Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Protokół ten opisuje procedury i krytyczne etapy preparatów pseudowirusa ptasiej grypy H5 o wysokiej zjadliwości oraz testów neutralizacji pseudowirusa. Omówiono również ograniczenia rozwiązywania problemów i modyfikacje tych testów. Wysoce zjadliwe patogeny muszą być badane w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego poziomu trzeciego, podczas gdy pseudowirusy mogą być bezpiecznie przetwarzane w laboratorium bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego.

Na początek wykonaj jednokomórkową zawiesinę komórek HEK293 FT w kompletnym podłożu DMEM. Dodać 10 mililitrów zawiesiny jednokomórkowej do kolby T75, a następnie przeprowadzić inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dwie godziny przed transfekcją zastąp starą pożywkę 10 mililitrami świeżej, kompletnej pożywki z chlorochiną.

Wymieszaj odczynniki i plazmidowe DNA zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie przenieś tę mieszaninę do pożywki nad komórkami i delikatnie się kołysz. Po inkubacji zastąp pożywkę 15 mililitrami świeżej, kompletnej pożywki DMEM. Po 65 godzinach zebrać supernatant przez odwirowanie.

Zebrać supernatant i podzielić go na porcje. Aby wykryć ekspresję białka hemaglutyniny, dodaj 50 mikrolitrów PBS do kolumn od drugiej do dwunastej 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej. Dodaj 100 mikrolitrów pseudowirusa do studzienek w kolumnie pierwszej.

Następnie przenieś 50 mikrolitrów pseudowirusa z kolumny pierwszej do studzienek kolumny drugiej. Przeprowadzić to dwukrotne rozcieńczenie do kolumny 11, a następnie delikatnie wymieszać. Następnie wyrzuć dodatkowe 50 mikrolitrów z kolumny 11.

Dodaj 50 mikrolitrów 0,5% erytrocytów do każdej studzienki, a następnie delikatnie wymieszaj. Po 30 do 60 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej obserwuj i zapisuj miana hemaglutyniny pseudowirusa. W celu miareczkowania pseudowirusa należy wykonać zawiesinę pojedynczej komórki w ilości od pięciu razy 10 do czwartej komórki na mililitr komórek MDCK w kompletnym pożywce DMEM.

Dodaj 1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 i 40 000 komórek do różnych dołków płaskiej płytki 96-dołkowej. Po inkubacji rozmrozić i wirować pseudowirusa. Dodaj sześć HAU pseudowirusów do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej i uzupełnij każdą studzienkę kompletnym DMEM do 120 mikrolitrów.

Przenieść 100 mikrolitrów mieszaniny do komórek w płytce 96-dołkowej. Inkubuj płytkę hodowlaną przez 48, 60 i 72 godziny w przypadku infekcji wirusowej i wykonaj test lucyferazy. Aby wykonać test lucyferazy, umyj komórki, ostrożnie usuwając pożywkę i spłukując ją 200 mikrolitrami PBS.

Usuń jak najwięcej PBS, jak to możliwe, a następnie dodaj 50 mililitrów buforu do lizy do każdej studzienki. Następnego dnia należy zrównoważyć płytki w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie kilkakrotnie wstrząsnąć płytkami hodowlanymi i przenieść wszystkie lizaty komórkowe na nieprzezroczyste płytki 96-dołkowe. Dodaj 50 mikrolitrów podłoża do każdej płytki i dobrze wymieszaj.

Zapisz miana lucyferazy pseudowirusa za pomocą luminometru. Dodać 100 mikrolitrów jednokomórkowej zawiesiny komórek MDCK do każdego dołka płaskiej płytki 96-dołkowej i inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji rozmrozić i odwirować pseudowirusa i surowice przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć surowicę 20 razy w kompletnym podłożu. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki DMEM do kolumn od trzeciej do 10. Dodać 200 mikrolitrów rozcieńczonej surowicy do studzienek drugiej kolumny i przeprowadzić seryjne rozcieńczanie.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki DMEM do 11. kolumny jako kontrolę ujemną. Dodaj 100 mikrolitrów pseudowirusów do każdej studzienki i wymieszaj. Przenieść 100 mikrolitrów mieszaniny z 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej do odpowiedniego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej.

Po 60 godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza wykonaj test lucyferazy. Test hemaglutyniny wykazał, że 643 jednostki HA na mililitr pseudowirusów grypy są obecne w zapasach pseudowirusów grypy. Proporcje HA i Gag P24 mieściły się w normalnym zakresie.

Test western blot wykazał obecność czterech typów białek, w tym białek HA0, HA1, HA2 i NA, co wskazuje na podobieństwo pseudowirusów grypy do wirusów typu dzikiego. Wyniki miareczkowania pseudowirusa wskazują, że odpowiednie warunki dla najwyższej względnej aktywności lucyferazy obejmują karmienie 5 000 komórek w studzience z 96-dołkową płytką i wykrywanie względnych odczytów aktywności lucyferazy po 60 godzinach infekcji wirusem. Surowice odpornościowe z grupy DDV wykazywały wysokie miana neutralizacji przeciwko szczepowi pseudowirusa A Thailand 1 Can 104, podczas gdy surowice z grupy kontrolnej nie wykazywały żadnej aktywności neutralizującej.

Aktywność neutralizująca surowic odpornościowych była silna w porównaniu z surowicami kontrolnymi, co wskazuje, że wiele przeciwciał było kierowanych do głowy HA w surowicy odpornościowej. Istotne różnice między surowicami immunologicznymi a grupą kontrolną podczas oceny wnikania wirusa wskazują, że przeciwciała są kierowane do regionu macierzystego HA w surowicach odpornościowych. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu stabilnego pH roztworu do transfekcji i pożywki hodowlanej.