Name: System OnePot PURE bezkomórkowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę OnePot PURE do szybkiej ekspresji białek bezkomórkowej. Technika skraca czas przygotowania z kilku tygodni do trzech dni, ułatwiając dostęp do platformy PURE w badaniach z zakresu biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach grantu Unii Europejskiej Horyzont 2020 na badania i innowacje 723106, grantu szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (182019) oraz EPFL.

<ol><li>Laohakunakorn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 213(2020).</li>
<li>Laohakunakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+systems%3A+a+proving+ground+for+rational+biodesign%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free systems: a proving ground for rational biodesign.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788(2020).</li>
<li>Cho, E., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalizing+cell-free+systems%3A+toward+creating+life-like+artificial+cells+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmentalizing cell-free systems: toward creating life-like artificial cells and beyond.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2881-2901 (2020).</li>
<li>Gaut, N. J., Adamala, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+natural+cell+elements+in+synthetic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Reconstituting natural cell elements in synthetic cells.</a> Advanced Biology (Weinh). 5 (3), 2000188(2021).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Li, J., Gu, L., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cell-free+RNA+and+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved cell-free RNA and protein synthesis system.</a> PLoS One. 9 (9), 106232(2014).</li>
<li>Kazuta, Y., Matsuura, T., Ichihashi, N., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+milligram+quantities+of+proteins+using+a+reconstituted+in+vitro+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Synthesis of milligram quantities of proteins using a reconstituted in vitro protein synthesis system.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 118 (5), 554-557 (2014).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+limiting+factors+of+the+protein+synthesis+using+recombinant+elements+%28PURE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Translation%22%5BJournal%5D)">Dissecting limiting factors of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) system.</a> Translation. 5 (1), Austin, Tex. 1327006(2017).</li>
<li>de Maddalena, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreA+and+GreB+enhance+expression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+promoters+in+a+reconstituted+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthethic+Biology%22%5BJournal%5D)">GreA and GreB enhance expression of Escherichia coli RNA polymerase promoters in a reconstituted transcription-translation system.</a> ACS Synthethic Biology. 5 (9), 929-935 (2016).</li>
<li>Kuruma, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PURE+system+for+the+cell-free+synthesis+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The PURE system for the cell-free synthesis of membrane proteins.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1328-1344 (2015).</li>
<li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li>
<li>Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+by+pure+translation+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis by pure translation systems.</a> Methods. 36 (3), San Diego, Calif. 299-304 (2005).</li>
<li>Niwa, T., Kanamori, T., Ueda, T., Taguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+chaperone+effects+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of chaperone effects using a reconstituted cell-free translation system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 109 (23), 8937-8942 (2012).</li>
<li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+macromolecular+crowding+effects+on+protein+aggregation+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of macromolecular crowding effects on protein aggregation using a reconstituted cell-free translation system.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1113(2015).</li>
<li>Shimizu, Y., Ueda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PURE+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PURE technology.</a> Methods in molecular biology. 607, Clifton, N.J. 11-21 (2010).</li>
<li>Horiya, S., Bailey, J. K., Krauss, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glycopeptides+using+mRNA+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glycopeptides using mRNA display.</a> Methods in Enzymology. 597, 83-141 (2017).</li>
<li>Villarreal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microbial+consortia+enable+rapid+assembly+of+pure+translation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery.</a> Nature Chemical Biology. 14 (1), 29-35 (2018).</li>
<li>Wang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+in+vivo+His-tagging+of+enzyme+pathways+for+in+vitro+single-pot+multienzyme+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (2), 43-52 (2012).</li>
<li>Shepherd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Design+and+synthesis+of+a+30-cistron+translation-factor+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">De Novo Design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module.</a> Nucleic Acids Research. 45 (18), 10895-10905 (2017).</li>
<li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple%2C+robust%2C+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li>
<li>Ederth, J., Mandava, C. S., Dasgupta, S., Sanyal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-step+method+for+purification+of+active+his-tagged+ribosomes+from+a+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A single-step method for purification of active his-tagged ribosomes from a genetically engineered Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 37 (2), 15(2009).</li>
<li>Gesteland, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+ribonuclease+I+mutants+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of ribonuclease I mutants of Escherichia coli.</a> Journal of Molecular Biology. 16 (1), 67-84 (1996).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cogenerating+synthetic+parts+toward+a+self-replicating+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).</li>
<li>Matsuura, T., Kazuta, Y., Aita, T., Adachi, J., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+epistatic+interactions+among+the+components+constituting+the+protein+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying epistatic interactions among the components constituting the protein translation system.</a> Molecular Systems Biology. 5, 297(2009).</li>
<li>Libicher, K., Hornberger, R., Heymann, M., Mutschler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-replication+and+multicistronic+expression+of+large+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro self-replication and multicistronic expression of large synthetic genomes.</a> Nature Communications. 11 (1), 904(2020).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+cell-free+biological+networks+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Implementation of cell-free biological networks at steady state.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15985-15990 (2013).</li>
<li>Lavickova, B., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+partially+self-regenerating+synthetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A partially self-regenerating synthetic cell.</a> Nature Communications. 11 (1), 6340(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą, efektywną czasowo i kosztowo metodę przygotowania wszechstronnego systemu ekspresji PURE20 opartego na wzorcowym składzie15. Wykorzystując protokół wraz z dostarczonymi harmonogramami dziennymi (tabela 1), wszystkie składniki można przygotować w ciągu 1 tygodnia i uzyskać ilości wystarczające do przeprowadzenia reakcji do pięciuset 10 μl PUSTE. Ponieważ białka stosowane w tym protokole są nadmiernie eksprymowane z plazmidów o wysokiej liczbie kopii i mają niską toksyczność dla E. coli, obserwuje się dobre poziomy ekspresji dla wszystkich wymaganych białek (ryc. 1). Pozwala to na łatwą regulację szczepów, a tym samym składu białek w kokulturach, po prostu poprzez modyfikację proporcji szczepów inokulacyjnych20. Oprócz białek rybosomalnych, stężenie EF-Tu okazało się mieć fundamentalne znaczenie dla ekspresji6. Natomiast zmiany w stężeniu pozostałych składników białkowych miały stosunkowo niewielki wpływ na odporność systemu PURE 7,24. W związku z tym, dostosowując współczynnik inokulacji EF-Tu w odniesieniu do wszystkich pozostałych składników, można uzyskać skład porównywalny ze standardowym składem PURE i osiągnąć system PURE o podobnej wydajności20. Przygotowując roztwór białkowy, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie szczepy dobrze rosną i wykazują nadekspresję kodowanego białka po indukcji (ryc. 1).
Funkcja rybosomów ma kluczowe znaczenie dla ogólnej wydajności systemu PURE24. W tym protokole przedstawiono dwie różne metody przygotowania roztworu rybosomu, tj. oczyszczanie rybosomu bez znaczników i oczyszczanie rybosomu znakowane przez Hisa. Oczyszczanie rybosomów bez znaczników opiera się na chromatografii oddziaływań hydrofobowych, po której następuje wirowanie z poduszką sacharozy, co wymaga dostępu do systemu oczyszczania FPLC i ultrawirówki15. Natomiast metoda wykorzystująca rybosomy znakowane Hisem18 i oczyszczanie chromatograficzne z powinowactwem grawitacyjnym nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być wykonywana w większości laboratoriów. Ta ostatnia metoda przynosi zatem korzyści, takie jak prostota i dostępność. Zaobserwowaliśmy jednak znacznie niższą wydajność syntezy przy użyciu rybosomów znakowanych Hisem w OnePot PURE w porównaniu z wariantem bez znaczników (ryc. 3). W zależności od rodzaju aplikacji, ta niższa wydajność może być akceptowalna.
Rozwiązanie energetyczne dostarcza składniki o niskiej masie cząsteczkowej i tRNA niezbędne do napędzania reakcji TX-TL in vitro . Protokół ten stanowi receptę na typowe rozwiązanie energetyczne, które można łatwo dostosować w zależności od potrzeb użytkownika. Wraz z tRNA, NTP i fosforanem kreatyny, obfitość i stężenie jonów Mg2+ miały kluczowe znaczenie dla ogólnej wydajności systemu PURE8, ponieważ są one krytycznymi kofaktorami dla transkrypcji i translacji. W niektórych przypadkach miareczkowanie jonów może zatem znacznie poprawić ogólną wydajność PURE. Integralność DNA ma kluczowe znaczenie dla wydajności PURE. W ten sposób weryfikacja sekwencji regionu promotora, miejsca wiązania rybosomów i genu docelowego oraz zapewnienie odpowiedniego stężenia DNA (<2 nM) pomoże rozwiązać problemy, które mogą pojawić się podczas ustawiania reakcji PURE.
System PURE jest minimalnym systemem TX-TL, w związku z czym niektóre zastosowania mogą wymagać dodatkowych regulacji25. Mogą one obejmować włączenie różnych polimeraz RNA 9,26, białek opiekuńczych13 i czynników białkowych, takich jak EF-P lub ArfA8. Chociaż szczepy ekspresyjne dla tych białek mogą być włączone do kokultur, dodanie ich oddzielnie do przygotowanego systemu może zapewnić lepszą kontrolę wymaganych poziomów białka. Ponadto włączenie pęcherzyków jest niezbędne do produkcji białek błonowych10,11. Środowiska utleniające, a nie redukujące, oraz izomeraza wiązania dwusiarczkowego ułatwiają prawidłowe tworzenie wiązań dwusiarczkowych, które są na przykład wymagane dla białek wydzielniczych12.
Istotne jest, aby upewnić się, że żadne dodatkowe składniki nie zakłócają reakcji. Najważniejsze czynniki, na które należy zwrócić uwagę podczas ustawiania reakcji lub dodawania innych składników, są wymienione poniżej. Upewnij się, że nie są używane niekompatybilne ani nie są zaburzone stężenia jonów. W miarę możliwości unikaj roztworów zawierających glicerol, wysokie stężenia potasu, magnezu, jonów wapnia, osmolitów, pirofosforanu, antybiotyków lub EDTA. Na przykład zastąpienie buforu elucyjnego wodą podczas oczyszczania DNA może być korzystne, ponieważ EDTA jest powszechnym dodatkiem w tym buforze. Zaopatrzenie roztworów w dodatkowe ujemnie naładowane cząsteczki, takie jak NTP lub dNTP, wymaga dostosowania stężenia magnezu8, ponieważ ujemnie naładowane cząsteczki zachowują się jak czynniki chelatujące i wiążą dodatnio naładowane cząsteczki. Neutralne pH jest idealne dla tej reakcji. W związku z tym wszystkie składniki powinny być buforowane do odpowiedniego pH; Jest to szczególnie ważne w przypadku cząsteczek silnie kwaśnych lub zasadowych, takich jak NTP. Wreszcie, temperatura i objętość są kluczowymi parametrami reakcji. Aby osiągnąć dobry plon, należy zastosować temperaturę około 37 °C, ponieważ temperatury poniżej 34 °C znacznie obniżą plon27.
Należy zauważyć, że przed przygotowaniem OnePot PURE należy wziąć pod uwagę docelowe zastosowanie i związane z nim wymagania, takie jak objętość, czystość, łatwość modyfikacji oraz włączenie lub pominięcie składników. W przypadku wielu zastosowań system będzie doskonałym wyborem, ale inne mogą wymagać plonów, możliwości regulacji i innych czynników, których system OnePot nie może zapewnić. Niezależnie od tego, wprowadzony protokół będzie korzystny dla przygotowania każdego domowego systemu, ponieważ wszystkie krytyczne kroki takiego przygotowania są tutaj podsumowane.
Jedną z głównych zalet systemu OnePot jest jego kompatybilność z dostępnym na rynku systemem PURExpress, który zapewnia możliwość testowania funkcjonalności i integralności wszystkich komponentów z osobna poprzez sekwencyjną wymianę każdego komponentu PURExpress na jego odpowiednik OnePot. Zalety systemu OnePot PURE, takie jak możliwość przestrajania oraz łatwe, szybkie i ekonomiczne przygotowanie, sprawią, że bezkomórkowy TX-TL będzie dostępny dla większej liczby laboratoriów na całym świecie i przyczyni się do rozszerzenia wdrożenia tej potężnej platformy w bezkomórkowej biologii syntetycznej.

Systemy transkrypcyjno-translacyjne (TX-TL) bez komórek stanowią obiecującą platformę do badania i inżynierii systemów biologicznych. Zapewniają one uproszczone i regulowane warunki reakcji, ponieważ nie polegają już na procesach podtrzymujących życie, w tym na wzroście, homeostazie lub mechanizmach regulacyjnych1. W związku z tym przewiduje się, że systemy bezkomórkowe przyczynią się do badania systemów biomolekularnych, stworzą ramy do testowania racjonalnych strategii bioprojektowania2 i zapewnią podwozie dla przyszłej komórki syntetycznej3,4. W pełni rekombinowany system PURE oferuje szczególnie atrakcyjną obudowę ze względu na swój zdefiniowany i minimalistyczny skład, a także możliwość regulacji i strojenia5.
Od czasu powstania pierwszego funkcjonalnego, w pełni rekombinowanego systemu PURE w 2001 roku5, podjęto wysiłki w celu rozszerzenia limitów systemu i optymalizacji składu systemu w celu poprawy wydajności systemu6,7,8, pozwala na regulację transkrypcji9, membrane10,11 i synteza białek wydzielniczych12, oraz w celu ułatwienia składania białek13,14. Obecnie na rynku dostępne są trzy systemy: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB) i Magic PURE (Creative Biolabs). Systemy te są jednak kosztowne, ich dokładny skład jest zastrzeżony, a zatem nieznany, a możliwości adaptacji są ograniczone.
Systemy PURE przygotowane we własnym zakresie okazały się najbardziej opłacalną i możliwą do dostosowania opcją15,16. Jednak wymagane 37 etapów oczyszczania frakcji białkowych i rybosomów jest czasochłonne i żmudne. Podjęto kilka prób poprawy efektywności systemu PURE preparation17,18,19. Niedawno wykazaliśmy, że możliwa jest kokultura i kooczyszczanie wszystkich wymaganych białek nierybosomalnych obecnych w systemie PURE. Ta metoda OnePot okazała się opłacalna i efektywna czasowo, skracając czas przygotowania z kilku tygodni do 3 dni roboczych. W wyniku tego podejścia powstał system PURE o zdolności produkcji białek porównywalnej z dostępnym na rynku systemem PURExpress system20. W przeciwieństwie do poprzednich podejść mających na celu uproszczenie PURE preparation17,18,19, w podejściu OnePot wszystkie białka są nadal wyrażane w oddzielnych szczepach. Dzięki temu użytkownik może dostroić skład systemu OnePot PURE, po prostu pomijając lub dodając określone szczepy lub dostosowując objętość inokulacji, generując w ten sposób odpowiednio systemy dropout PURE lub zmieniając końcowe proporcje białka.
Przedstawiony tutaj protokół zawiera szczegółową metodę tworzenia systemu OnePot PURE, jak opisano wcześniej20, chociaż β-merkaptoetanol został zastąpiony tris(2-karboksyetylo)fosfiną (TCEP). Ponadto opisano dwie metody oczyszczania rybosomów: tradycyjne oczyszczanie rybosomów bez znaczników za pomocą interakcji hydrofobowej i poduszki sacharozy, zaadaptowane z Shimizu et al.15, oraz oczyszczanie rybosomów Ni-NTA oparte na Wang et al.18 i Ederth et al.21, ale znacznie zmodyfikowane. Ta ostatnia metoda dodatkowo ułatwia przygotowanie systemu PURE i sprawia, że jest on dostępny dla większej liczby laboratoriów, ponieważ wymagany jest tylko standardowy sprzęt laboratoryjny.
Protokół eksperymentalny podsumowuje przygotowanie wszechstronnego systemu TX-TL do wykorzystania w systemie PURE bez komórek, aby zapewnić prostą, dostrajalną, opłacalną platformę bezkomórkową, którą można przygotować przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w ciągu tygodnia. Oprócz wprowadzenia standardowego składu PURE, wskazujemy, jak i gdzie można go dostosować, koncentrując się przede wszystkim na krytycznych krokach w protokole w celu zapewnienia funkcjonalności systemu.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówek wirówkowych</td><td>VWR International</td><td>525-0309</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe czarne płytki testowe</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Prefabrykowane żele białkowe</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 50 ml</td><td>VWR International</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa polipropylenowa płytka DeepWell</td><td>Nunc</td><td>260252</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, 99,8 %</td> <td>Acros</td><td>222140010</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; kta purifier</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>oczyszczanie rybosomów bez znaczników</td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 0,5 ml - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09718-250G</td><td></td></tr><tr><td>Amon siarczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Condalab</td><td>6801</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Fluorescencyjny standard białkowy ThermoFisher</td><td></td><td>LC5928</td><td></td></tr><tr><td>Oddychaj-Easy&nbsp; membrana uszczelniająca</td><td>Diversified Biotech</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z poliwęglanu</td><td>Beckman</td><td>355631</td><td>oczyszczanie rybosomów bez znaczników</td></tr><tr><td>Chill-out Liquid Wax</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>CHO1411</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean & Koncentrator-25 (z pokrywą)</td><td>Zymo</td><td>ZYM-D4034-200TS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SantaCruz Biotech</td><td>sc-29089B</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Kolumny chromatograficzne</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03609-250G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind</td><td>VWR International / Eppendorf</td><td>525-0133</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 14 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z zatrzaskiem</td><td>Kolby 352051</td><td></td><td></td>Falcon</tr>, <tr><td>z przegrodą 1000 ml 4 przegrody, szkło borokrzemianowe</td><td>Scilabware</td><td>9141173</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTect Green Lys System etykietowania tłumaczeń in vitro</td><td>Promega</td><td>L5001</td><td>opcjonalnie</td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1541</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757-1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Butyl HP Kolumna GE</td><td>Healthcare</td><td>28411005</td><td>oczyszczanie rybosomów bez znaczników</td></tr><tr><td>IMAC Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0921-07</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21149.03</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Laemmli (2x), bufor do próbek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bulionowa lizogeniczna (LB)</td><td>AppliChem</td><td>A0954</td><td></td></tr><tr><td>Octan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0631</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Honeywell Fluka</td><td>63020-1L</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan niklu</td><td>Alfa Aesar</td><td>15414469</td><td></td></tr><tr><td>NTP</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion (2 U/&mikro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49601</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress Zestaw do syntezy białek in vitro</td><td>NEB</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>PURExpress&nbsp; Złącze Delta; &nbsp; Zestaw rybosomów</td><td>NEB</td><td>E3313S</td><td></td></tr><tr><td>Szybki start Bradford 1x odczynnik barwnikowy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Szybkoprzepływowe sterylne jednorazowe filtry próżniowe</td><td>ThermoFisher</td><td>564-0020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór RNazyA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td></td></tr><tr><td>SealPlate&nbsp; film</td><td>Excel Scientific</td><td>Z369659-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6203</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-karboksetylo)fosfina-chlorowodorek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547-10X1mL</td><td></td></tr><tr><td>Grubościenna rurka</td> <td>z poliwęglanuBeckman</td><td>355631</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td></td> Roche <td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Optima L-80</td><td>Beckman</td><td></td><td>oczyszczanie rybosomów bez znaczników Filtry</td></tr><tr><td>strzykawkowe Whatman GD/X</td><td>GE Whatman WHA68722504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

system onepot pure bezkomórkowy

OnePot PURE Cell-Free System

Zdefiniowany system transkrypcji i translacji PURE (synteza białek przy użyciu elementów rekombinowanych) stanowi atrakcyjną podstawę dla bezkomórkowej biologii syntetycznej. Niestety, dostępne na rynku systemy są kosztowne, a ich możliwość dostrajania jest ograniczona. Dla porównania, domowe podejście można dostosować do potrzeb użytkownika. Jednak przygotowanie domowych systemów jest czasochłonne i żmudne ze względu na konieczność rybosomów, a także 36 oczyszczania białek na średnią skalę. Usprawnienie oczyszczania białek poprzez kokulturację i kooczyszczanie pozwala zminimalizować wymagania czasowe i pracochłonne. Poniżej przedstawiamy łatwą, regulowalną, efektywną czasowo i kosztowo metodę produkcji wszystkich elementów systemu PURE w ciągu 1 tygodnia, przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Co więcej, wydajność OnePot PURE jest porównywalna z dostępnymi na rynku systemami. Metoda przygotowania OnePot PURE rozszerza dostępność systemu PURE na większą liczbę laboratoriów ze względu na swoją prostotę i opłacalność.

Powyższy protokół został opracowany, aby ułatwić wprowadzenie systemu bezkomórkowej transkrypcji i translacji (TX-TL) PURE w dowolnym laboratorium. Protokół zawiera szczegółowy opis przygotowania trzech odrębnych części systemu PURE: roztworu białek OnePot, rybosomów oraz roztworu energetycznego. Szczegółowy harmonogram dzienny, optymalizujący przebieg prac, przedstawiono w Tabeli 1. Przebieg prac jest zoptymalizowany pod kątem oczyszczania rybosomów z etykietą His; ramy czasowe mogą się nieznacznie różnić w przypadku oczyszczania rybosomów bez etykiet. Jedno przygotowanie zapewnia wystarczającą ilość systemu PURE dla minimum pięciuset reakcji o objętości 10 µL. Co więcej, przygotowane roztwory są stabilne przez ponad rok w temperaturze -80 °C i wytrzymują wielokrotne cykle zamrażania i odmrażania.
Odpowiednie poziomy nadekspresji dla wszystkich szczepów są kluczowe dla funkcjonalności końcowego roztworu białek. Rysunek 1 przedstawia pomyślną nadekspresję we wszystkich 36 poszczególnych szczepach wykorzystanych następnie do przygotowania białek metodą OnePot. Różnice w intensywności prążków nadeksprymowanych białek wynikały najprawdopodobniej z różnic w objętościach naniesionych próbek na żel SDS-PAGE. Oczekiwane wielkości białek zestawiono w Tabeli 2. GlyRS i PheRS składają się z dwóch podjednostek o różnych masach cząsteczkowych; pozostałe 34 białka składają się z pojedynczej podjednostki. Kluczem do prostoty i efektywności czasowej tego protokołu jest etap wspólnej hodowli i wspólnego oczyszczania (Rysunek 2). Roztwór białek OnePot przygotowano poprzez zwiększenie proporcji szczepu EF-Tu w stosunku do wszystkich pozostałych szczepów ekspresyjnych. Ogólny skład końcowych białek przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 3A). Z żeli (ścieżki 2, 3) zauważalna jest wyższa koncentracja EF-Tu (43,3 kDa) w porównaniu do pozostałych białek, zgodnie z oczekiwaniami. Choć żel dostarcza dobrej wstępnej informacji o proporcjach ekspresji białek, trudno jest określić, czy i na jakim poziomie eksprymowane było każde poszczególne białko. Dlatego wysoce zaleca się potwierdzenie nadekspresji w każdym szczepie przed rozpoczęciem wspólnej hodowli, jak pokazano powyżej.
Rybosom E. coli jest złożoną maszyną molekularną składającą się z ponad 50 pojedynczych podjednostek białkowych23. Reprezentatywne widmo absorpcyjne przy 260 nm dla oczyszczania rybosomów bez użycia znaczników przedstawiono na Rysunku 4; trzeci pik jest charakterystyczny dla pomyślnego eluowania rybosomów. Dla obu metod oczyszczania rybosomów zaobserwowano oczekiwany wzór prążków na żelu SDS-PAGE (Rysunek 3A)18. W obu procesach oczyszczania stwierdzono zanieczyszczenia, choć w niewielkich ilościach (&lt;10%). Co istotne, w rybosomach bez znaczników (ścieżki 5, 6) oraz w rybosomach z tagiem His (ścieżki 11, 12) obecne były różne zanieczyszczenia ze względu na różnice w zastosowanej metodzie. Dla odniesienia użytkownika dołączono również żele SDS-PAGE dla układów połączonych (ścieżki 8, 9 oraz 14, 15).
Na koniec porównano wydajność przygotowanych systemów (Rysunek 3) z wykorzystaniem różnych wariantów rybosomów. Kinetyka ekspresji eGFP in vitro wykazuje, że oba systemy PURE są funkcjonalne i wytwarzają fluorescencyjne eGFP. Jednakże roztwór białkowy OnePot w połączeniu z rybosomami z Znacznikiem His, przy zastosowaniu stężenia rybosomów zoptymalizowanego metodą miareczkowania, zapewnił poziom ekspresji stanowiący zaledwie jedną trzecią poziomu uzyskanego w wersji z rybosomami bez znacznika (Rysunek 3B). Podobne wyniki zaobserwowano podczas ekspresji i znakowania trzech białek o różnych rozmiarach przy użyciu systemu znakowania in vitro Green Lys tRNA (Rysunek 3C). Jak widać na żelu fluorescencyjnym, w obu systemach pomyślnie wyeksponowano produkty pełnej długości; jednakże w systemie z rybosomami z Znacznikiem His osiągnięto jedynie około połowę poziomu ekspresji. Oprócz znakowania fluorescencyjnego, na żelu barwionym błękitem Coomassie można rozróżnić oczekiwane prążki dla wszystkich trzech białek (Rysunek 3D). Wyniki pokazują, że wprowadzony system ekspresji, który można przygotować w ciągu tygodnia w laboratorium wyposażonym w standardowy sprzęt, może być stosowany do ekspresji in vitro białek kodowanych w obrębie sekwencji za promotorem T7 z matryc liniowych.
<img alt="Test ekspresji białek metodą SDS-PAGE, wyniki elektroforezy żelowej służące do analizy prążków białkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne wyniki testu nadekspresji dla wszystkich szczepów ekspresyjnych systemu PURE. Numery i rozmiary białek PURE zestawiono w Tabeli 2. Białka o numerach 21, 24 i 27 zostały oznaczone gwiazdką w celu lepszej wizualizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu oczyszczania białka OnePot; etapy resuspensji, sonikacji, inkubacji i oczyszczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Oczyszczanie białka OnePot. Schematyczny opis i odpowiadające mu fotografie wszystkich etapów produkcji roztworu białka OnePot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza białek metodą SDS-PAGE; ekspresja eGFP; wykres wydajności rybosomów; rybosomy bez znacznika vs rybosomy z His-tagiem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wydajność przygotowanych systemów z zastosowaniem różnych wariantów rybosomów. (A) Żele SDS-PAGE barwione błękitem Coomassie: roztwór białek OnePot (ścieżki 2, 3), rybosomy bez znacznika bez roztworu białek (ścieżki 5, 6) i z roztworem białek (ścieżki 8, 9), rybosomy z His-tagiem bez roztworu białek (ścieżki 11, 12) i z roztworem białek (ścieżki 14, 15). Dla każdej próbki nałożono dwie różne stężenia. (B) Porównanie ekspresji eGFP dla rybosomów z His-tagiem i rybosomów bez znacznika. Monitorowano w czasie natężenie fluorescencji ekspresji in vitro eGFP dla reakcji PURE z użyciem rybosomów bez znacznika (1.8 µM, kolor niebieski) i rybosomów z His-tagiem (0.62 µM, kolor czerwony). Stężenia liniowego matrycy i roztworu białek OnePot wynosiły odpowiednio 4 nM i 2 mg/mL. Panele (C) i (D) przedstawiają żel SDS-PAGE białek syntetyzowanych w systemie OnePot z użyciem rybosomów bez znacznika (1.8 µM, kolor niebieski, ścieżki 3, 4, 5) i rybosomów z His-tagiem (0.62 µM, kolor czerwony, ścieżki 6, 7, 8), odpowiednio znakowanych zestawem do znakowania in vitro GreenLys (C) i barwionych błękitem Coomassie (D). Czarne strzałki wskazują oczekiwane prążki syntetyzowanych białek: eGFP (26.9 kDa), ArgRS (64.7 kDa), T7 RNAP (98.9 kDa). Stężenia liniowej matrycy i roztworu białek OnePot wynosiły odpowiednio 4 nM i 1.6 mg/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik chromatografii; absorbancja względem objętości; piki elucji; wykres oczyszczania białka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62625/62625fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Widma absorbancji przy 260 nm. Reprezentatywne wyniki widm absorbancji przy 260 nm podczas oczyszczania rybosomów bez znaczników metodą oddziaływań hydrofobowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/62625fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić ten rysunek w większym rozmiarze, kliknij tutaj.</a>
Tabela 1: Zoptymalizowany harmonogram dobowy dla przygotowania wszystkich roztworów OnePot PURE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table1.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Lista białek PURE <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Table2.pdf" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Odczynniki. Tabela zawiera stężenia, objętości i inne szczegółowe informacje dotyczące odczynników i składników wykorzystanych w niniejszym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%201-62625.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Buforu. Arkusz kalkulacyjny zawiera dokładne składy buforów do oczyszczania białek, rybosomów bez znaczników oraz rybosomów z Znacznikiem His, a także stężenia roztworów zapasowych wykorzystywanych do ich przygotowania. Dodatkowo arkusz oblicza wymagane ilości składników w zależności od objętości buforu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%202_.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 3: Obliczenia aminokwasów. Arkusz zawiera listę aminokwasów oraz zalecane stężenia ich roztworów zapasowych wymaganych do przygotowania roztworu energetycznego. Oblicza on ilość wody, którą należy dodać do każdego aminokwasu na podstawie faktycznie odważonej masy, a także objętość roztworu aminokwasu, którą należy dodać do końcowej mieszaniny aminokwasów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%203-62625.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 4: Roztwory zapasowe do roztworu energetycznego. W tabeli wymieniono stężenia i objętości roztworów zapasowych niezbędnych do przygotowania roztworu energetycznego oraz podano dalsze szczegóły, w tym warunki przechowywania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%204_.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 5: Roztwór energetyczny. Tabela zawiera składniki roztworu energetycznego oraz ich zalecane stężenia. Dodatkowo obliczono wymagane objętości składników, które należy dodać do końcowego roztworu, w oparciu o stężenia ich roztworów zapasowych oraz całkowitą objętość roztworu energetycznego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%205-62625.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 6: PCR. Tabela zawiera sekwencje i stężenia starterów użytych do PCR wydłużającej oraz wskazuje temperatury topnienia i etapy termocyklera zoptymalizowane dla polimerazy DNA o wysokiej wierności. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Table%206-62625.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 7: Reakcja PURE.Arkusz kalkulacyjny przedstawia przykładową konfigurację reakcji PURE. Zawiera on wykaz stężeń i objętości komponentów wykorzystanych w reakcji PURE z użyciem rybosomów bez znaczników lub rybosomów z His-tagiem. Ponadto oblicza stosunki objętości dla miareczkowania białek i rybosomów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62625/Supplementary_Tables%207-62625.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

The defined PURE (protein synthesis using recombinant elements) transcription-translation system provides an appealing chassis for cell-free synthetic ...

Ten protokół dla rekombinowanego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek, powszechnie znany jako system PURE, wykorzystuje hodowlę komórek i oczyszczanie komórek w celu usprawnienia wymaganego oczyszczania białek. To znacznie minimalizuje wymagania czasowe i pracochłonne. Metoda OnePot okazała się nie tylko opłacalna, ale także efektywna czasowo.Skraca to czas przygotowania z kilku tygodni do trzech dni roboczych. To sprawia, że platforma bezkomórkowa PURE jest dostępna dla większej liczby laboratoriów na całym świecie i pomaga wdrożyć tę naprawdę potężną platformę do syntetycznej biologii bezkomórkowej. Zanim zaczniesz, upewnij się, że wszystkie szczepy dobrze wyrażają swoje białko.Na początek przygotuj kolumnę do oczyszczania białka OnePot zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym przy użyciu dwóch mililitrów żywicy Sepharose, a następnie napełnij kolumnę siarczanem niklu. Przygotuj kultury starterowe, łącząc 20 mililitrów pożywki LB z 20 mikrolitrami ampicyliny. Dodaj 300 mikrolitrów pożywki do 35 dołków sterylnej płytki z 96 głębokimi dołkami.Zaszczep każdy z nich odpowiednim szczepem, z wyjątkiem współczynnika wydłużenia termoniestabilnego lub EFTU, i uszczelnij płytkę oddychającą membraną. W przypadku hodowli EFTU należy zaszczepić trzy mililitry ampicyliny zawierającej pożywkę LB w 14-mililitrowej probówce hodowlanej z zatrzaskową nasadką. Około trzech mililitrów kultury EFTU wystarcza na jedną kulturę ekspresji OnePot.Inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 260 obrotów na minutę przez noc. Następnego dnia przenieś 500 mililitrów pożywki LB i 500 mikrolitrów ampicyliny do sterylnej kolby z przegrodą. Zaszczepić kulturę OnePot PURE 1 675 mikrolitrami kultury EFTU i 55 mikrolitrami każdej z kultur z płytki studzienki głębinowej.Inkubuj kulturę przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem 260 obrotów na minutę lub do momentu, gdy gęstość optyczna kultury osiągnie 0,2 do 0,3. Wywołaj kulturę za pomocą 500 mikrolitrów 0,1 milimolowego IPTG i hoduj przez dodatkowe trzy godziny. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 3 220 razy G przez 10 minut i przechowywać osad komórkowy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia.W trzecim dniu zmierz ilości potrzebnych do ich oczyszczenia i dodaj TCEP do wszystkich z nich, jak wskazano w tekście. Przechowuj pozostałe bez TCEP w temperaturze czterech stopni Celsjusza do przyszłego oczyszczania. Zrównoważyć naładowaną kolumnę z 30 mililitrami buforu A. Po przejściu 25 mililitrów buforu A zamknij kolumnę od dołu.Rozmrozić komórki i użyć pipety serologicznej do ponownego zawieszenia osadu komórkowego w 7,5 mililitra buforu A. Zlikwiduj komórki za pomocą sondy o mocy 130 W. Jeśli sonikacja się powiedzie, roztwór stanie się ciemniejszy. Upewnij się, że ogniwa pozostają na lodzie i umieść sondę wystarczająco głęboko, nie dotykając rurki.Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w temperaturze 21, 130 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i utrzymywać lizat na lodzie. Dodać supernatant do kolumny zrównoważonej. Zamknij kolumnę od góry i upewnij się, że nie ma wycieków.Inkubować kolumnę przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod obrotem za pomocą rotatora rurowego. Eluować niezwiązane składniki z kolumny i przemyć 25 mililitrami buforu A. Przemyć kolumnę 25 mililitrami 25-milimolowego buforu imidazolowego. Eluować białka za pomocą pięciu mililitrów 450-milimolowego buforu imidazolowego i utrzymywać wyluzowane białka na lodzie przez cały czas.Rozcieńczyć eluat 25 mililitrami buforu HT i utrzymać mieszaninę na lodzie. Dodaj 15 mililitrów do 15-mililitrowego filtra odśrodkowego i skoncentruj do objętości 1,5 mililitra. Dodaj pozostałe 15 mililitrów do filtra ze stężonym roztworem i ponownie skoncentruj do 1,5 mililitra.Dodać 10 mililitrów buforu HT do zagęszczonej próbki i zagęścić do jednego mililitra. Odzyskać zagęszczoną próbkę i dodać równą ilość buforu podstawowego B i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Podczas wymiany bufora przywróć kolumnę zgodnie z opisem w tekście.Czwartego dnia zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Zagęścić próbkę z 0,5 mililitra trzykilodaltonowego filtra odśrodkowego do 20 miligramów na mililitr. Sprawdź skład białka OnePot PURE za pomocą karty charakterystyki.Rozcieńczyć 2,5 mikrolitra próbki 7,5 mikrolitra wody zmieszanej z 10 mikrolitrami dwóch X Laemmli, a następnie załadować pięć mikrolitrów i 2,5 mikrolitrów próbek na żel. Uruchom stronę SDS zgodnie z opisem w tekście. Wypełnij stężenie i długość DNA w odpowiednich żółtych komórkach w arkuszu kalkulacyjnym, używając od dwóch do 10 nanomolów DNA do reakcji.Wypełnij żądaną całkowitą objętość reakcji w mikrolitrach. Wyjmij wymagane odczynniki z zamrażarki i rozmroź je na lodzie. Następnie odpipetuj obliczone ilości wody, DNA i roztworu energetycznego po jednej stronie probówki do PCR lub w jednym rogu studzienki na płytce z 384 dołkami.Odpipetować obliczone ilości białka i roztworu rybosomu na drugą stronę probówki do PCR lub w przeciwległy róg płytki 384-dołkowej. Wiruj przez około 30 sekund, aby połączyć składniki reakcji. Aby zapobiec parowaniu podczas eksperymentów z czytnikiem płytek, dodaj 35 mikrolitrów płynnego wosku i uszczelnij płytkę przezroczystym uszczelniaczem.Inkubować przez minimum trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W celu odczytu na czytniku płytek należy co dwie minuty mierzyć intensywność fluorescencji na wymaganej długości fali. Udana nadekspresja we wszystkich poszczególnych szczepach użytych później do preparatu białkowego OnePot jest pokazana tutaj.Ogólny skład końcowego roztworu białkowego OnePot PURE został przeanalizowany za pomocą karty charakterystyki. Zauważalne jest, że EFTU jest obecny w wyższym stężeniu w porównaniu z innymi białkami, zgodnie z oczekiwaniami. Wydajność syntezy roztworu białkowego OnePot w połączeniu z rybosomami znakowanymi lub nieznakowanymi Hisem analizowano, monitorując fluorescencję eGFP w czasie.Poziomy ekspresji trzech różnych białek znakowanych za pomocą systemu znakowania tRNA in vitro z zieloną listą lub barwienia Kumasi analizowano na żelu SDS. Dla funkcjonalnego systemu PURE absolutnie kluczowe jest, aby wszystkie szczepy dobrze wyrażały swoje białka. Technika ta ułatwia wdrożenie systemu PURE do inżynierii systemów biologicznych, umożliwiając rozwój nowatorskich sieci genetycznych, diagnostyki molekularnej, terapii i zestawów edukacyjnych.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Ten protokół pozwala na wiarygodne generowanie i charakteryzowanie komórek śródbłonka (BOEC) z małej objętości dorosłej krwi obwodowej. BOEC mogą być stosowane jako substytut komórek śródbłonka od pacjentów z zaburzeniami naczyniowymi oraz jako substrat do wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie i hodowla komórek śródbłonka przerostu krwi z ludzkiej krwi obwodowej

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Ten protokół opisuje, jak używać Jednokomórkowego Systemu Mikrolitrowego Zarządzania Kulturami Kropelkowymi (komórka MISS) do przeprowadzania izolacji, hodowli i pobierania mikrobiologicznego monoklonu. Komórka MISS osiąga zintegrowany przepływ pracy oparty na technologii mikroprzepływowej kropelkowej, która zapewnia doskonałą monodyspersyjność kropel, wysoką hodowlę równoległą i wysokowydajne wykrywanie biomasy.

Zautomatyzowana i wysokowydajna mikrobiologiczna hodowla monoklonalna i zbiór z wykorzystaniem systemu omicznego do hodowli mikrolitrowych mikrolitrów

Terapeutyczne zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) może zrewolucjonizować leczenie nowotworów i dostarczanie leków. Izolowane za pomocą chromatografii jonowymiennej metodą chromatografii jonowymiennej chimerycznego receptora antygenowego (CAR) EV pochodzące z komórek (CAR-EVs) wykazują zwiększoną nośność, co znacznie zwiększa ich skuteczność funkcjonalną. W niniejszym badaniu scharakteryzowano pojazdy CAR-EV, aby wyjaśnić ich aktywność biologiczną i potencjał terapeutyczny.

Wzmacnianie technologii pęcherzyków zewnątrzkomórkowych receptora antygenu chimerycznego (CAR-EV): przyszłość terapii nowotworów

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Przedstawiamy protokół ilustrujący izolację rzadkich komórek rakowych z przygotowanej próbki zawierającej pełną krew i wzbogaconą w komórki raka płuca. Protokół wykorzystuje półautomatyczną platformę do izolacji komórek bez znaków. Wzbogacone komórki są następnie analizowane pod kątem mutacji receptora czynnika wzrostu naskórka za pomocą kroplowej cyfrowej PCR.

Profilowanie mutacji DNA receptoray czynnika wzrostu naskórka w rzadkich krążących komórkach z wykorzystaniem systemu izolacji komórek i dropletowej cyfrowej PCR

Poznaj metodę OnePot PURE do szybkiej ekspresji białek bezkomórkowej. Technika skraca czas przygotowania z kilku tygodni do trzech dni, ułatwiając dostęp do platformy PURE w badaniach z zakresu biologii syntetycznej.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Przeglądaj więcej filmów