Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

Protokół ten pomaga w wyborze regionów zainteresowania dla technologii omiki przestrzennej, co pozwala na bardziej ukierunkowaną charakterystykę tkanek lub populacji komórek. Zautomatyzowany protokół wyboru ROI w testach proteomicznych jest bardziej niezawodny i powtarzalny niż protokoły ręczne, a wykorzystanie 50-mikrometrowych ROI do testów transkryptomicznych umożliwia profilowanie określonych populacji komórek. Zacznij od zaprogramowania automatycznego barwnika do aplikacji przeciwciał fluorescencyjnych do wizualizacji.

W oprogramowaniu autostainer kliknij przycisk home i wybierz Protokoły. Następnie kliknij Utwórz/Edytuj protokoły i wybierz RUO Discovery Universal jako procedurę. Kliknij na Pierwsza sekwencja, a następnie wybierz Deparaffinazation, a następnie Depar v2.

W przypadku średniej temperatury wybierz 72 stopnie Celsjusza, a następnie kliknij Obróbka wstępna i wybierz Kondycjonowanie komórek i Zbiornik CC1. W przypadku bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni Celsjusza, a następnie kliknij CC1 osiem minut i kontynuuj klikanie, aż zostanie wybrana CC1 64 minuty. Kliknij Inhibitor, a następnie wybierz Inhibitor DISCOVERY, a w polu Czas inkubacji wybierz osiem minut.

Następnie kliknij Przeciwciało, a następnie Inkubacja przeciwciał w wysokiej temperaturze. W przypadku niskiej temperatury wybierz 37 stopni Celsjusza. W przypadku przeciwciał wybierz ANTIBODY 6 z etykiety dozownika.

W polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 minuty. Kliknij na Multimer HRP, a następnie wybierz Multimer HRP Blocker. Następnie w przypadku blokowania przeciwciał wybierz Gt Ig Block.

A dla czasu inkubacji wybierz cztery minuty. Następnie, na odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap Anti-Rb HRP, a dla czasu inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij Cy5, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut.

Kliknij Podwójna sekwencja i wybierz Denaturacja przeciwciał. Następnie wybierz Przeciwciało denaturacji CC2-1, a dla bardzo wysokiej temperatury wybierz 100 stopni Celsjusza. Upewnij się, że czas inkubacji wynosi osiem minut.

Następnie kliknij DS Inhibitor i wybierz Neutralizuj. Kliknij na DS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 stopni Celsjusza. Następnie w polu Przeciwciało wybierz PRZECIWCIAŁO 3 z etykiety dozownika.

A dla czasu inkubacji Plus wybierz 32 minuty. Kliknij na DS Multimer HRP i wybierz DS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz cztery minuty.

Następnie, w odczynniku Multimer HRP, wybierz OMap anty-Ms HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij DS Rhodamine 6G, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut. Kliknij Potrójne barwienie i wybierz Denaturacja przeciwciał TS, a następnie wybierz Denaturacja przeciwciał CC2-2, a w przypadku Bardzo wysoka temperatura wybierz 100 stopni Celsjusza.

Upewnij się, że czas inkubacji wynosi osiem minut. Następnie kliknij TS Inhibitor i wybierz TS Neutralize. Kliknij na TS Antibody, a dla Very Low Temperature wybierz 37 stopni Celsjusza.

Następnie w polu Przeciwciało wybierz PRZECIWCIAŁO 7 z etykiety dozownika, a w polu Plus Incubation Time (Czas inkubacji Plus) wybierz 32 minuty. Kliknij na TS Multimer HRP i wybierz TS Multimer HRP Blocker. Następnie w polu Blokowanie przeciwciał wybierz Gt Ig Block, a w polu Czas inkubacji wybierz cztery minuty.

Następnie na odczynniku Multimer HRP wybierz OMap Anti-Rb HRP, a w polu Czas inkubacji wybierz 16 minut. Następnie kliknij TS FAM, a dla długiego czasu inkubacji wybierz godzinę zero, osiem minut. Kliknij Zapisz i dodaj tytuł do protokołu.

Wybierz numer protokołu, dodaj komentarz i kliknij Aktywny, a następnie Zapisz. Piecz zakupione przez dostawcę, utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie skrawki tkanek ludzkich w piekarniku nastawionym na 70 stopni Celsjusza przez 20 do 60 minut. Podczas pieczenia slajdów drukuj etykiety, klikając Utwórz etykietę w oprogramowaniu automatycznego stainera.

Następnie kliknij Protokoły, wybierz numer protokołu i kliknij Zamknij/Drukuj. Dodaj odpowiednie informacje na etykiecie slajdu i kliknij Drukuj. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.

Zastosuj poprzednio wydrukowane etykiety protokołu do odpowiednich slajdów. Załaduj dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania przeciwciałami zgodnie z numerami etykiet przeciwciał. Rozcieńczyć każde przeciwciało w określonym rozcieńczalniku i zalać dozowniki przeciwciał wielokrotnego napełniania.

Zbierz wstępnie napełnione dozowniki odczynników blokujących, wykrywających i amplifikacyjnych i umieść je na tacy na odczynniki do instrumentów. Załaduj slajdy do szuflad na prowadnice i kliknij Uruchomione, a następnie Tak. Potwierdź rozpoczęcie cyklu, sprawdzając czas trwania w oprogramowaniu autostainera.

Następnego dnia upewnij się, że przebieg został zakończony, obserwując zielone światła na szczelinach szuflady przesuwnej. Następnie zdejmij szkiełka z instrumentu i energicznie przepłucz szkiełka w 1x buforze reakcyjnym, aż do całkowitego usunięcia płynnego roztworu szkiełka nakrywkowego. Zamień SYTO 13 na SYTO 64 przy 5 000 nanomolowców, aby umożliwić integrację fluoroforu.

Rozcieńczyć SYTO 64 w 1x TBS i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 15 minut. Użyj FITC dla DISCOVERY Fam i ustaw ekspozycję na 200 milisekund. Użyj Cy3 dla DISCOVERY Rhodamine 6G i ustaw ekspozycję na 200 milisekund.

Użyj czerwieni teksańskiej dla SYTO 64 i ustaw ekspozycję na 50 milisekund. Określ SYTO 64 jako kanał ostrości, a na koniec użyj Cy5 dla DISCOVERY Cy5. Ustaw ekspozycję na 200 milisekund i zapisz zmiany.

Piecz utrwalone w formalinie sekcje komórek zatopione w parafinie w piekarniku nastawionym na 70 stopni Celsjusza przez 20 do 60 minut. Zeskanuj szkiełka na platformie do profilowania przestrzennego i wybierz rozmiary 50 mikrometrów i 300 mikrometrów. Protokół automatycznej wizualizacji został opracowany poprzez włączenie kontroli "pomiń jeden" w celu potwierdzenia, że nie ma przecieku z sąsiednich kanałów.

Mapa cieplna log 2 wszystkich markerów zawartych w teście proteomiki przestrzennej porównująca ręczny protokół pan-cytokeratyny CD 45 w kolorze czarnym z automatycznym protokołem 3-plex w kolorze szarym pokazuje wartość R Spearmana wynoszącą 0,88. Spośród 31 przeciwciał użytych w testach, 23 przeciwciała miały wartość R Spearmana wyższą lub równą 0,5. Mapa cieplna log 2 wybranych celów zawartych w teście transkryptomiki przestrzennej porównująca ręczny protokół pan-cytokeratyny CD 45 w kolorze czarnym z protokołem automatycznym 3-plex w kolorze szarym wykazała różnice w tych wartościach.

Dane sekwencjonowania dla protokołu automatycznej wizualizacji 3-plex wykazały niższe wartości w porównaniu z ręcznym protokołem wizualizacji pan-cytokeratyny CD 45, co znajduje również odzwierciedlenie w niskich wartościach R Spearmana wynoszących 0,15. Zaobserwowano również utratę zakresu dynamiki podczas korzystania z automatycznego protokołu wizualizacji 3-plex. Wykrywanie małych ROI w protokole transkryptomiki przestrzennej przeprowadzono poprzez wybór kolistych regionów zainteresowania o średnicy 50 mikrometrów i 300 mikrometrów dla wybranych celów na różnych liniach komórkowych, które były porównywalne między dwoma regionami o rozmiarach zainteresowania po normalizacji.

Ten protokół dla zautomatyzowanych paneli wizualizacyjnych może być dostosowywany przez badaczy poprzez wymianę znaczników w celu opracowania paneli, które precyzyjnie definiują zwrot z inwestycji, aby odpowiedzieć na ich pytania dotyczące proteomiki przestrzennej.