu leczniczego limfocytów T γδ o wysokiej czystości do pierwszego zastosowania u ludzi allogenicznych limfocytów T γδ u pacjentów z ostrą białaczką szpikową (AML). Wykorzystując aferezę zdrowego dawcy jako allogeniczne źródło komórek, limfocyty izoluje się za pomocą zwalidowanego urządzenia do metody wirowania przeciwprądowego polegającej na rozdzielaniu komórek według wielkości i gęstości. 
Wykorzystywana jest frakcja bogata w limfocyty, a limfocyty T γδ są preferencyjnie aktywowane kwasem zoledronowym (zatwierdzonym przez FDA) i interleukiną (IL)-2 przez 7 dni. Po preferencyjnej ekspansji limfocytów T γδ stosuje się kliniczne urządzenie do magnetycznej separacji komórek i kulki TCRαβ w celu wyczerpania zanieczyszczających receptora komórek T (TCR)αβ limfocytów T. Wysoko wzbogacone limfocyty T γδ przechodzą następnie drugą ekspansję przy użyciu zmodyfikowanych sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC) pochodzących z komórek K562 - genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji jednołańcuchowego zmiennego fragmentu (scFv) dla CD3 i CD28, 41BBL (CD137L) i IL15-RA - wraz z kwasem zoledronowym i IL-2. Wysiew wszystkich 7 wzbogaconych limfocytów T γδ w kokulturze z aAPC ułatwia wytwarzanie wysoce czystych limfocytów T γδ o średniej krotnej ekspansji > 229 000 razy ze zdrowej krwi dawcy.

Prezentowany jest protokół ekspansji produktu leczniczego limfocytów T Gamma-Delta (γδ). Limfocyty są izolowane przez elutriację i wzbogacane γδ kwasem zoledronowym i interleukiną-2. Limfocyty T alfa-beta są wyczerpywane za pomocą klinicznego urządzenia do separacji magnetycznej. Komórki γδ są hodowane wspólnie z pochodzącymi z K562, sztucznymi komórkami prezentującymi antygen i ekspandowane.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Limfocyty T Gamma-Delta mają silne działanie cytotoksyczne przeciwko wielu typom raka, w tym ostrej białaczce szpikowej. Jednak krążące limfocyty T Gamma-Delta we krwi są stosunkowo rzadkie, szczególnie u pacjentów z nowotworami złośliwymi. Wlew pochodzących od dawcy, ekspandowanych X-vivo limfocytów T Gamma-Delta, daje nadzieję na zmniejszenie nawrotów białaczki i poprawę przeżycia pacjentów z ostrą białaczką szpikową.Proponowana metoda pozwala osiągnąć ponad 200 000-krotną ekspansję limfocytów T Gamma-Delta, osiągając terapeutycznie istotne dawki wysoce czystego produktu z limfocytów T Gamma-Delta, w trzech prostych krokach. Tak więc ligowanie IEL do ekspansji, zubożenie limfocytów T alfa beta przez sortowanie magnetyczne i wtórną ekspansję bounty za pomocą AAPC. Proponowana metoda rozszerza użyteczność limfocytów T Gamma-Delta w chorobach takich jak rak i choroby autoimmunologiczne poprzez szybkie tworzenie dużej liczby komórek, które można wykorzystać od ręki.Proces ten można zaadaptować do namnażania komórek Gamma-Delta przy użyciu różnych metod wzbogacania i dodawania dodatkowych manipulacji, takich jak transdukcja. Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona w Los Angeles przez technologa terapii komórkowej, trzech z mojego laboratorium. Rozpocząć od elutriacji próbki produktu musującego na urządzeniu wirującym przeciwprądowym, przy użyciu pierwotnego podłoża ze zbalansowanego roztworu soli Hanksa, z 1% albuminą surowicy ludzkiej i wtórnym podłożem roztworu soli lub DPBS.Przy prędkości wirowania elutriacji wynoszącej 900 razy G zbieraj frakcje na podstawie natężenia przepływu i czasu. Pobrać próbki z frakcji drugiej, aby przeprowadzić badanie sterylności, liczbę komórek i fenotypowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Z frakcji drugiej rozwiń czystą frakcję limfocytów komórek w hodowli 10 razy 10 do szóstych komórek na centymetr kwadratowy, z pięcioma mikromolami na litr kwasu zoledronowego i 300 jednostkami na mililitr interleukiny-2 w litrowym bioreaktorze z systemem zamkniętym.Inkubuj system przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji pobrać komórki z jednolitrowej kolby bioreaktora z systemem zamkniętym. W tym celu należy sterylnie przyspawać jednolitrowe opakowanie transferowe do czerwonej linii bioreaktora i użyć odpowiedniej pompy farmaceutycznej do przeniesienia komórek do pakietu transferowego.Pobrać próbki do badania sterylności zużytego podłoża, liczby komórek i fenotypowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Z pozostałej próbki ponownie zawiesić komórki w ilości od pięciu razy 10 do ośmiu komórek na mililitr, w buforze PBS-EDTA zawierającym 0,5% HSA i biotynylowany receptor limfocytów T, przeciwciało specyficzne dla alfa beta. I inkubuj komórki w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, potrząsając.Po 15 minutach przemyć komórki 600 mililitrami buforu PBS-EDTA zawierającego 0,5 HSA i odwirować w temperaturze od 200 do 500 razy G przez 15 minut, w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsjusza, w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Następnie ponownie zawiesić komórki w ilości około pięć razy 10 do ósmych komórek na mililitr, w buforze PBS-EDTA zawierającym 0,5% HSA i 7,5 mililitra na fiolkę mikrogranulek specyficznych dla antybiotyny. Jak opisano wcześniej, inkubować komórki przez wstrząsanie, a następnie odwirować zawiesinę komórkową w celu usunięcia niezwiązanych mikrogranulek.Ponownie zawieś sześć razy od 10 do siódmych komórek na mililitr w buforze PBS-EDTA z 0,5% HSA. Zbierz je do torby transferowej. Zwiększ go zgodnie z instrukcjami instrumentu.Następnie zainstaluj zestaw rurek w urządzeniu do separacji komórek magnetycznych klasy klinicznej. Umieścić opakowania z buforem PBS-EDTA, a pakiet transferowy z produktem komórkowym w urządzeniu. W celu wyczerpania znakowanych limfocytów T alfa beta należy wybrać protokół zubożenia 1.2 w oprogramowaniu.Następnie odwirować produkt komórkowy, aby zebrać frakcję docelową wzbogaconą w limfocyty T Gamma-Delta. Ponownie zawiesić pobrane komórki w pożywce, uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB. Wykonaj fenotypowanie liczby komórek i cytometrii przepływowej po wyczerpaniu.Doprowadź komórki do końcowego stężenia około jeden razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Napromieniować pięć razy 10 do siódmych komórek prezentujących sztuczny antygen lub AAPC na kolbę, w temperaturze 100 grejów na przyrządzie generującym promieniowanie rentgenowskie. Przygotować kokulturę, umieszczając napromieniowane AAPC i limfocyty T Gamma-Delta w stosunku 10 is do jednego, w jednolitrowych kolbach bioreaktora z systemem zamkniętym.Z jednym litrem pożywki hodowlanej, uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB, wysiewa się do 10 kolb. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 10 dni, z badaniem przesiewowym poziomu glukozy i mleczanu co trzy do czterech dni przy użyciu pasków, glukozy i glukometru mleczanu. Jeśli poziom glukozy spadnie do 215 miligramów na decylitr, zmniejsz objętość w kolbie do 200 mililitrów.Wymieszaj komórki w pozostałych 200 mililitrach pożywki i usuń 0,5 mililitra próbki do zliczenia komórek i pomiaru żywotności przez barwienie pomarańczą akrydynową lub jodkiem propidyny. Jeżeli liczba komórek jest równa lub większa niż 10 do dziewiątej, podzielić zawartość jednej kolby na dwie części i napełnić każdą kolbę do jednego litra pożywką AIM-V, uzupełnioną 10% ludzką surowicą AB. Jeśli liczba komórek jest mniejsza niż 10 do dziewiątej, nakarmić komórki świeżym litrem pożywki hodowlanej, uzupełnionej 10% ludzką surowicą AB i zwrócić kolby do inkubatora.Po upływie 10 dni w kokulturze należy pobrać kolby bioreaktora pojedynczo i wciągnąć wszystkie komórki do opakowania transferowego o odpowiedniej wielkości. Po usunięciu próbek z kontroli jakości odwirować komórki w temperaturze od 200 do 500 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Umyj komórki w roztworze zrównoważonego roztworu krystaloidów, uzupełnionego 0,5% HSA w ilości 200 do 500 razy G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Ponownie zawiesić je w docelowej objętości od 100 do 300 mililitrów zbilansowanego roztworu krystaloidu z 0,5% HSA. Komórki oddzielone od frakcji odwirowania po przepływie przeciwprądowym. Dwa dały czystą populację limfocytów, o doskonałej średniej żywotności 95,80%Specyficzna ekspansja limfocytów T gamma-delta z kwasem zoledronowym zależała od początkowego procentu komórek NK obecnych we frakcji limfocytów po elutriacji.Wzbogacenie substancji leczniczej komórek T Gamma-Delta w zubożenie receptora alfa beta komórek T było konsekwentne. Produkt leczniczy z komórek T Gamma-Delta, wytwarzany od trzech zdrowych dawców, spełnił kryterium uwalniania mniej niż 1% receptora komórek T alfa beta dodatnich limfocytów T, ze średnią 0,11% limfocytów B CD20 dodatnich i 0,00% receptora komórek T alfa beta dodatnich. Średni odsetek komórek NK w produkcie końcowym wynosił około 17,06%, które spełniały kryterium uwalniania poniżej 35%Barwienie powierzchni komórek i analiza cytometrii przepływowej zostały wykorzystane do scharakteryzowania tożsamości, czystości i zanieczyszczeń procesowych substancji leczniczej i produktu leczniczego.Druga reekspansja, osiągnięta dzięki wspólnej hodowli AAPC i substancji leczniczej z komórek T gamma-Delta, pozwoliła na wytworzenie produktu leczniczego z komórek T Gamma-Delta, który spełniał wszystkie kryteria uwalniania. Patony, które wzbogacają populację limfocytów T, wpływają na ekspansję i charakterystykę produktu. Wymagane jest wystarczające rozważenie i zbadanie metod wzbogacania przed rozpoczęciem procesu ich wzbogacania.

expansion-enrichment-gamma-delta-t-cells-from-apheresed-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Opisano metodę ekspansji limfocytów γδ T z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC). Limfocyty γδ T pochodzące z PBMC są stymulowane i namnażane przy użyciu zoledronianu oraz interleukiny-2 (IL-2). Wielkoskalowa ekspansja limfocytów γδ T może zostać zastosowana w autologicznej immunoterapii komórkowej nowotworów.

Ekspansja limfocytów T $\gamma\delta$ z ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu zoledronianu

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

W niniejszej pracy opisujemy metodę aktywacji i ekspansji ludzkich komórek NKT z populacji zmieszanych limfocytów T przy użyciu sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC). Wykorzystanie aAPC opartych na CD1d zapewnia zestandaryzowaną metodę generowania wysokiej liczby funkcjonalnych komórek NKT.

Aktywacja i ekspansja komórek Natural Killer T (NKT) za pośrednictwem sztucznych komórek prezentujących antygen (aAPC)

Ten film opisuje protokół izolacji limfocytów T CD8+ specyficznych dla rzadkiego antygenu za pomocą magnetycznych komórek prezentujących sztuczny antygen oparty na nanocząstkach (aAPC) funkcjonalizowanych antygenowymi peptydami MHC-Igs i przeciwciałami anty-CD28. Interakcja aAPC z limfocytami T CD8 + specyficznie eksprymującymi receptory limfocytów T ukierunkowanych na peptydy antygenowe, a następnie ich ekspansję in vitro, powoduje wzbogacenie i ekspansję tej populacji limfocytów T CD8 +.

Wzbogacanie i ekspansja limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Poznaj metodę ekspansji limfocytów T gamma-delta z aferezy dla terapii przeciwnowotworowej. Protokół umożliwia uzyskanie czystego produktu komórkowego z ponad 200 000-krotnym wzbogaceniem.

Ekspansja i wzbogacanie limfocytów T gamma-Delta (γδ) z aferezowanego produktu ludzkiego

Przeglądaj więcej filmów