Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Ogólnym celem procedury, którą tutaj szczegółowo opisujemy, jest zbadanie zaangażowania rzęski pierwotnej podczas rozwoju kory nowej. Wykazano, że rzęski pierwotne mają kluczowe znaczenie dla wielu etapów rozwoju kory nowej, w tym ekspansji komórek progenitorowych, determinacji losu, a także migracji i dojrzewania neuronów. Aby dokładniej przeanalizować zaangażowanie komórek podczas rozwoju kory nowej, stworzyliśmy odpowiednie narzędzia, wykorzystując pojawiające się modele rozwoju kory nowej oparte na komórkach iPS 2D i 3D.

Innymi słowy, rozety nerwowe i grzbietowe przodomózgowie organoids. 3D modelach opartych na komórkach iPS zaczynają się od tworzenia ciała zarodkowego. Adhezja wspomnianych ciał embrionalnych pozwala na generowanie struktur rozetowych neuronów 2D, podczas gdy swobodna hodowla takich EB pozwala na wytwarzanie organoidów grzbietowej części przodomózgowia.

Protokół, który ustaliliśmy w celu generowania organoidów mózgowych, opiera się na wcześniej opublikowanych protokołach wykorzystujących metodę kneblowania poprzez dodanie czynników wstępnych w celu specyficznego generowania organoidów grzbietowej przodomózgowia za pomocą inhibitorów szlaku węzłowego aktywiny i BMP, znanego również jako podwójne hamowanie SMAD. Aby wykorzystać organizację organoidów w 3D, opracowaliśmy prostą i szybką metodę, pozwalającą na całkowite immunoznakowanie, oczyszczanie i świetliste pozyskiwanie całego organoidu w wysokiej rozdzielczości. Aby skupić się na pierwotnej biogenezie i funkcjach rzęsek, dostosowaliśmy immunohistochemię do swobodnie pływających odcinków przeciętych wibratomem.

Po barwieniu immunologicznym i oczyszczeniu skrawków uzyskaliśmy obrazy za pomocą rezonansowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Zacznij od hodowli komórek iPS zawierających duże regularne kolonie, wykazujące mniej niż 10% różnicowania i nie więcej niż 80% zgodne. Ręcznie wypreparuj każdą kolonię komórek iPS za pomocą igły, co pozwoli precyzyjnie złapać każdą kolonię w kierunku poziomym i pionowym, aby stworzyć wzór szachownicy, dzieląc każdą kolonię na równe skupiska.

Odłącz kolonię za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je na płytkę hodowlaną o bardzo niskim przyczepie. Pozwól im pływać przez noc w inkubatorze, aby mogły uformować ciała embrionalne. Następnego dnia obróć pożywkę, uważając, aby nie zaaspirować ciał zarodkowych, i przenieś je do naczyń pokrytych poli-L-ornityną Lamininą, aż do powstania rozet nerwowych.

Trwa to około 12 do 14 dni. Codzienna indukcja odświeżania, pożywka i kontrola pod mikroskopem pod kątem tworzenia struktur rozety nerwowej. Na tym etapie rozety nerwowe mogą być rozszerzane, różnicowane i przetwarzane w celu analizy immunologicznej lub oddzielone w celu uzyskania izolowanych kultur komórek macierzystych i progenitowych.

Przede wszystkim zacznij od kultur iPS, w których znajdują się duże regularne kolonie wykazujące mniej niż 10% zróżnicowania i które zostały pasażowane prawie raz na monowarstwie. W dniu zerowym pozwól komórce iPS na wytworzenie ciał zarodkowych w pożywce EB zawierającej niskie stężenie fJ2 i wysokie stężenie inhibitora ROCK wymagane do przeżycia komórek hiiPS, aby uniknąć zakłócania tworzenia EB na płytkach inkubatora przez trzy dni bez zmiany pożywki. Trzeciego dnia EB powinny mierzyć około 400 mikrometrów i wykazywać regularne granice.

Jeśli przeszły kryteria bogate dla większości EBs, zmień pożywkę na pożywkę indukcyjną, która zawiera podwójne inhibitory SMAD, z pewnością rozjaśniając przeciwstawne DB o najlepsze sześć do siedmiu, co wskazuje na ustępstwo tomalii neuronalnej. I przekształcają inne bazy danych w metryki membrany podstawnej o obniżonym współczynniku brutto. Na tym etapie zawsze używaj sterylnych nożyczek, aby uzyskać otwarcie peptydów, aby uniknąć uszkodzenia organoidów.

Najpierw przenieś około 15 organoidów do probówki klinicznej. Pozwól EB osiąść i usuń pożywkę w 50 mikrolitrach pożywki indukcyjnej dwa i przenieś organoidy do mikroczułej probówki zawierającej 100 mikrolitrów matrycy i homogenizowanej przez pipetowanie w górę iw dół. Rozprowadź mieszaninę na środku dołka neutralnej płytki mocującej.

I wreszcie, rozmieść EB tak, aby się nie stykały, aby uniknąć ich fuzji. Pozwól materii zestalić się w inkubatorze przez 45 minut, dodaj pożywkę indukcyjną po dwie do każdej studzienki i inkubuj w inkubatorze. Odświeżaj pożywkę indukcyjną dwa co drugi dzień.

W dniu 17 należy ręcznie odłączyć matrycę błony podstawnej, pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipet o pojemności pięciu ml. Inkubować płytkę organoidową w pożywce translacyjnej pod wpływem mieszania, aby poprawić wchłanianie składników odżywczych. Co ważne, należy użyć innego inkubatora do hodowli stacjonarnej i hodowli na wytrząsarce orbitalnej, aby uniknąć wibracji szkodliwych dla przylegającego wzrostu komórek iPS.

Po utrwaleniu, przepuszczalność, blokowanie i inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi trwa 10 dni, łącznie z etapami mycia. Preferowana przez nas metoda oczyszczania opiera się na TDE, pochodnej glikolu. Aby uzyskać optymalne oczyszczenie, należy intubować organoid w roztworze TDE o stopniowo zwiększanym stężeniu przez 24 godziny każdy.

Do osadzania organoidów należy użyć niestandardowego głównego systemu formowania wykonanego ze strzykawki o pojemności jednego ml, której końcówka jest odcinana za pomocą skalpela. Zalecana jest agaroza o niskiej temperaturze topnienia, ponieważ jej temperatura topnienia wynosi tylko około 60 stopni Celsjusza. Przygotuj 4% niskotopliwą agarozę w 60% roztworze TDE i pozwól jej ostygnąć tylko około 37 stopni Celsjusza w bazie wodnej do zatapiania w organoidach.

Umieścić w strzykawce 600 mikrolitrów roztworu żelu za pomocą tłoka, następnie umieścić próbkę i napełnić strzykawkę 400 mikrolitrami roztworu żelu. Pozwól żelowi spolimeryzować, a na koniec próbka zostanie idealnie zamontowana w żelu i może być łatwo wypchnięta w oświetlonej komorze, aby ustawić organoid przed obiektywem. Mikroskopia fluorescencyjna z oświetleniem jest idealna do pierwszego obrazowania takiego przezroczystego organoidu.

Ograniczyliśmy obrazowanie zdjęć i zważyliśmy rozdzielczość subkomórkową. W tym przypadku użyliśmy obiektywu o powiększeniu 20x zanurzonego w roztworze 80% TDE dodanym do komory próbki, aby umożliwić dokładne dostosowanie do współczynnika załamania światła naszej metody oczyszczania. Największa kolejność próbek została zaprojektowana tak, aby pomieścić jednomililitrową strzykawkę, którą można włożyć od góry za pomocą tłoka, który można obsługiwać po zamontowaniu kolejności próbek w celu umieszczenia organoidu przed obiektywem.

Pozyskanie całego organoidu trwa około 5 do 10 minut. W przypadku barwienia immunologicznego na swobodnie pływających odcinkach, zbierz i utrwal organoidy w czteroosobowej części przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Osadź organoidy w 4% niskotopliwej agarozie i pokrój za pomocą wibratomu, aby uzyskać 150 mikrometrów sześciu skrawków przeniesionych w roztworze PBS, używając pędzla, aby uniknąć ich uszkodzenia.

Po przepuszczalności i zablokowaniu inkubować swobodnie pływające sekcje z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pod mieszaniem. Przed inkubacją należy dokładnie umyć skrawki przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej i pod mieszaniem. Na koniec, aby uzyskać optymalne oczyszczenie, inkubuj sekcję w roztworze TDE o stopniowo zwiększanym stężeniu przez jedną godzinę i 30 w 60% TDE, a następnie w 80% TDE przez noc w temperaturze pokojowej.

Przechowuj sekcję w 80% roztworze TDE i TLAC w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zamontuj sekcję swobodnie pływającą w komorze celi, starając się utrzymać próbkę w 80% roztworze TDE i zaprojektowaną tak, aby dostosowywała się do zmotoryzowanego stolika mikroskopów klinicznych. Najpierw umieść w komorze jedno okrągłe szkiełko nakrywkowe i ostrożnie przenieś przezroczystą ochronę za pomocą pędzla.

Napełnij komorę 80% roztworem TDE, a następnie dodaj dwa standardowe szkiełka nakrywkowe oraz jedno drugie okrągłe szkiełko nakrywkowe i uszczelkę silikonową. Na koniec przykręć pierścień śrubowy komory, aby idealnie uszczelnić system. Nightsheet, jak również akwizycje rezonansowe są przetwarzane dzięki oprogramowaniu umożliwiającemu wykorzystanie 3D i analizę całej próbki immunostainu.

Takie oprogramowanie pozwala na szybkie otwieranie ogromnych danych, które generujemy, aby w łatwy sposób tworzyć migawki i animacje. Pozwoliło to na przesuwanie próbki w różnych orientacjach i możemy generować widoki 2D obrazu dzięki narzędziu do slicera 2D w różnych orientacjach, na przykład X, Y i Y, Zed. Ponadto takie oprogramowanie umożliwia automatyczne wykrywanie zarówno rzęsek centrosomowych, jak i pierwotnych, umożliwiając ilościowe określenie ich liczby w warunkach patologicznych i kontrolnych.

Umożliwia również odtworzenie 3D rzęsek pierwotnych w celu precyzyjnego pomiaru miejsc. Opisany przez nas protokół modelowania nowego rozwoju kory mózgowej w oparciu o komórki 2D iPS pozwala na generowanie struktur rozety nerwowej, które zawierają nowe przodki kory mózgowej i neurony podobne do tych obserwowanych w rozwijającej się korze nowej. Szczegółową walidację można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnej analizy barwienia immunologicznego.

Odpowiednie progenitory powinny być u nas podwójnie barwione, aby wpłynąć na wrażliwość, podczas gdy pośrednie progenitory są ujawniane przez barwienie TBI2, a wczesne neurony neokorowe kości przez barwienie CTIP2 dodatnie. Takie neuronalne struktury przypominające rozetę modelują interkinetyczną migrację jądrową radykalnych progenitorów, które można uwidocznić za pomocą barwienia immunologicznego przeciwciałami podniesionymi przeciwko fosfo wimentynie, która barwi jądra mototyczne i TBX2, która podtrzymuje wrzeciono mitotyczne. Wreszcie, rzęskowość można analizować przez barwienie immunologiczne przeciwciałami podniesionymi przeciwko pericentryce, które barwią tylne ciało rzęsek pierwotnych i mają pewne środki, które barwią aksjomat.

Na takiej strukturze rozety rzęski pierwotne wyodrębnione z wierzchołkowych progenitorów poli Fabri-Kal i gęsto powyżej centralnego światła każdego obszaru komorowego, podczas gdy wystają one również z neuronów CTIP2-dodatnich. Dysocjacja rozet adenoneuralnych pozwala na wygenerowanie izolowanych kultur nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych, które są bardzo przydatne do analizy biogenezy i funkcji pierwotnej rzęski. W szczególności szczegółowo opisujemy procedurę badania indukcji sonicznego szlaku leku po leczeniu zalecanym lekiem sonicznym lub agonistami osmozyny.

Kolejne testy RTPCR SA polegają na indukcji genów docelowych leków sonicznych, takich jak GLI1 i PTCH1, a analiza immunofluorescencyjna testuje dynamikę kluczowych składników leku sonicznego wzdłuż rzęski pierwotnej, które można określić ilościowo dzięki narzędziom open source, ilastik i CiliaQ. Badane są różne parametry rzęsek, w tym długość i orientacja, ale także pokazano intensywność pierwotnych składników rzęsek dla GLI2 i GPR161, które odpowiednio akumulacjują lub wychodzą z rzęski pierwotnej w odpowiedzi na zalecane leczenie farmakologiczne. Protokół, który szczegółowo opisujemy dla naszego modelowania rozwoju kory nowej opartego na komórkach 3D iPS, pozwala na generowanie jednorodnego organoidu mózgowego z tożsamością grzbietowej części przodomózgowia, którą można scharakteryzować albo za pomocą konwencjonalnej analizy barwienia immunologicznego, albo przez barwienie kobiety, jak pokazano tutaj, z optymalną penetracją przeciwciał podniesionych, ponownie, N-kadheryny, PAX6 i CTIP2, które barwią odpowiednio kadherynę neuronalną, na różowo, wierzchołkowe progenitory w obszarze podobnym do komory, na zielono i wszystkie nowonarodzone neurony kory mózgowej, zlokalizowane w obszarze przypominającym płytkę korową.

Oto drugi film przedstawiający cały organoid immunostainowy z ponownie podniesionymi przeciwciałami, CTIP2, w kolorze czerwonym, prawdopodobnie utrzymującym się na różowo, i TPX2, na zielono, co pozwala przetestować kilka cech progenitorów kory nowej, takich jak interkinetyczna migracja jądrowa przodków Fabri-Kal. Co ciekawe, progenitorzy fosfo-wimentyny są również obserwowani w obszarze przypominającym strefę nadkomorową i zawierają unikalny pozytywny proces rozciągający się na powierzchnię dodatnią, przypominający zewnętrznych promienistych progenitorów glejowych i ilustrujący wysoką rozdzielczość tej metody. Oto film przedstawiający swobodnie unoszący się wycinek immunologiczny, uzyskany za pomocą mikroskopu rezonansowo-skaningowego, pokazujący pierwotne rzęski wykryte za pomocą przeciwciała perycentrycznego, które jest zabarwione z tyłu ciała, na zielono, oraz przeciwciała ARLT3B, które zabarwiają aksjomat, na różowo.

Rzęski pierwotne rozciągają się ze wszystkich neuronalnych komórek macierzystych i progenitorowych, w szczególności na epickiej powierzchni komórek progenitorowych epikalnych, ale także w neuronach kory nowej w obszarze przedpłytkowym. Wreszcie, rozety neuronów 2D oraz izolowane komórki macierzyste i progenitorowe podsumowują kilka aspektów rozwoju kory mózgowej i stanowią komplementarne, użyteczne narzędzia do badania biogenezy i funkcji rzęsek. Protokół, który tutaj wykryliśmy, pozwolił nam z powodzeniem wygenerować organoidy grzbietowe przodomózgowia z tych odrębnych linii komórkowych iPS, które dają jednorodne wyniki, zapewniając solidność tej procedury.

Protokoły, które opracowujemy do barwienia immunologicznego, usuwania i obrazowania całych organoidów lub swobodnie pływających sekcji, są proste, szybkie i opłacalne. Połączenie takich modeli komórkowych i analizy obrazowania 3D na komórkach iPS, generowanych albo przez przeprogramowanie komórek perturbacyjnych rzęsek, albo przez wykorzystanie technologii CRISPR 9 do specyficznej edycji genów rzęskowych, powinno umożliwić znaczny postęp w zrozumieniu udziału rzęski pierwotnej w prawidłowym i patologicznym rozwoju kory mózgowej.