Name: Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Naucz się podwójnego znakowania EdU i fosfohistonu H3 do analizy cyklu komórkowego w komórkach nerwowych Drosophila. Protokół umożliwia klasyfikację faz G1, S i M w mózgach larw.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (grant na projekt 31003A_173188; www.snf.ch) i Uniwersytetu w Bernie (www.unibe.ch) dla BS. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

1. Przygotowanie odczynników i zapasów do testu Click-it EdU
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów i Tabelą 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zestawu i odczynników dostarczonych z zestawem.
<ol>
	<li>Doprowadzić fiolki do temperatury pokojowej przed przygotowaniem roztworów.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztworu podstawowego EdU (składnik A), dodając 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO, składnik C). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy Alexa Fluor 647-azide (składnik B), dodając 70 μl DMSO (składnik C). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować 1x roztwór buforu reakcyjnego Click-iT EdU (składnik D) mieszając 4 ml tego roztworu z 36 ml wody dejonizowanej. Pozostały roztwór przechowywać w temperaturze 2-6 °C.</li>
	<li>Przygotuj 10-krotny zapas (200 mg/ml) dodatku buforowego Click-iT EdU (składnik F), dodając 2 ml wody dejonizowanej. Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przechowywać Hoechst 33342 (składnik G) w temperaturze 2-6 °C. Przechowywać DMSO (składnik C) w eksykatorze w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Do obsługi DMSO i Hoechst należy używać rękawic.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgów larwalnych trzeciego stadium rozwoju i inkorporacja EdU
UWAGA: Protokół sekcji mózgu został opisany wcześniej12. Przed rozpoczęciem sekcji należy upewnić się, że przygotowana i rozmrożona została wystarczająca ilość roztworów EdU i PFA, jak opisano w ppkt 2.6 i 3.1.
<ol>
	<li>Przygotuj 10x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), dodając 25,6 g Na2HPO 4,7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl i 2 g KH2PO4 do 1 l wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 7,4, a następnie przygotuj 1x roztwór w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Dodaj pożywkę preparacyjną Schneidera (SM) do dwóch kolejnych wgłębień szklanej (3 lub 9) szklanej płytki punktowej z wgłębieniem. Dodaj 1x PBS do następnego kolejnego wgłębienia.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego i umieść je na chusteczce zwilżonej PBS, aby usunąć resztki pokarmu dla much. Umieść larwę w zagłębieniu z PBS, a następnie w kolejnym zagłębieniu z SM.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy usuń 3/4 dolnej części ciała larwy.
	<ol>
		<li>Delikatnie chwyć haczyki do ust larw jedną parą kleszczy i przytrzymaj naskórek na drugim końcu drugą parą kleszczy.</li>
		<li>Odwróć głowę larwy na lewą stronę, wciskając do środka haczyki gębowe i jednocześnie odrywając tkankę na drugim końcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj mózg larwy z przyczepionymi wyimaginowanymi dyskami. Usuń inne tkanki przyczepione do mózgu i przenieś mózg do następnego kolejnego depresją z SM.</li>
	<li>Rozmrozić roztwór podstawowy 10 mM EdU. Przygotować roztwór o stężeniu 100 μM, rozcieńczając ten 10 mM zapas w SM.</li>
	<li>Dodać 100 μL tego 100 μM roztworu EdU+SM w innym wgłębieniu na płytce Pyrex. Inkubować ~ 5-10 wypreparowanych mózgów w 100 μL 100 μM roztworu EdU+SM przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Ponieważ NB dzielą się raz na ~2 godziny, protokół ten ma na celu analizę jednego pełnego cyklu komórkowego. Do dalszych kroków używaj tylko nienaruszonych mózgów. Wyrzuć mózgi, które zostały uszkodzone podczas sekcji.</li>
</ol>
3. Utrwalenie i barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) w dygestorium.
	<ol>
		<li>Dodać 4 g proszku paraformaldehydu do 80 ml 1x PBS w zlewce umieszczonej na mieszadle magnetycznym i podgrzać do 60 °C. Aby rozpuścić PFA, dodaj kilka kropli 1 N NaOH. Sprawdź pH i w razie potrzeby dostosuj do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 M HCl.</li>
		<li>Dostosuj objętość do 100 ml za pomocą 1x PBS. Podwielokrotnić roztwór PFA i przechowywać w temperaturze 2-6 °C przez okres do 1 miesiąca. Dodać 0,3% niejonowego detergentu (patrz tabela materiałów) do roztworu PFA, aby skutecznie utrwalić duże tkanki, takie jak mózg larwy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po włączeniu EdU przenieś mózgi do probówek mikrowirówek o pojemności 0,6 ml zawierających 4% PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej na nutatorze przez 15 minut. Postukaj w probówkę na stole laboratoryjnym, aby mózgi osiadły na dnie probówki.</li>
	<li>Usuń PFA i umyj 3 razy PBS + 0,3% detergentem niejonowym (PBST) w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że każde pranie trwa co najmniej 10 minut na nutatorze. Po ostatnim przemyciu usunąć PBST, dodać roztwór blokujący (PBST + 5% albuminy surowicy bydlęcej) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-Miranda (1:250) i przeciwciało anty pH3 (1:200) w PBST (oba przeciwciała w tej samej probówce). Usuń bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubować przez noc w temperaturze 2-6 °C na nutatorze. 
	UWAGA: Miranda jest białkiem błonowym obecnym na CB NB. Służy do identyfikacji tych dużych okrągłych komórek w regionie CB 13.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3 razy PBST. Upewnij się, że każde pranie trwa 10 minut na nutatorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała, dodając rozcieńczony w 1:500 anty-Rabbit Alexa Fluor 488 i anty-Rat Alexa Fluor 568 do PBST. Usuń PBST i dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała do wypreparowanych mózgów. Inkubować przez noc w temperaturze 2-6 °C w ciemności, na nutatorze i przemyć 3 razy PBST (krok 3.5).</li>
</ol>
4. Wykrywanie EdU, barwienie DNA i montaż
<ol>
	<li> Aby przygotować koktajl detekcyjny EdU, wymieszaj składniki (patrz Tabela 2) w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Po ostatnim praniu (krok 3.6) usuń PBST i dodaj koktajl detekcyjny EdU do wypreparowanych mózgów. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut na nutatorze. Umyj 2 razy PBST przez 10 minut każdy, w ciemności.</li>
	<li>Do barwienia DNA rozcieńczyć Hoechst 33342 (składnik G) w stosunku 1:2 000 w PBST, aby przygotować roztwór o stężeniu 5 μg/ml.</li>
	<li>Po drugim przemyciu (krok 4.2) usunąć PBST i dodać 500 μl 5 μg/ml roztworu Hoechsta do wypreparowanych mózgów. Inkubować w ciemności przez 10 minut. Usunąć Hoechst i przemywać raz PBST przez 10 minut.</li>
	<li>Postukaj rurką o stół laboratoryjny i pozwól mózgom się uspokoić. Wyjmij PBST z probówki, ale zostaw tylko 50-100 μL.</li>
	<li>Odetnij końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 200 μl i ostrożnie przenieś mózg na czyste szklane szkiełko. Usunąć nadmiar PBST ze szkiełka poprzez osuszenie paskami bibuły filtracyjnej. Uważaj, aby bibuła filtracyjna nie dotknęła mózgu.</li>
	<li>Umieść kroplę rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego podłoża montażowego na mózg i ustaw mózg tak, aby brzuszny rdzeń nerwowy był skierowany w stronę szkiełka, a płaty skierowane do góry. Ułóż mózgi w jednym pliku, aby łatwiej było je obrazować szeregowo.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgu. Umieść szkiełko w temperaturze 2-6 °C na noc. 
	UWAGA: Podłoże montażowe twardnieje po nocnym przechowywaniu, dzięki czemu nie ma potrzeby uszczelniania szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.</li>
</ol>
5. Obrazowanie
UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat laserowego mikroskopu skaningowego i obiektywu zanurzeniowego w oleju używanego w tym protokole.
<ol>
	<li>W oprogramowaniu Acquisition wybierz obiektyw 63x.</li>
	<li>Nałóż kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe tuż nad zamontowanymi mózgami, aby ułatwić zlokalizowanie tkanki przez okular.</li>
	<li>Korzystając z kanału DAPI/Hoechst 33342, znajdź mózg przez okular, a następnie przełącz się w tryb akwizycji w oprogramowaniu.</li>
	<li>Skonfiguruj 4 kanały do obrazowania Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) i Alexa Fluor 647 (EdU). Skorzystaj z narzędzia dye-assistant, które automatycznie konfiguruje lasery wzbudzające i filtry emisyjne dla wybranych barwników.</li>
	<li>Ustaw pole widzenia tak, aby obejmowało cały płat mózgu. Wyobraź sobie całą objętość płata mózgowego, uzyskując stosy z oddalone od siebie o 0,8 μm. Przechowuj wszystkie obrazy z sesji obrazowania w formacie biblioteki *.lif.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
UWAGA: Poniższe kroki opisują analizę pozyskanych obrazów i sposób sortowania komórek na fazę G0/G1, fazę S, S>G2/M (progresja od S do G2/M) i fazę M za pomocą oprogramowania ImageJ.
<ol>
	<li>Pobierz Fidżi (Fidżi to ImageJ) z następującego adresu URL: https://fiji.sc/. Otwórz Fidżi, a następnie przeciągnij i upuść pliki .lif do Fiji. 
	UWAGA: Fiji to wersja ImageJ, która jest fabrycznie zainstalowana z kilkoma wtyczkami14. Przeniesienie plików .lif na Fidżi otworzy wtyczkę Bio-formats, która jest potrzebna do przetworzenia plików .lif. Wtyczka Bio-formats jest również wymagana do otwierania plików obrazów wygenerowanych przez niektóre inne marki mikroskopów, np. plików nd2 wygenerowanych za pomocą mikroskopu Nikon. Ta wtyczka jest preinstalowana na Fidżi.</li>
	<li>Wybierz Przeglądarkę danych z zakładki przeglądania stosu i użyj wirtualnego stosu z zakładki zarządzania pamięcią w wtyczce bio-formats. 
	UWAGA: Pliki Lif ze stosami z 8-10 mózgów mają często rozmiar 300-400 megabajtów. Na komputerach z małą ilością pamięci RAM otwarcie kilku takich plików może szybko wyczerpać dostępną pamięć RAM w ImageJ i uniemożliwić dalsze przetwarzanie obrazu. Wirtualny stos jest "tylko do odczytu", nie wymaga dużej ilości pamięci RAM do przetwarzania i jest idealną opcją do ładowania dużych zbiorów danych na Fidżi.</li>
	<li>Obserwuj wielokanałowy obraz wyświetlany w ImageJ. Zmień kolor kanałów na pasku menu za pomocą narzędzia Obraz | kolor | kanały. Obserwuj NB oznaczone przez Mirandę jako duże okrągłe komórki w obszarze CB.</li>
	<li>Narysuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia elipsy nad każdym NB, aby uniknąć dwukrotnego liczenia NB.
	<ol>
		<li>Z paska menu ImageJ wybierz pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Zaznacz wszystkie NB w bieżącej sekcji Z i naciśnij t po zaznaczeniu każdej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zaznaczeniu wszystkich NB w bieżącej sekcji Z, zmień kanały na pH3 i EdU i ręcznie policz liczbę NB EdU-dodatnich, NB dodatnich pH3, NB barwiących dodatnio zarówno dla EdU, jak i pH3 oraz NB niebarwiących dla obu markerów.</li>
	<li>Wyszukaj jednostki podziału na wartości w kolejnych sekcjach Z, usuń stare wskaźniki zwrotu z inwestycji i dodaj nowe wskaźniki zwrotu z inwestycji, aby policzyć jednostki NB w różnych stosach.</li>
	<li>Przygotuj arkusz kalkulacyjny z następującymi kolumnami: 1. EdU- pH3-: ta sekcja reprezentuje komórki podwójnie ujemne, które znajdują się w fazie G0/G1 cyklu komórkowego; 2. EdU+: komórki z tej kategorii mają włączone EdU i przechodzą replikację DNA (faza S); 3. EdU + pH3 +: te podwójnie dodatnie komórki zakończyły fazę S i przeszły do fazy G2 lub M; 4. pH3+: te NB przechodzą mitozę.</li>
	<li>Oblicz procentową zawartość NB obecnych we wszystkich powyższych 4 kategoriach dla każdego płata. Przygotuj wykres słupkowy za pomocą arkusza kalkulacyjnego przedstawiającego zbiorcze dane dla procentów jednostek notyfikowanych w każdej kategorii.</li>
</ol>

<ol><li>Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+across+the+eukaryotic+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control across the eukaryotic kingdom.</a> Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).</li>
<li>Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle%3A+a+review+of+regulation%2C+deregulation+and+therapeutic+targets+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer.</a> Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).</li>
<li>Pardee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+restriction+point+for+control+of+normal+animal+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A restriction point for control of normal animal cell proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).</li>
<li>Gogendeau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+causes+premature+differentiation+of+neural+and+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells.</a> Nature Communications. 6, 8894(2015).</li>
<li>Barnum, K. J., O'Connell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+regulation+by+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle regulation by checkpoints.</a> Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).</li>
<li>Gratzner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+to+5-bromo-+and+5-iododeoxyuridine%3A+A+new+reagent+for+detection+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication.</a> Science. 218 (4571), 474-475 (1982).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+the+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+phosphohistone+H3+as+a+proliferation+marker+for+evaluating+invasive+breast+cancers%3A+A+comparative+study+with+Ki67%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67.</a> Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29+labeling+of+Drosophila+mitotic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).</li>
<li>Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+promotes+spindle+microtubule+assembly+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells.</a> PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).</li>
<li>Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+Drosophila+larval+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).</li>
<li>Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miranda%2C+a+protein+involved+in+neuroblast+asymmetric+division%2C+is+associated+with+embryonic+centrosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster.</a> Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mms19+is+a+mitotic+gene+that+permits+Cdk7+to+be+fully+active+as+a+Cdk-activating+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase.</a> Development. 145 (2), (2018).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+Drosophila+larval+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The development of the Drosophila larval brain.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).</li>
<li>Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NVX-412%2C+a+new+oncology+drug+candidate%2C+induces+S-phase+arrest+and+DNA+damage+in+cancer+cells+in+a+p53-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner.</a> PLoS One. 7, 45015(2012).</li>
<li>Wyllie, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+phase+cell-cycle+arrest+following+DNA+damage+is+independent+of+the+p53%2Fp21%28WAF1%29+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway.</a> Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+DNA+replication+and+induction+of+S+phase+cell+cycle+arrest+by+G-rich+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).</li>
<li>Duronio, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+S-phase+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Developing S-phase control.</a> Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).</li>
<li>Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase+duration+is+the+main+target+of+cell+cycle+regulation+in+neural+progenitors+of+developing+ferret+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).</li>
<li>Pereira, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+cycle+kinetics+by+EdU+%285-ethynyl-2%27-deoxyuridine%29-coupled-fluorescence-intensity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis.</a> Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Zielke, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fly-FUCCI%3A+A+versatile+tool+for+studying+cell+proliferation+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues.</a> Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).</li>
<li>Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+profiling+cell+cycle+by+flow+cytometry+using+concurrent+staining+of+DNA+and+mitotic+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers.</a> Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Włączenie EdU i jego następcza reakcja "klik" z przepuszczalnym dla komórek azydkiem przedstawia praktyczne zalety tej techniki w porównaniu z metodą BrdU zastosowaną wcześniej7. Jednak reakcja ta jest katalizowana przez jony Cu(I), a kilka barwników może być niestabilnych w obecności tego katalizatora miedziowego, co jest wyraźnie zalecane przez producenta zestawu Click-it EdU. Gdy eksperymenty z barwieniem immunologicznym przeprowadzono po wykonaniu etapu detekcji EdU, oczekiwana intensywność sy...

Cykl podziału komórki składa się z fazy G1 (pierwsza faza przerwy), fazy replikacyjnej/S, G2 (druga faza przerwy) i fazy M (mitotyczna). Przechodząc przez te fazy, komórka przechodzi dramatyczne zmiany w transkrypcji komórkowej, translacji i reorganizacji maszynerii cytoszkieletu1,2. W odpowiedzi na sygnały rozwojowe i środowiskowe komórki mogą tymczasowo przestać się dzielić i przejść w stan spoczynku (G0) lub różnicować się i trwale przestać się dzielić3. Inne scenariusze, takie jak uszkodzenie DNA, mogą powodować przedwczesne różnicowanie lub apoptozę3,4. Reakcja na takie sygnały jest pośredniczona przez punkty kontrolne cyklu komórkowego, które działają jak system nadzoru, aby zapewnić integralność podstawowych procesów komórkowych, zanim komórka przejdzie do następnej fazy cyklu podziału5. Dlatego badania nad genami regulującymi replikację DNA, punktami kontrolnymi i maszynerią mitotyczną muszą analizować możliwe defekty progresji cyklu komórkowego, które mogą wystąpić w zmutowanych komórkach lub po knocku siRNA tych genów. Ponadto takie analizy mogą być wykorzystane do zbadania ogólnego stanu zdrowia komórek, a także odpowiedzi komórek na leczenie farmakologiczne.
5-bromo-2'-deoksyurydyna (BrdU) to analog tymidyny, który jest wprowadzany do DNA podczas replikacji6. Metoda ta była szeroko stosowana do identyfikacji komórek w fazie S. Jednak komórki są następnie poddawane surowym procedurom denaturacji DNA, aby umożliwić wykrycie BrdU poprzez użycie przeciwciał anty-BrdU6. To ostre traktowanie może uszkodzić epitopy komórkowe i uniemożliwić dalszą charakterystykę próbki poprzez barwienie immunologiczne. Włączenie EdU, a następnie wykrycie przez katalizowaną miedzią "reakcję klikania" z małymi, przepuszczalnymi dla komórek, fluorescencyjnie znakowanymi barwnikami azydkowymi eliminuje potrzebę stosowania surowych procedur denaturacji7. Metoda ta okazała się zatem bardziej praktyczną alternatywą dla inkorporacji BrdU.
Ponadto, pH3 zostało opisane jako niezawodny marker dla komórek mitotycznej/fazy M8. Histone H3 jest rdzeniowym białkiem histonowym związanym z DNA, które ulega fosforylacji mniej więcej w późnej fazie G2 do wczesnej fazy M i ulega defosforylacji pod koniec anaphase8. Kilka komercyjnych przeciwciał można wykorzystać do wykrywania pH3 przy użyciu standardowych protokołów barwienia immunologicznego. Podwójne barwienie EdU i pH3 umożliwiłoby zatem wykrywanie komórek zarówno w fazie S, jak i M. Ponadto komórki w fazie G1 i wczesnej fazie G2 nie barwiłyby się dodatnio dla żadnego z markerów.
Neuronalne komórki macierzyste lub neuroblasty (NB) Drosophila oferują dobrze scharakteryzowany model komórek macierzystych, w którym komórki dzielą się asymetrycznie, tworząc jedną identyczną samoodnawiającą się NB i komórkę macierzystą zwoju (GMC), która jest przeznaczona do różnicowania9. Ponadto kilka narzędzi genetycznych i przeciwciała specyficzne dla NB sprawiają, że system ten nadaje się do manipulacji genetycznych i obrazowania żywych komórek. W związku z tym w kilku badaniach wykorzystano NB do badania genów regulujących asymetryczne podziały i determinację losu komórki9. Odrębne populacje NB istnieją w centralnej części mózgu (CB) i płacie wzrokowym (OL) mózgu larwalnego9; W niniejszym badaniu wykorzystano CB NB. Te larwy CB NB w trzecim stadium rozwojowym są dużymi komórkami, które nadają się również do badania czynników regulujących składanie wrzecion mitotycznych. Protokół analizy defektów progresji cyklu komórkowego byłby kluczowym narzędziem w takich badaniach.
Opublikowane wcześniej protokoły wykorzystywały komercyjne zestawy, takie jak Click-iT EdU Alexa Fluor Proliferation Kit, które dostarczają kilka składników reakcji i barwników azydkowych oznaczonych różnymi barwnikami Alexa Fluor do włączania i wykrywania EdU10. Jednak odczynniki dostarczane z takimi zestawami nie są kompatybilne z niektórymi znacznikami fluorescencyjnymi, często stosowanymi z przeciwciałami drugorzędowymi. Ten zestaw do wykrywania EdU (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit dostarczony z sprzężonym barwnikiem azydkowym Alexa Fluor 647) został przetestowany na NB larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym, a następnie próbowano współbarwienia przeciwciałami przeciwko pH3 i Miranda, markerowi NB. Co więcej, przeciwciała drugorzędowe znakowane Alexa Fluor 568 lub Cy3 zostały użyte do wykrywania znakowania Mirandy na błonie plazmatycznej NBs11. Jednak oczekiwana intensywność sygnału i wzór barwienia (wyniki niepublikowane) nie zostały zaobserwowane w przypadku tych przeciwciał drugorzędowych, gdy barwienie immunologiczne przeprowadzono po wykryciu EdU.
Do inkorporacji EdU, protokół opisany przez Daula i współpracowników wymagał karmienia larw pożywką Kankel-White zmieszaną z EdU i błękitem bromofenolowym (BPB)10. Larwy żywiły się pokarmem z dodatkiem EdU i BPB, który można było zobaczyć po jego niebieskim kolorze po spożyciu w jelicie larwalnym. Chociaż metoda ta została użyta do włączenia EdU do larw Mms19 z utratą funkcji (Mms19P) w trzecim stadium rozwojowym, larwy Mms19P najwyraźniej nie żerowały, ponieważ w jelicie larwy prawie nie wykryto niebieskiego koloru (niepublikowane wyniki). Larwy Mms19P wykazują drastyczne deformacje rozwojowe i ostatecznie zatrzymują się w trzecim stadium rozwojowym. Może to w jakiś sposób wpłynąć na zachowanie żywieniowe larw trzeciego stadium rozwojowego i sprawić, że protokół żywienia EdU nie będzie odpowiedni w takich przypadkach.
Po przestudiowaniu dostępnej literatury i intensywnej pracy nad standaryzacją podstawowych kroków, zaproponowano alternatywne podejście do podwójnego znakowania EdU/pH3 u Drosophila NBs, które nie wymaga karmienia larw EdU. W poprzednim badaniu zastosowano podwójne barwienie EdU/pH3 do analizy cyklu komórkowego w NBs, ale nie przedstawiono szczegółowego protokołu4. Stanowi to niepotrzebną przeszkodę dla laboratoriów próbujących wdrożyć tę metodę. Ponadto ocena kompatybilności różnych odczynników z zestawem EdU i przeprowadzanie dalszej optymalizacji może być czasochłonnym procesem. W artykule przedstawiono krok po kroku protokół, który obejmuje inkorporację EdU w wypreparowanych mózgach larw i barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-pH3, a następnie mikroskopię konfokalną i analizę obrazu w celu przypisania NB do czterech odrębnych kategorii: faza G0 / G1, faza S, S>G2 / M (progresja od S do G2 / M) i faza M. Przedstawiono kroki, które wymagają optymalizacji, oraz podano wskazówki dotyczące analizy obrazów dużych zestawów danych. Dodatkowo odczyt EdU/pH3 w NB typu dzikiego jest analizowany i porównywany z NB Mms19P, które ostatnio wykazały opóźnienie cyklu komórkowego11.

<table><tbody><tr><td>fly stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)</td><td>Bloomington stock center</td><td>#15477</td><td>Wstawienie elementu P w trzecim eksonie Mms19</td></tr><tr><td>&nbsp;+; Mms19::eGFP, Mms19p</td><td>Generowane w domu</td><td></td><td>białko Mms19 oznaczone eGFP wyrażone w tle Mms19p</td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington stock center</td><td>#3605</td><td>stado typu dzikiego (w;+;+)</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td> pierwszorzędowe <td>Rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Szczur anty-Miranda</td><td>Abcam</td><td>Ab197788</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Królicza sygnalizacja komórkowa anty-pH3</td><td></td><td>9701</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-Rat Cy3</td><td>Jackson Immuno</td><td>112-165-167</td><td>1/150</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A27034</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Reagent/Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences Inc</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw montażowy Click-it EdU, Alexa Flour 647</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) frakcja V</td><td>Merck</td><td>10735078001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fischer Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>niejonowy detergent</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Imagej)</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Oprogramowanie PRISM Graphpad firmy Leica microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Wersja 5</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td> Microsoft <td>Office</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 z 63-krotnym zanurzeniem w oleju, obiektyw</td><td></td><td></td><td></td> planapochromatyczny 1,4 NA</tr><tr><td><mocny>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount medium</td><td></td><td></td> montażowe <td>rozpuszczalne w wodzie, niefluorescencyjne medium montażowe</td></tr><tr><td>Pyrex 3 lub 9 wgłębienie szklana płyta</td><td></td><td></td><td></td>punktowa</tr><tr><td>bibuła</td><td></td><td></td><td></td> filtracyjna Whatman</tr></tbody></table>

protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu h3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych drosophila

5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 Dual-Labeling Protocol for Cell Cycle Progression Analysis in Drosophila Neural Stem Cells

Analiza progresji cyklu komórkowego in vivo jest rutynowo przeprowadzana w badaniach nad genami regulującymi mitozę i replikację DNA. 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU) została wykorzystana do zbadania progresji replikacyjnej/fazy S, podczas gdy przeciwciała przeciwko fosfo-histonowi H3 zostały wykorzystane do oznaczania mitotycznych jąder i komórek. Połączenie obu znaczników umożliwiłoby klasyfikację faz G0/G1 (faza przerwy), S (replikatywna) i M (mitotyczna) i posłużyłaby jako ważne narzędzie do oceny wpływu knockdownów genów mitotycznych lub mutantów zerowych na progresję cyklu komórkowego. Jednak odczynniki używane do oznaczania komórek znakowanych EdU są niekompatybilne z kilkoma drugorzędowymi znacznikami fluorescencyjnymi przeciwciał. Komplikuje to barwienie immunologiczne, w którym pierwszorzędowe i znakowane przeciwciała drugorzędowe są używane do oznaczania komórek mitotycznych o pH3-dodatnim. W artykule opisano krok po kroku protokół podwójnego znakowania EdU i pH3 w larwalnych nerwowych komórkach macierzystych Drosophila, systemie szeroko wykorzystywanym do badania czynników mitotycznych. Dodatkowo dostępny jest protokół do analizy obrazu i kwantyfikacji w celu przydzielenia znakowanych komórek do 3 odrębnych kategorii: G0 / G1, S, S>G2 / M (progresja od S do G2 / M) i fazy M.

Dwupłatowy mózg larwy Drosophila w trzecim stadium rozwojowym jest wykorzystywany jako modelowy system do badania podstawowych procesów komórkowych i rozwojowych9. Celem niniejszego badania było przedstawienie protokołu analizy przebiegu cyklu komórkowego w neuroblastach (NB) regionu CB, znakowanych EdU i pH3 (Rycina 1). Neuroblasty CB dzielą się na typ I i typ II i wykazują charakterystyczny wzór podziału asymetrycznego9. Każdy podzia...

Analiza cyklu komórkowego za pomocą znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) i fosfohistonu H3 (pH3) jest wieloetapową procedurą, która może wymagać rozległej optymalizacji. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który opisuje wszystkie etapy tej procedury, w tym analizę obrazu i kwantyfikację w celu rozróżnienia komórek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

In vivo cell cycle progression analysis is routinely performed in studies on genes regulating mitosis and DNA replication. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ...

W tym protokole nie tylko szczegółowo wyjaśniamy każdy etap integracji EDU i barwienia immunologicznego, ale także wyjaśniamy akwizycję obrazu, przetwarzanie obrazu i podajemy kilka wskazówek dotyczących analizy dużych zbiorów danych. Ta technika pozwala na alokację komórek w fazach G1, S i M. Będzie to szczególnie przydatne do analizy cyklu komórkowego w badaniach nad mutacjami niewpływającymi na geny mitotyczne.Spodziewamy się, że ludzie będą zmagać się przez dwa do trzech miesięcy, jeśli nie mają wcześniejszej wiedzy lub doświadczenia z tą techniką. Na początek dodaj pożywkę separacyjną Schneidera lub SM do dwóch kolejnych wgłębień błyszczącej płytki punktowej i dodaj PBS do kolejnego wgłębienia. Za pomocą kleszczy wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego i umieść je na chusteczce przesiąkniętej PBS, aby usunąć resztki pokarmu dla much.Umieść larwę w zagłębieniu z PBS, a następnie w kolejnym zagłębieniu zawierającym SM. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym użyj drobnych kleszczy, aby usunąć trzy czwarte dolnej części ciała larwy. Następnie delikatnie chwyć haczyki do ust larw jedną parą kleszczy i przytrzymaj naskórek drugiego końca drugą parą kleszczy. Odwróć głowę larwy na lewą stronę, wciskając haczyki gębowe do środka i jednocześnie odrywając tkankę na drugim końcu.Obserwuj mózg larwy z przyczepionymi wyimaginowanymi dyskami. Usuń inne tkanki przyczepione do mózgu i przenieś mózg do późniejszej kolejnej depresji z SM. Dodaj 100 mikrolitrów 100 mikromolowego roztworu EDU SM do innego zagłębienia na płytce Pyrex i inkubuj około 5 do 10 wypreparowanych mózgów w tym roztworze przez 2 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po utrwaleniu i barwieniu immunologicznym usuń PBST i dodaj koktajl detekcyjny EDU do wypreparowanych mózgów.Następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej w ciemności na neutatorze. Po 30 minutach przemyć próbki dwukrotnie PBST przez 10 minut na każde mycie w ciemności. Do barwienia DNA przygotuj 5 mikrogramów na mililitr roztworu Hoechst 33342.Usuń PBST po drugim płukaniu i dodaj 500 mikrolitrów roztworu Hoechst do wypreparowanych mózgów, a następnie inkubuj je w ciemności. Po 10 minutach wyjąć Hoechst i myć próbki PBST przez 10 minut. Postukaj rurką o stół laboratoryjny i pozwól mózgom się uspokoić.Wyjmij PBST z probówki, pozostawiając od 50 do 100 mikrolitrów. Odetnij koniec końcówki do mikropipet o pojemności 200 mikrolitrów i użyj jej do przeniesienia mózgów na czyste szklane szkiełko. Usuń Access PBST ze szkiełka, osuszając go paskami bibuły filtracyjnej.Nie pozwól, aby bibuła filtracyjna dotykała mózgu. Umieść kroplę rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego podłoża montażowego na mózg i ustaw mózg tak, aby brzuszny rdzeń nerwowy był skierowany w stronę szkiełka, a płaty skierowane do góry. Ułóż mózgi w jednym pliku, aby łatwiej było je obrazować szeregowo.Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu mózgu i inkubuj szkiełko przez noc w temperaturze od 2 do 6 stopni Celsjusza. W oprogramowaniu do akwizycji wybierz cel 63 razy. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe tuż nad zamontowanymi mózgami, aby ułatwić zlokalizowanie tkanki przez okular.Korzystając z eleganckiego kanału Hoechst 33342, znajdź mózg przez okular, a następnie przełącz się w tryb akwizycji w oprogramowaniu. Skonfiguruj 4 kanały, aby obrazować Hoechst 33342, podłogę Alexa 4 8 8, podłogę Alexa 5 6, 8 i podłogę Alexa 6 4 7. Użyj narzędzia Dye Assistant, aby automatycznie skonfigurować wybrane barwniki, lasery wzbudzające i filtry emisyjne.Ustaw pole widzenia tak, aby obejmowało cały płat mózgu. Wyobraź sobie całą objętość płata mózgowego, uzyskując ten podatek oddalony od siebie o 0,8 mikrona. Przechowuj wszystkie obrazy z sesji obrazowania w formacie biblioteki kropkowej L I F.Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz Fidżi, a następnie przeciągnij i upuść pliki LIF na Fidżi. Wybierz przeglądarkę danych z zakładki przeglądania stosu i użyj wirtualnego stosu z zakładki zarządzania pamięcią we wtyczce formatów bio. Obserwuj wielokanałowy obraz wyświetlany na obrazie J.Zmień kolor kanałów z paska menu, używając narzędzia obraz, kolor i kanały.Monitoruj neuroblasty oznaczone jako Miranda, które pojawiają się jako duże okrągłe komórki w centralnym obszarze mózgu. Narysuj interesujący Cię obszar za pomocą narzędzia elipsy nad każdym neuroblastem, aby uniknąć dwukrotnego liczenia neuroblastu. Z paska menu obrazu J wybierz pozycję Analizuj, Narzędzia i Menedżer zwrotu z inwestycji.Zaznacz wszystkie neuroblasty w bieżącej sekcji Z i naciśnij T po zaznaczeniu każdej komórki. Po oznaczeniu wszystkich neuroblastów w bieżącej sekcji Z, zmień kanały na pH3 i EDU i ręcznie policz liczbę neuroblastów EDU dodatnich, neuroblastów pH3 dodatnich, neuroblastów EDU i pH3 dodatnich oraz neuroblastów niebarwiących się dla żadnego markera. Wyszukaj neuroblasty i kolejne sekcje Z, usuń stare ROI i dodaj nowe ROI, aby policzyć neuroblasty w różnych stosach.Przygotuj arkusz kalkulacyjny i oblicz procentową zawartość neuroblastów we wszystkich czterech kategoriach dla każdego płata. Za pomocą arkuszy kalkulacyjnych przygotuj wykres słupkowy, pokazujący dane z puli dla procentowej liczby neuroblastów w każdej kategorii. Pokazano tutaj centralne neuroblasty mózgu z larw trzeciego stadium rozwojowego oznaczone Mirandą, EDU i pH3.Komórki przydzielono do faz G1/G0, S, SG2/M i M. W analizie pH3 EDU stwierdzono istotnie wyższy odsetek MMS19, utratę funkcji neuroblastów w fazie M w porównaniu z neuroblastami typu dzikiego. Ekspresja MMS19:eGFP w tle utraty funkcji MMS19 uratowała proporcję komórek w fazie M do poziomów typu dzikiego.Ważne jest, aby nie używać uszkodzonych mózgów do kolejnych kroków. A roztwór ED należy przygotować świeżo przed rozpoczęciem sekcji. Ten zasób może być wykorzystany jako szybkie wstępne badanie przesiewowe w celu zidentyfikowania defektów w określonych fazach cyklu komórkowego.Następnie można by przeprowadzić bardziej szczegółową analizę danego etapu.

5-ethynyl-2-deoxyuridinephospho-histone-h3-dual-labeling-protocol-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Opisano protokół analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila za pomocą cytometru Attune Acoustic Focusing. Protokół ten jednocześnie dostarcza informacji o względnej wielkości komórki, liczbie komórek, zawartości DNA i typie komórki poprzez śledzenie linii lub specyficzną dla tkanek ekspresję białek fluorescencyjnych in vivo.

Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Podawanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, ciężarnym myszom pozwala na analizę progresji cyklu komórkowego w komórkach nerwowych i progenitorowych w embrionalnym mózgu myszy. Metoda ta jest przydatna do określenia skutków stresu genotoksycznego, w tym promieniowania jonizującego, podczas rozwoju mózgu.

Ocena progresji cyklu komórkowego nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych w mózgu myszy rozwijającym się po stresie genotoksycznym

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół opisuje, jak wygenerować linię komórkową Drosophila S2, która jest wrażliwa na małocząsteczkowe inhibitory kinezyny-5. Przedstawiono również zastosowanie tych komórek w teście korekcji błędów opartym na komórkach.

Generowanie "humanizowanej" linii komórkowej Drosophila S2 wrażliwej na farmakologiczne hamowanie kinezyny-5

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Ten protokół ma na celu wizualizację agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila polytene.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Opisujemy dwa uzupełniające się protokoły do dokładnego określenia czasu trwania fazy S u S. cerevisiae za pomocą EdU, analogu tymidyny, który jest wprowadzany in vivo i wykrywany za pomocą chemii Click za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej. Pozwala to na łatwą charakterystykę czasu trwania replikacji DNA i przeoczonych defektów replikacji u mutantów.

Oznaczanie czasu trwania fazy S przy użyciu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny w Saccharomyces cerevisiae

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Naucz się podwójnego znakowania EdU i fosfohistonu H3 do analizy cyklu komórkowego w komórkach nerwowych Drosophila. Protokół umożliwia klasyfikację faz G1, S i M w mózgach larw.

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Protokół podwójnego znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny/fosfohistonu H3 do analizy progresji cyklu komórkowego w nerwowych komórkach macierzystych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów