Name: Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj automatyczny protokół selekcji ROI dla technologii spatial omics w badaniach proteomicznych i transkryptomicznych. Metoda ta zapewnia większą odtwarzalność niż ręczne podejście i umożliwia precyzyjne profilowanie populacji komórkowych w tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Thomasowi Wu za przetwarzanie plików NGS. Dziękujemy Jamesowi Ziai za dyskusję na temat wyników i recenzję manuskryptu oraz Meredith Triplet i Rachel Taylor za wewnętrzną korektę manuskryptu.

Wszystkie ludzkie tkanki zostały pozyskane z komercyjnych biobanków lub akredytowanych banków tkanek pod gwarancją, że uzyskano odpowiednią zgodę i świadomą zgodę Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.
UWAGA: Protokół jest wykonywany przy użyciu Discovery Ultra i GeoMx Digital Spatial Profiler. Szczegółowe informacje na temat odczynników, sprzętu i oprogramowania używanego w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.
1. Protokół automatycznej wizualizacji dla przestrzennych testów proteomicznych
<ol>
	<li>Zaprogramuj autostainer do stosowania przeciwciał fluorescencyjnych wizualizacji
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu autostainer kliknij przycisk home i wybierz Protokoły. Następnie kliknij Utwórz/Edytuj protokoły i wybierz RUO DISCOVERY Universal jako procedurę.</li>
		<li>Kliknij Pierwsza sekwencja > Depafanizacja > Depar v2. W przypadku średniej temperatury wybierz 72 stopnie C, a następnie kliknij Obróbka wstępna i wybierz Kondycjonowanie komórek i Zbiornik CC1. W przypadku bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni C, a następnie kliknij CC1 8 min i kontynuuj klikanie, aż zostanie wybrana CC1 64 min.</li>
		<li>Kliknij Inhibitor > Inhibitor DISCOVERY, a w polu Czas inkubacji wybierz 8 minut. Następnie kliknij Przeciwciało > inkubacji w wysokiej temperaturze Ab; dla niskiej temperatury wybierz 37 stopni C; W polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie Przeciwciało 6); dla Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 Minutes. 
		UWAGA: Ten protokół ma trzy różne liczby przeciwciał. Pierwszym przeciwciałem jest FAP, drugim Pan-Cytokeratyna, a trzecim przeciwciało X.</li>
		<li>Kliknij Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz 4 minuty. Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij Cy5 i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 godz. 8 min.</li>
		<li>Kliknij Podwójna sekwencja i wybierz Denaturacja przeciwciał, a następnie wybierz Przeciwciało denaturacja CC2-1, a dla Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni C. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi 8 minut. Następnie kliknij DS Inhibitor i wybierz Neutralizuj.</li>
		<li>Kliknij na DS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 Deg C. Następnie w polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie Przeciwciało 3), a w polu Plus Czas inkubacji wybierz opcję 32 minuty.</li>
		<li>Kliknij na DS Multimer HRP i wybierz DS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz opcję Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz opcję 4 minuty. Następnie, na odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Ms HRP, a dla czasu inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij DS Rhodamine 6G i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 Hr 8 Min.</li>
		<li>Kliknij Potrójne barwienie i wybierz Denaturacja przeciwciał TS, a następnie wybierz Denaturacja przeciwciał CC2-2, a dla Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni C. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi 8 minut. Następnie kliknij TS Inhibitor i wybierz TS Neutralize.</li>
		<li>Kliknij na TS Antibody, a dla Very Low Temperature (Bardzo niska temperatura) wybierz 37 Deg C. Następnie w polu Przeciwciało wybierz numer przeciwciała z etykiety dozownika (w tym przykładzie przeciwciało 7), a następnie w polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz opcję 32 minuty.</li>
		<li>Kliknij na TS Multimer HRP i wybierz TS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz opcję Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz opcję 4 minuty. Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij TS FAM i dla Długi czas inkubacji wybierz 0 godz. 8 min.</li>
		<li>Dodaj tytuł do protokołu. Wybierz numer protokołu, dodaj komentarz i kliknij Aktywny, a następnie Zapisz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj slajdy, wydrukuj etykiety i uruchom autostainer
	<ol>
		<li>Sprzedawca wypieków zakupił skrawki tkanek ludzkich FFPE (utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie) w piecu ustawionym na 70 °C na 20-60 minut. Podczas pieczenia slajdów drukuj etykiety, klikając Utwórz etykietę w oprogramowaniu automatycznego stainera. Następnie kliknij Protokoły, wybierz numer protokołu i kliknij Zamknij/Drukuj. Dodaj odpowiednie informacje na etykiecie slajdu i kliknij Drukuj.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej (RT). Zastosuj poprzednio wydrukowane etykiety protokołu do odpowiednich slajdów.</li>
		<li>Załadować dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania przeciwciałami zgodnie z numerem etykiety przeciwciała przypisanym w kroku 1.1. W tym protokole należy użyć przeciwciała 6 dla FAP w stężeniu 1 μg/ml, przeciwciała 3 dla pan-cytokeratyny w stężeniu 0,1 μg/ml i przeciwciała 7 dla przeciwciała X w stężeniu 2,5 μg/ml. Rozcieńczyć każde przeciwciało w określonym rozcieńczalniku i zalać dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania.</li>
		<li>Zbierz wspomniane powyżej wstępnie napełnione dozowniki odczynników blokujących, wykrywających i wzmacniających i umieść je na tacy na odczynniki. Załaduj slajdy do tac na slajdy (do 30 slajdów na przebieg) i kliknij Bieganie, a następnie Tak. Należy pamiętać, że DAPI nie jest używany do barwienia jądrowego.</li>
		<li>Potwierdź rozpoczęcie cyklu, sprawdzając czas trwania w oprogramowaniu autostainera. Wykonanie protokołu zajmuje ~11 godzin i może działać w nocy.</li>
		<li>Następnego dnia upewnij się, że przebieg został zakończony, obserwując zielone światła na szczelinach tacy na slajdy. Następnie zdejmij szkiełka z instrumentu i energicznie przepłucz szkiełka w 1x buforze reakcyjnym, aż płynny roztwór szkiełka nakrywkowego zostanie całkowicie usunięty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół platformy profilowania przestrzennego do oznaczania proteomiki
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem proteomiki przestrzennej wskazanym w poniższej uwadze. Uwzględnij następujące zmiany w protokole, aby umożliwić procedurę automatycznego etykietowania 3-plex.</li>
		<li>Wykonaj kroki 1.2.1-1.2.6 dzień przed rozpoczęciem protokołu proteomiki przestrzennej i przejdź bezpośrednio do etapu pobierania antygenu protokołu proteomiki przestrzennej po wykonaniu kroku 1.2.6. Pomiń procedurę wizualizacji opisaną w protokole proteomiki profilowania przestrzennego.</li>
		<li>Zastąp SYTO 13 SYTO 64 przy 5000 nM, aby umożliwić integrację fluoroforu. Rozcieńczyć SYTO 64 w 1x TBS i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 15 min.</li>
		<li>Podczas ustawiania parametrów skanowania na platformie profilowania przestrzennego należy wybrać filtry i kanały ostrości zgodnie z fluoroforami używanymi w panelu wizualizacji, aby umożliwić integrację 3-plex. Użyj FITC dla DISCOVERY FAM i ustaw ekspozycję na 200 ms, użyj Cy3 dla DISCOVERY Rhodamine 6G i ustaw ekspozycję na 200 ms, użyj Texas Red dla SYTO 64 i ustaw ekspozycję na 50 ms (określ to jako kanał ostrości), a na koniec użyj Cy5 dla DISCOVERY Cy5, ustaw ekspozycję na 200 ms, i zapisz zmiany. 
		UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące protokołu proteomiki profilowania przestrzennego znajdują się na oficjalnej stronie internetowej zakładka Wsparcie po wybraniu Dokumentacja > Podręczniki użytkownika. Tutaj poszukaj protokołu białkowego dla nCounter przy użyciu Bond RX.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wybór ROI dla przestrzennych testów transkryptomicznych
<ol>
	<li>Sekcje granulek komórek FFPE piec w piekarniku nastawionym na 70 °C przez 20-60 min. Postępuj zgodnie z protokołem NGS platformy do profilowania przestrzennego wskazanym w poniższej notatce i skanuj slajdy na platformie do profilowania przestrzennego, wybierając rozmiary 50 μm i 300 μm. Podkreślono następujące zalecenie dotyczące testu transkryptomiki przestrzennej:
	<ol>
		<li>Przygotowując bibliotekę, jeśli wybrano różne rozmiary ROI, zsumuj ROI o podobnych rozmiarach, aby utworzyć jedną bibliotekę na rozmiar. Ma to na celu zapewnienie, że dla wszystkich zwrotów z inwestycji zostaną osiągnięte wystarczające głębokości sekwencjonowania bez odchyleń od rozmiaru. 
		UWAGA: Szczegółowa instrukcja obsługi platformy do profilowania przestrzennego znajduje się na oficjalnej stronie internetowej w zakładce Wsparcie po wybraniu opcji Dokumentacja > Instrukcje obsługi. Tutaj poszukaj protokołu RNA dla aplikacji NGS przy użyciu Bond RX.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nerurkar, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+spatial+profiling+of+cancer+tissues+in+the+era+of+immunotherapy%3A+The+potential+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise.</a> Cancers. 12 (9), 2572(2020).</li>
<li>Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+pathology%3A+a+user%27s+review+of+a+highly+multiplexed+method+for+in+situ+analysis+of+protein+and+RNA+expression+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue.</a> Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).</li>
<li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview">https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview</a> (2022).</li>
<li>NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf</a> (2022).</li>
<li>McCart Reed, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+spatial+profiling+application+in+breast+cancer%3A+a+user%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%3A+An+International+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective.</a> Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).</li>
<li>McNamara, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomic+characterization+of+HER2-positive+breast+tumors+through+neoadjuvant+therapy+predicts+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response.</a> Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).</li>
<li>Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+for+pathologists%3A+Protocols%2C+pitfalls%2C+and+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).</li>
<li>Muñoz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+targeted+photothermal+ablation+improves+tumor+specificity+and+immune+modulation+in+a+rat+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma.</a> Communications Biology. 3 (1), 783(2020).</li>
<li>Coleman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronidase+impairs+neutrophil+function+and+promotes+Group+B+Streptococcus+invasion+and+preterm+labor+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates.</a> mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).</li>
<li>Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantitative+assessment+of+PD-L1+using+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).</li>
<li>Carter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+spatially+defined+immune+%28micro%29landscapes+of+early-stage+PD-L1-positive+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).</li>
<li>Busse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+in+neuroendocrine+neoplasms+unveil+immunosuppressive+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment.</a> Cancers. 12 (11), 3448(2020).</li>
<li>Kulasinghe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lung+SARS-CoV-2+and+influenza+virus+infection+dissects+virus-specific+host+responses+and+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures.</a> European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).</li>
<li>Li, X., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+bulk%2C+single-cell+to+spatial+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing.</a> International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).</li>
<li>Merritt, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+digital+spatial+profiling+of+proteins+and+RNA+in+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).</li>
<li>Van, T. M., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+perspective+on+GeoMxTM+digital+spatial+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno-Oncology+Technology%22%5BJournal%5D)">A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling.</a> Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).</li>
<li>Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf">https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf</a> (2020).</li>
<li>Bergholtz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+spatial+profiling+for+breast+cancer+research+with+the+geomx+spatial+profiler%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler.</a> Cancers. 13 (17), 4456(2021).</li>
<li>Hwang, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+spatial+transcriptomics+of+archival+pancreatic+cancer+reveals+multi-compartment+reprogramming+after+neoadjuvant+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Jerby-Arnon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+immune+and+genetic+mechanisms+shape+oncogenic+programs+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma.</a> Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).</li>
</ol>

Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan i Sandra Rost są pracownikami i akcjonariuszami firmy Genentech, należącej do Grupy Roche. Inne firmy, które są częścią Roche, produkują odczynniki i instrumenty używane w tym manuskrypcie. Ciara Martin jest pełnoetatowym pracownikiem firmy NanoString Technologies Inc., która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym manuskrypcie.

Do tej pory bezpośrednio sprzężone przeciwciała fluorescencyjne w protokole ręcznym są najczęściej używane jako panele wizualizacyjne dla proteomiki przestrzennej lub przestrzennych testów transkryptomicznych 9,10. Jednak zastosowanie bezpośrednio sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych może być wyzwaniem w przypadku mniej licznych markerów, co ogranicza wybór odpowiednich przeciwciał. Protokół ten pokazuje, że etykietowanie markerów wizualizacyjnych można zaut...

Postępy w technikach multipleksowania nadal dostarczają lepszych narzędzi do charakteryzowania celów obecnych w nowotworach. Mikrośrodowisko nowotworu (TME) to złożony system komórek nowotworowych, naciekających komórki odpornościowe i zrębu, w którym informacje przestrzenne mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia i interpretacji mechanizmów interakcji między interesującymi biomarkerami1. Dzięki nowym technikom, takim jak GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) i 10x Visium, wiele obiektów może być wykrywanych i określanych ilościowo jednocześnie w ich kontekście przestrzennym. Zastosowanie protokołów immunofluorescencyjnych, które ułatwiają wizualizację tkanek, może jeszcze bardziej poprawić możliwości tych technologii w zakresie profilowania przestrzennego.
Technologia Spatial Omiics, na której skupiliśmy się przy opracowywaniu tej metody, składa się z testów proteomiki przestrzennej i transkryptomiki, w których oligonukleotydy są przyłączane do przeciwciał lub sond RNA za pomocą światłoczułego łącznika światłoczułego na promieniowanie UV. Preparaty histologiczne są znakowane tymi oligo-sprzężonymi przeciwciałami lub sondami, a następnie obrazowane na platformie do profilowania przestrzennego. Następnie do oświetlenia wybierane są ROI o różnych rozmiarach i kształtach, a fotorozszczepione oligonukleotydy są odsysane i zbierane na 96-dołkowej płytce. Fotorozszczepione oligonukleotydy są przygotowywane do ilościowego oznaczania za pomocą systemu Nanostring nCounter lub sekwencjonowania nowej generacji (NGS)2,3 (Rysunek 1)4,5.
Rozmieszczenie komórek różni się w obrębie tkanek, a możliwość scharakteryzowania konkretnych lokalizacji komórek za pomocą wybranych markerów i różnych wielkości ROI jest bardzo ważna dla pełnego zrozumienia środowiska tkankowego i identyfikacji specyficznych cech. We wspomnianej tutaj technologii Spatial Omiics standardowy protokół wizualizacji wykorzystuje bezpośrednio sprzężone przeciwciała i jest protokołem ręcznym. Standardowymi markerami do rozróżnienia guza i zrębu są panCytokeratyna (panCK) i CD456,7, ale dodatkowe markery są niezbędne do celowania w określone populacje komórek będących przedmiotem zainteresowania. Co więcej, stosowanie bezpośrednio sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych nie ma amplifikacji, co ogranicza selekcję przeciwciał do licznych markerów. Ponadto testy ręczne podlegają większej zmienności niż zautomatyzowane przepływy pracy8. Dlatego pożądane jest posiadanie konfigurowalnego, zautomatyzowanego i wzmocnionego protokołu wizualizacji do wyboru zwrotu z inwestycji.
Tutaj badanie pokazuje, że do przestrzennych testów proteomicznych, technologia TSA może być używana do protokołów wizualizacji na zautomatyzowanej platformie, co skutkuje bardziej ukierunkowanym i ustandaryzowanym testem. Ponadto testy oparte na TSA umożliwiają stosowanie markerów o niskiej ekspresji, zwiększając zakres celów, które można wybrać do wizualizacji. Test 3-plex dla panCK, FAP i przeciwciała X został opracowany przy użyciu zautomatyzowanej platformy, na której wykorzystano panCK i FAP do rozróżnienia odpowiednio guza i zrębu. Przeciwciało X jest białkiem zrębu często spotykanym w nowotworach, ale jego biologia i wpływ na odporność przeciwnowotworową nie są w pełni poznane. Scharakteryzowanie tekstury immunologicznej w obszarach bogatych w przeciwciało X może wyjaśnić jego rolę w odporności przeciwnowotworowej i odpowiedzi terapeutycznej, a także jego potencjał jako celu dla leków.
Podczas gdy niestandardowe zautomatyzowane panele wizualizacji TSA okazały się skuteczne w testach proteomiki przestrzennej, zastosowanie tych testów do testów transkryptomicznych przestrzennych nie mogło zostać potwierdzone. Jest to najprawdopodobniej spowodowane odczynnikami i protokołem używanym w protokołach automatycznej wizualizacji, które wydają się zagrażać integralności RNA. Uznanie, że zautomatyzowany protokół etykietowania markerów wizualizacyjnych może być stosowany do przestrzennych testów proteomicznych, ale nie do przestrzennych testów transkryptomicznych, dostarcza ważnych wskazówek dotyczących projektów testów technologii Spatial Omics.
Dodatkowo, badanie pokazuje, że przestrzenny test transkryptomiczny może być używany do profilowania celów w regionach o średnicy 50 μm, czyli około 15 komórek. Wybrano dwa ROI o różnych rozmiarach, aby przetestować zdolność testu do wykrywania transkryptów w małych ROI. Dla każdego regionu zainteresowania zebrano oligonukleotydy odpowiadające 1800 celom mRNA i umieszczono je w bibliotekach zgodnie z protokołem platformy profilowania przestrzennego. Biblioteki były indywidualnie indeksowane, a następnie łączone w pule i sekwencjonowane. Pozwoliło to na ocenę zarówno wydajności łączenia, jak i zdolności do identyfikacji określonych populacji komórek w małych zwrotach z inwestycji.
Ten artykuł pokazuje, że dla przestrzennych testów proteomicznych, zautomatyzowany protokół do kierowania wyborem ROI na konkretnych markerach zainteresowania może być wykorzystany do selektywnego ukierunkowania badania odpowiednich obszarów tkanki i scharakteryzowania środowiska przestrzennego tkanki. Ponadto wykazujemy, że mniejsze ROI mogą być wykorzystywane do przestrzennych testów transkryptomicznych w celu wykrycia i scharakteryzowania określonych populacji komórek.

<table><tbody><tr><td>10x Sól fizjologiczna buforowana Tris (TBS)</td><td>Technologie sygnalizacji komórkowej</td><td>12498S</td><td>Rozcieńczony do 1x TBS w wodzie uzdatnionej DEPC</td></tr><tr><td>Przeciwciało X (nieujawnione)</td><td></td><td></td><td>przeciwciało zaślepione ze względu na poufność</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>Można użyć innego</td></tr><tr><td>Kondycjonowanie komórek DISCOVERY (CC1)</td><td>Ventana</td><td>950-500</td><td></td></tr><tr><td>DISCOVERY Cy5 Kit</td><td>Ventana</td><td>760-238</td><td>określany jako Cy5</td></tr><tr><td>DISCOVERY FAM Kit</td><td>Ventana</td><td>760-243</td><td>określany jako FAM</td></tr><tr><td>DISCOVERY Goat Ig Block</td><td>Ventana</td><td>760-6008</td><td>określany jako Gt Ig Block</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anty-Ms HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4310</td><td>określany jako OMap anty-Ms HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY OmniMap anty-Rb HRP</td><td>Ventana</td><td>760-4311</td><td>Określany jako OMap anty-Rb HRP</td></tr><tr><td>DISCOVERY Rhodamine 6G Kit</td><td>Ventana</td><td>760-244</td><td>Określany jako Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>DISCOVERY ULTRA Automatyczny system przygotowania preparatów</td><td>Ventana</td><td>05 987 750 001 / N750-DISU-FS</td><td>Określany jako autostainer w rękopisie</td></tr><tr><td>FAP [EPR20021] Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>Ab207178</td><td></td></tr><tr><td>GeoMx Cyfrowy profiler przestrzenny NanoString</td><td></td><td>GMX-DSP-1Y</td><td>Określany jako platforma do profilowania przestrzennego na manuskrypcie</td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Inny może być użyty</td></tr><tr><td>Przeciwciało Pan-cytokeratyny [AE1/AE3]</td><td>Abcam</td><td>Ab27988</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python</td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny (10x)</td><td>Ventana</td><td>950-300</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>SYTO 64</td><td>ThermoFisher</td><td>S11346</td><td></td></tr><tr><td>Kondycjonowanie komórek ULTRA (ULTRA CC2)</td><td>Ventana</td><td>950-223</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał Ventana z kazeiną</td><td>Ventana</td><td>760-219</td><td>Określany jako określony rozcieńczalnik w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Ventana Dozownik przeciwciał pierwotnych</td><td>Ventana</td><td></td><td>Numer katalogowy zależy od numeru dozownika</td></tr></tbody></table>

profilowanie przestrzenne ekspresji białek i rna w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multipleksowanie umożliwia ocenę kilku markerów na tej samej tkance, zapewniając jednocześnie kontekst przestrzenny. Technologie Spatial Omics umożliwiają multipleksowanie zarówno białek, jak i RNA, wykorzystując odpowiednio fotorozszczepialne oligotagowane przeciwciała i sondy. Oligonukleotydy są rozszczepiane i oznaczane ilościowo z określonych regionów w tkance, aby wyjaśnić podstawową biologię. W tym przypadku badanie pokazuje, że zautomatyzowane niestandardowe protokoły wizualizacji przeciwciał mogą być wykorzystywane do kierowania wyborem ROI w połączeniu z przestrzennymi testami proteomicznymi. Ta konkretna metoda nie wykazała akceptowalnej wydajności w testach transkryptomiki przestrzennej. Protokół opisuje opracowanie testu immunofluorescencyjnego 3-plex (IF) do wizualizacji markerów na zautomatyzowanej platformie, wykorzystującego wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) do wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego z danego docelowego białka i zwiększenia puli przeciwciał do wyboru. Protokół wizualizacji został zautomatyzowany przy użyciu dokładnie zwalidowanego testu 3-plex, aby zapewnić jakość i odtwarzalność. Ponadto oceniono wymianę DAPI na barwniki SYTO, aby umożliwić obrazowanie testów IF opartych na TSA na platformie profilowania przestrzennego. Dodatkowo przetestowaliśmy możliwość wyboru małych ROI za pomocą testu transkryptomiki przestrzennej, aby umożliwić badanie wysoce specyficznych obszarów zainteresowania (np. obszarów wzbogaconych o dany typ komórki). Zebrano ROI o średnicy 50 μm i 300 μm, co odpowiada odpowiednio około 15 i 100 ogniwom. Próbki umieszczono w bibliotekach i zsekwencjonowano w celu zbadania zdolności do wykrywania sygnałów z małych ROI i regionów tkanki specyficznych dla profilu. Ustaliliśmy, że technologie proteomiki przestrzennej czerpią duże korzyści ze zautomatyzowanych, ustandaryzowanych protokołów, które kierują wyborem zwrotu z inwestycji. Chociaż ten protokół automatycznej wizualizacji nie był kompatybilny z testami transkryptomiki przestrzennej, byliśmy w stanie przetestować i potwierdzić, że określone populacje komórek można z powodzeniem wykryć nawet w małych ROI za pomocą standardowego protokołu ręcznej wizualizacji.

Zautomatyzowany protokół wizualizacji wspomagający wybór ROI 
W niniejszej pracy przedstawiamy zastosowanie zautomatyzowanego, dostosowanego protokołu IF opartego na TSA w celu wizualizacji tkanki i wyboru konkretnych ROI. Opracowanie panelu wizualizacyjnego z wykorzystaniem czerniaka oraz ludzkiej skóry prawidłowej jako tkanek kontrolnych obejmowało badanie stabilności epitopów, optymalizację intensywności markerów oraz ocenę przenikania sygnałów (bleed-through) za pomocą kontroli z pominięciem jedne...

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Protokół ten pomaga w wyborze regionów zainteresowania dla technologii omiki przestrzennej, co pozwala na bardziej ukierunkowaną charakterystykę tkanek lub populacji komórek. Zautomatyzowany protokół wyboru ROI w testach proteomicznych jest bardziej niezawodny i powtarzalny niż protokoły ręczne, a wykorzystanie 50-mikrometrowych ROI do testów transkryptomicznych umożliwia profilowanie określonych populacji komórek. Zacznij od zaprogramowania automatycznego barwnika do aplikacji przeciwciał fluorescencyjnych do wizualizacji.W oprogramowaniu autostainer kliknij przycisk home i wybierz Protokoły. Następnie kliknij Utwórz/Edytuj protokoły i wybierz RUO Discovery Universal jako procedurę. Kliknij na Pierwsza sekwencja, a następnie wybierz Deparaffinazation, a następnie Depar v2.W przypadku średniej temperatury wybierz 72 stopnie Celsjusza, a następnie kliknij Obróbka wstępna i wybierz Kondycjonowanie komórek i Zbiornik CC1. W przypadku bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni Celsjusza, a następnie kliknij CC1 osiem minut i kontynuuj klikanie, aż zostanie wybrana CC1 64 minuty. Kliknij Inhibitor, a następnie wybierz Inhibitor DISCOVERY, a w polu Czas inkubacji wybierz osiem minut.Następnie kliknij Przeciwciało, a następnie Inkubacja przeciwciał w wysokiej temperaturze. W przypadku niskiej temperatury wybierz 37 stopni Celsjusza. W przypadku przeciwciał wybierz ANTIBODY 6 z etykiety dozownika.W polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 minuty. Kliknij na Multimer HRP, a następnie wybierz Multimer HRP Blocker. Następnie w przypadku blokowania przeciwciał wybierz Gt Ig Block.A dla czasu inkubacji wybierz cztery minuty. Następnie, na odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap Anti-Rb HRP, a dla czasu inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij Cy5, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut.Kliknij Podwójna sekwencja i wybierz Denaturacja przeciwciał. Następnie wybierz Przeciwciało denaturacji CC2-1, a dla bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni Celsjusza. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi osiem minut.Następnie kliknij DS Inhibitor i wybierz Neutralizuj. Kliknij na DS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 stopni Celsjusza. Następnie w polu Przeciwciało wybierz PRZECIWCIAŁO 3 z etykiety dozownika.A dla czasu inkubacji Plus wybierz 32 minuty. Kliknij na DS Multimer HRP i wybierz DS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz cztery minuty.Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Ms HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij DS Rhodamine 6G, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut. Kliknij Potrójne barwienie i wybierz Denaturacja przeciwciał TS, a następnie wybierz Denaturacja przeciwciał CC2-2, a w przypadku Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni Celsjusza.Upewnij się, że czas inkubacji wynosi osiem minut. Następnie kliknij TS Inhibitor i wybierz TS Neutralize. Kliknij na TS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 stopni Celsjusza.Następnie w polu Przeciwciało wybierz PRZECIWCIAŁO 7 z etykiety dozownika, a w polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 minuty. Kliknij na TS Multimer HRP i wybierz TS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz cztery minuty.Następnie na odczynniku Multimer HRP wybierz OMap Anti-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij TS FAM, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut. Kliknij Zapisz i dodaj tytuł do protokołu.Wybierz numer protokołu, dodaj komentarz i kliknij Aktywny, a następnie Zapisz. Piecz zakupione przez dostawcę, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie skrawki tkanek ludzkich w piekarniku nastawionym na 70 stopni Celsjusza przez 20 do 60 minut. Podczas pieczenia slajdów drukuj etykiety, klikając Utwórz etykietę w oprogramowaniu automatycznego stainera.Następnie kliknij Protokoły, wybierz numer protokołu i kliknij Zamknij/Drukuj. Dodaj odpowiednie informacje na etykiecie slajdu i kliknij Drukuj. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.Zastosuj poprzednio wydrukowane etykiety protokołu do odpowiednich slajdów. Załaduj dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania przeciwciałami zgodnie z numerami etykiet przeciwciał. Rozcieńczyć każde przeciwciało w określonym rozcieńczalniku i zalać dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania.Zbierz wstępnie napełnione dozowniki odczynników blokujących, wykrywających i amplifikacyjnych i umieść je na tacy na odczynniki do instrumentów. Załaduj slajdy do szuflad na prowadnice i kliknij Uruchomione, a następnie Tak. Potwierdź rozpoczęcie cyklu, sprawdzając czas trwania w oprogramowaniu autostainera.Następnego dnia upewnij się, że przebieg został zakończony, obserwując zielone światła na szczelinach szuflady przesuwnej. Następnie zdejmij szkiełka z instrumentu i energicznie przepłucz szkiełka w 1x buforze reakcyjnym, aż do całkowitego usunięcia płynnego roztworu szkiełka nakrywkowego. Zamień SYTO 13 na SYTO 64 przy 5 000 nanomolowców, aby umożliwić integrację fluoroforu.Rozcieńczyć SYTO 64 w 1x TBS i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 15 minut. Użyj FITC dla DISCOVERY Fam i ustaw ekspozycję na 200 milisekund. Użyj Cy3 dla DISCOVERY Rhodamine 6G i ustaw ekspozycję na 200 milisekund.Użyj czerwieni teksańskiej dla SYTO 64 i ustaw ekspozycję na 50 milisekund. Określ SYTO 64 jako kanał ostrości, a na koniec użyj Cy5 dla DISCOVERY Cy5. Ustaw ekspozycję na 200 milisekund i zapisz zmiany.Piecz utrwalone w formalinie sekcje komórek zatopione w parafinie w piekarniku nastawionym na 70 stopni Celsjusza przez 20 do 60 minut. Zeskanuj szkiełka na platformie do profilowania przestrzennego i wybierz rozmiary 50 mikrometrów i 300 mikrometrów. Protokół automatycznej wizualizacji został opracowany poprzez włączenie kontroli "pomiń jeden" w celu potwierdzenia, że nie ma przecieku z sąsiednich kanałów.Mapa cieplna log 2 wszystkich markerów zawartych w teście proteomiki przestrzennej porównująca ręczny protokół pan-cytokeratyny CD 45 w kolorze czarnym z automatycznym protokołem 3-plex w kolorze szarym pokazuje wartość R Spearmana wynoszącą 0,88. Spośród 31 przeciwciał użytych w testach, 23 przeciwciała miały wartość R Spearmana wyższą lub równą 0,5. Mapa cieplna log 2 wybranych celów zawartych w teście transkryptomiki przestrzennej porównująca ręczny protokół pan-cytokeratyny CD 45 w kolorze czarnym z protokołem automatycznym 3-plex w kolorze szarym wykazała różnice w tych wartościach.Dane sekwencjonowania dla protokołu automatycznej wizualizacji 3-plex wykazały niższe wartości w porównaniu z ręcznym protokołem wizualizacji pan-cytokeratyny CD 45, co znajduje również odzwierciedlenie w niskich wartościach R Spearmana wynoszących 0,15. Zaobserwowano również utratę zakresu dynamiki podczas korzystania z automatycznego protokołu wizualizacji 3-plex. Wykrywanie małych ROI w protokole transkryptomiki przestrzennej przeprowadzono poprzez wybór kolistych regionów zainteresowania o średnicy 50 mikrometrów i 300 mikrometrów dla wybranych celów na różnych liniach komórkowych, które były porównywalne między dwoma regionami o rozmiarach zainteresowania po normalizacji.Ten protokół dla zautomatyzowanych paneli wizualizacyjnych może być dostosowywany przez badaczy poprzez wymianę znaczników w celu opracowania paneli, które precyzyjnie definiują zwrot z inwestycji, aby odpowiedzieć na ich pytania dotyczące proteomiki przestrzennej.

spatial-profiling-protein-rna-expression-tissue-an-approach-to-fine

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Mikrosekcja laserowa została zastosowana do analizy profilu ekspresji genów w konkretnych przedziałach tarczki skrzydła Drosophila poddanych lokalnemu RNAi in vivo. RNA wyekstrahowany z równoważnych obszarów przedziałów wyciszonych i niewyciszonych przeanalizowano za pomocą ilościowej RT-PCR w celu określenia porównawczego profilu ekspresji genów w kontekście rodzimej mikroekologii tkanki.

Mikrosekcja laserowa zastosowana do profilowania ekspresji genów w podzbiorze komórek z dysku skrzydłowego Drosophila

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Obecnie, barwienie immunofluorescencyjne na stałych komórkach jest metodą wyboru do określania poziomów ekspresji białek, gdy informacja morfologiczna jest również niezbędna. Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół przewiduje alternatywną metodę immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie.

Oznaczanie poziomu ekspresji białek w hodowanych komórkach metodą immunocytochemii na blokach komórkowych zatopionych w parafinie

Poniższa procedura opisuje metodę przestrzennej i czasowej kontroli inicjacji guza melanocytowego w skórze grzbietowej myszy, przy użyciu genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy. Protokół ten opisuje makroskopową i mikroskopową inicjację czerniaka skóry.

Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji czerniaka myszy ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów

Poznaj automatyczny protokół selekcji ROI dla technologii spatial omics w badaniach proteomicznych i transkryptomicznych. Metoda ta zapewnia większą odtwarzalność niż ręczne podejście i umożliwia precyzyjne profilowanie populacji komórkowych w tkankach.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Przeglądaj więcej filmów