System OnePot PURE bezkomórkowy

Ten protokół dla rekombinowanego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek, powszechnie znany jako system PURE, wykorzystuje hodowlę komórek i oczyszczanie komórek w celu usprawnienia wymaganego oczyszczania białek. To znacznie minimalizuje wymagania czasowe i pracochłonne. Metoda OnePot okazała się nie tylko opłacalna, ale także efektywna czasowo.

Skraca to czas przygotowania z kilku tygodni do trzech dni roboczych. To sprawia, że platforma bezkomórkowa PURE jest dostępna dla większej liczby laboratoriów na całym świecie i pomaga wdrożyć tę naprawdę potężną platformę do syntetycznej biologii bezkomórkowej. Zanim zaczniesz, upewnij się, że wszystkie szczepy dobrze wyrażają swoje białko.

Na początek przygotuj kolumnę do oczyszczania białka OnePot zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym przy użyciu dwóch mililitrów żywicy Sepharose, a następnie napełnij kolumnę siarczanem niklu. Przygotuj kultury starterowe, łącząc 20 mililitrów pożywki LB z 20 mikrolitrami ampicyliny. Dodaj 300 mikrolitrów pożywki do 35 dołków sterylnej płytki z 96 głębokimi dołkami.

Zaszczep każdy z nich odpowiednim szczepem, z wyjątkiem współczynnika wydłużenia termoniestabilnego lub EFTU, i uszczelnij płytkę oddychającą membraną. W przypadku hodowli EFTU należy zaszczepić trzy mililitry ampicyliny zawierającej pożywkę LB w 14-mililitrowej probówce hodowlanej z zatrzaskową nasadką. Około trzech mililitrów kultury EFTU wystarcza na jedną kulturę ekspresji OnePot.

Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 260 obrotów na minutę przez noc. Następnego dnia przenieś 500 mililitrów pożywki LB i 500 mikrolitrów ampicyliny do sterylnej kolby z przegrodą. Zaszczepić kulturę OnePot PURE 1 675 mikrolitrami kultury EFTU i 55 mikrolitrami każdej z kultur z płytki studzienki głębinowej.

Inkubuj kulturę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 260 obrotów na minutę lub do momentu, gdy gęstość optyczna kultury osiągnie 0,2 do 0,3. Wywołaj kulturę za pomocą 500 mikrolitrów 0,1 milimolowego IPTG i hoduj przez dodatkowe trzy godziny. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 3 220 razy G przez 10 minut i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

W trzecim dniu zmierz ilości potrzebnych do ich oczyszczenia i dodaj TCEP do wszystkich z nich, jak wskazano w tekście. Przechowuj pozostałe bez TCEP w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przyszłego oczyszczania. Zrównoważyć naładowaną kolumnę z 30 mililitrami buforu A. Po przejściu 25 mililitrów buforu A zamknij kolumnę od dołu.

Rozmrozić komórki i użyć pipety serologicznej do ponownego zawieszenia osadu komórkowego w 7,5 mililitra buforu A. Zlikwiduj komórki za pomocą sondy o mocy 130 W. Jeśli sonikacja się powiedzie, roztwór stanie się ciemniejszy. Upewnij się, że ogniwa pozostają na lodzie i umieść sondę wystarczająco głęboko, nie dotykając rurki.

Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 21, 130 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i utrzymywać lizat na lodzie. Dodać supernatant do kolumny zrównoważonej. Zamknij kolumnę od góry i upewnij się, że nie ma wycieków.

Inkubować kolumnę przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod obrotem za pomocą rotatora rurowego. Eluować niezwiązane składniki z kolumny i przemyć 25 mililitrami buforu A. Przemyć kolumnę 25 mililitrami 25-milimolowego buforu imidazolowego. Eluować białka za pomocą pięciu mililitrów 450-milimolowego buforu imidazolowego i utrzymywać wyluzowane białka na lodzie przez cały czas.

Rozcieńczyć eluat 25 mililitrami buforu HT i utrzymać mieszaninę na lodzie. Dodaj 15 mililitrów do 15-mililitrowego filtra odśrodkowego i skoncentruj do objętości 1,5 mililitra. Dodaj pozostałe 15 mililitrów do filtra ze stężonym roztworem i ponownie skoncentruj do 1,5 mililitra.

Dodać 10 mililitrów buforu HT do zagęszczonej próbki i zagęścić do jednego mililitra. Odzyskać zagęszczoną próbkę i dodać równą ilość buforu podstawowego B i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Podczas wymiany bufora przywróć kolumnę zgodnie z opisem w tekście.

Czwartego dnia zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Zagęścić próbkę z 0,5 mililitra trzykilodaltonowego filtra odśrodkowego do 20 miligramów na mililitr. Sprawdź skład białka OnePot PURE za pomocą karty charakterystyki.

Rozcieńczyć 2,5 mikrolitra próbki 7,5 mikrolitra wody zmieszanej z 10 mikrolitrami dwóch X Laemmli, a następnie załadować pięć mikrolitrów i 2,5 mikrolitrów próbek na żel. Uruchom stronę SDS zgodnie z opisem w tekście. Wypełnij stężenie i długość DNA w odpowiednich żółtych komórkach w arkuszu kalkulacyjnym, używając od dwóch do 10 nanomolów DNA do reakcji.

Wypełnij żądaną całkowitą objętość reakcji w mikrolitrach. Wyjmij wymagane odczynniki z zamrażarki i rozmroź je na lodzie. Następnie odpipetuj obliczone ilości wody, DNA i roztworu energetycznego po jednej stronie probówki do PCR lub w jednym rogu studzienki na płytce z 384 dołkami.

Odpipetować obliczone ilości białka i roztworu rybosomu na drugą stronę probówki do PCR lub w przeciwległy róg płytki 384-dołkowej. Wiruj przez około 30 sekund, aby połączyć składniki reakcji. Aby zapobiec parowaniu podczas eksperymentów z czytnikiem płytek, dodaj 35 mikrolitrów płynnego wosku i uszczelnij płytkę przezroczystym uszczelniaczem.

Inkubować przez minimum trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu odczytu na czytniku płytek należy co dwie minuty mierzyć intensywność fluorescencji na wymaganej długości fali. Udana nadekspresja we wszystkich poszczególnych szczepach użytych później do preparatu białkowego OnePot jest pokazana tutaj.

Ogólny skład końcowego roztworu białkowego OnePot PURE został przeanalizowany za pomocą karty charakterystyki. Zauważalne jest, że EFTU jest obecny w wyższym stężeniu w porównaniu z innymi białkami, zgodnie z oczekiwaniami. Wydajność syntezy roztworu białkowego OnePot w połączeniu z rybosomami znakowanymi lub nieznakowanymi Hisem analizowano, monitorując fluorescencję eGFP w czasie.

Poziomy ekspresji trzech różnych białek znakowanych za pomocą systemu znakowania tRNA in vitro z zieloną listą lub barwienia Kumasi analizowano na żelu SDS. Dla funkcjonalnego systemu PURE absolutnie kluczowe jest, aby wszystkie szczepy dobrze wyrażały swoje białka. Technika ta ułatwia wdrożenie systemu PURE do inżynierii systemów biologicznych, umożliwiając rozwój nowatorskich sieci genetycznych, diagnostyki molekularnej, terapii i zestawów edukacyjnych.