Name: Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę izolacji wrodzonych komórek limfatycznych macicy myszy do analizy cytometrią przepływową. Protokół zachowuje żywotność komórek i ekspresję białek powierzchniowych, umożliwiając fenotypowanie podpopulacji limfocytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy poprzednim i obecnym członkom zespołu, którzy pomogli rozwinąć tę metodę, w tym Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic i Anita Qualls. Badania te zostały sfinansowane przez Wellcome Trust [numer grantu 200841/Z/16/Z ] oraz Radę ds. Badań Medycznych (MR/P001092/1). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane w tym artykule zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) z 1986 roku na mocy PP2363781 wydanym przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych. Poniższy protokół składa się z kilku sekcji, zaczynając od hodowli myszy, a kończąc na barwieniu do analizy FACS. Rysunek 3 przedstawia główne kroki protokołu. Materiały użyte w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Ogólna hodowla, kojarzenie i sekcja myszy
<ol>
	<li>Trzymaj 7-14 tygodniowe samice myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i w grupach (zwykle 4-6 samic w zależności od wielkości klatki i wagi zwierzęcia) przez 10-14 dni, aby wywołać efekt Lee-Boot, który powoduje synchronizację rui17.</li>
	<li>Trzymaj reproduktorów w warunkach SPF, w jednym pomieszczeniu i odpoczywaj przez co najmniej 48 godzin między każdym kryciem (czas na regenerację plemników). Zaleca się korzystanie z doświadczonych, sprawdzonych 3-4 miesięcznych samców, ponieważ są one zazwyczaj bardziej wydajne niż młode.</li>
	<li>Aby zwiększyć prawdopodobieństwo zajścia w ciążę samic, należy wprowadzić zabrudzoną ściółkę z klatki samca do klatki samicy na 3 dni przed kryciem. Powoduje to efekt Whittena18 poprzez ekspozycję na męskie feromony moczu i skutkuje zsynchronizowaną rują, a także zwiększoną podatnością na krycie.</li>
	<li>W dniu 0 (D0) przygotuj myszy do krycia, używając jednego samca reproduktora na dwie samice; rozważ wskaźnik zatyczek około 20%-25%. 
	UWAGA: Gody prawdopodobnie nastąpią w nocy, ponieważ myszy są zwierzętami nocnymi.</li>
	<li>Rano po kryciu (D0,5) sprawdź, czy nie ma czopa dopochwowego, który jest wskaźnikiem kopulacji (<silna klasa="xfig">Ryc. 4). Czop dopochwowy jest agregatem męskiego ejakulatu i zwykle utrzymuje się do 8-24 godzin po kryciu. Sprawdź wtyczki wcześnie rano.</li>
	<li>Skonsoliduj zatkane samice w nowej klatce i przeznacz je na ten cel. Wróć samce do ich klatek na odpoczynek.</li>
	<li>W temperaturze D9,5 lub 10,5 po kryciu przygotować probówki o pojemności 5 ml z 1 ml sterylnego HBSS 1x (z Mg2+ i Ca2+) do pobrania tkanek i umieścić je na lodzie.</li>
	<li>Przejdź do eutanazji zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie wykrwawienie w celu potwierdzenia śmierci.</li>
	<li>Pracuj w sterylnym środowisku, jeśli wymaga tego dalsza aplikacja. Bezpośrednio po eutanazji przetrzyj ciało myszy 70% etanolem i przystąp do sekcji pod szafką ze strumieniem laminarnym za pomocą sterylnych narzędzi.</li>
	<li>Wypreparuj macicę w ciąży bez tłuszczu mesometrialnego (<silna klasa="xfig">Ryc. 5) i umieść całą macicę w przygotowanej i odpowiednio oznakowanej probówce o pojemności 5 ml. Trzymaj probówki na lodzie.</li>
</ol>
2. Mechaniczne i enzymatyczne trawienie macicy
<ol>
	<li>Aby przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego, należy zmieszać 3 ml na macicę sterylnego HBSS 1x z 30 μg/ml DNAzy i 0,1 jednostki Wünscha (WU)/ml Liberazy DH lub 0,52 WU/ml Liberazy TM. Umieścić roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Można stosować zarówno Liberase TM, jak i Liberase DH. Przy wyborze jednego z nich należy kierować się ich potencjalnym wpływem na epitopy rozpoznawane przez przeciwciała używane do późniejszej analizy cytometrii przepływowej. 
	UWAGA: Jeśli używasz liofilizowanych enzymów, pracuj pod maską.</li>
	<li>Przygotować 20 ml 5 mM EDTA w PBS (bez Ca2+/Mg2+). Umieścić połowę roztworu w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, a drugą połowę na lodzie.</li>
	<li>Pod szafką z topnikiem laminarnym delikatnie usuń tłuszcz otaczający ciężarną macicę za pomocą sterylnych narzędzi na sterylnej szalce Petriego. Nie dopuścić do wyschnięcia chusteczki.</li>
	<li>Wypreparuj każde miejsce implantacji sterylnymi narzędziami, aby usunąć płód (półprzezroczysta struktura w kształcie konika morskiego, około 1 mm długości) (<silna klasa="xfig">Ryc. 6A). Wyrzuć płody.</li>
	<li>Umieść macicę z powrotem w pierwotnej probówce o pojemności 5 ml i zmiel tkankę za pomocą nożyczek bezpośrednio w probówce o pojemności 5 ml i pożywce do pobrania. Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas między zabiegami.</li>
	<li>Umieścić probówki o pojemności 5 ml zawierające tkankę mieloną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 3 ml ciepłej mieszanki do trawienia enzymatycznego do każdej próbki, tak aby całkowita objętość płynu w probówce wynosiła 4 ml (1 ml pożywki zbiorczej z mieloną macicą i 3 ml roztworu do trawienia enzymatycznego). Inkubować probówki o pojemności 5 ml przez 30 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem w celu zwiększenia aktywności trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Zwiruj probówki o pojemności 5 ml i umieść je na lodzie, aby zahamować działanie enzymów. Następnie, następnie, przenieś zawartość do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przepłucz wszystko z probówek o pojemności 5 ml do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml za pomocą 10 ml lodowatego roztworu 5 ml EDTA PBS.</li>
	<li>Odwirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml zawierające strawione tkanki przez 10 minut przy 400 x g.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, delikatnie strzepnąć osad, a następnie ponownie zawiesić go w 10 ml ciepłego (37 °C) roztworu 5 mM EDTA PBS.</li>
	<li>Próbki inkubować w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 15 minut w celu usunięcia resztek pożywki wytrawiającej i zmniejszenia zlepiania się komórek.</li>
	<li>Wiruj próbki na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby jeszcze bardziej ułatwić dysocjację tkanek.</li>
</ol>
3. Przetwarzanie macicy na zawiesinę jednokomórkową
<ol>
	<li>Za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml przepchnąć strawioną tkankę przez sitko o pojemności 70 μm na odpowiednio oznakowaną i sterylną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml w celu usunięcia grudek komórek i niezdysocjowanej tkanki.</li>
	<li>Umyj sitko kilka razy łącznie 10 ml zimnego PBS, aby zebrać wszystkie komórki.</li>
	<li>Wirować probówkę wirówkową o pojemności 50 ml przez 10 minut w temperaturze 400 x g. 
	UWAGA: Wykonaj dalsze kroki, korzystając z opcji A lub opcji B. Opcja A pozwala na lepsze wzbogacenie limfocytów w mniej zanieczyszczeń i zanieczyszczeń komórek zrębu niż opcja B. Jednak opcja B daje wyższą wydajność komórek odpornościowych ze względu na mniejszą utratę komórek i mniejszą zmienność wydajności komórek między próbkami. Opcja B jest również łatwiejsza do wykonania pod względem technicznym. Dlatego, w zależności od preferencji, przejdź do opcji A lub opcji B.
	<ol>
		<li>Kroki dla opcji A są następujące.
		<ol>
			<li>Oznaczyć jedną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml na próbkę zawierającą 5 ml 80% (v/v) izotonicznego perkolu rozcieńczonego w PBS.</li>
			<li>Po odwirowaniu wyrzucić supernatant z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj pipety chłopca, aby ponownie zawiesić każdą granulkę w 8 ml 40% (v/v) izotonicznego Percollu w PBS.</li>
			<li>Użyj pipety chłopca na niskiej prędkości, aby ostrożnie nałożyć osad zawieszony w 40% roztworze Percollu na 80% roztwór Percollu. Pipetować powoli i w sposób ciągły; trzymaj probówkę o pojemności 15 ml pod kątem 45° (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
			<li>Nie naruszając nakładki, odwirować probówki wirówkowe o pojemności 15 ml przez 20 minut przy 850 x g, w temperaturze pokojowej (średnie przyspieszenie i minimalna przerwa).</li>
			<li>Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki, nie naruszając warstw Percoll (<silna klasa="xfig">Rysunek 6C).</li>
			<li>Nie naruszając pierścienia leukocytów na granicy dwóch roztworów Percollu, użyj sterylnej pipety Pasteura, aby wyrzucić wszystko, z wyjątkiem około 0,5-1 ml górnej warstwy Percolla.</li>
			<li>Próbując zassać minimalną ilość roztworu Percollu (łącznie do 4-5 ml), ostrożnie zbierz pierścień leukocytów i przenieś komórki do nowej, oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Uzupełnij każdą próbkę 10 ml sterylnego podłoża RMPI-1640 uzupełnionego 10% inaktywowanego termicznie FBS.</li>
			<li>Wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Odrzucić supernatant i przystąpić do lizy RBC.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kroki dla opcji B są następujące.
		<ol>
			<li>Oznaczyć jedną sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 ml na próbkę.</li>
			<li>Po odwirowaniu wyrzucić supernatant z probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj pipety chłopca, aby ponownie zawiesić każdą granulkę z 8 ml 35% (v/v) izotonicznego Percollu w pożywce RPMI-1640.</li>
			<li>Przenieść próbki do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
			<li>Odwirować próbki o masie 940 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej ze średnim przyspieszeniem i minimalną przerwaniem.</li>
			<li>Ostrożnie odessać supernatant za pomocą aspiratora lub pipety (nie przez odwrócenie probówki).</li>
			<li>Zawiesić osad w 14 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, a następnie odwirować próbkę przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Odrzucić supernatant przez aspirację i przystąpić do lizy RBC.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4.Liza RBC
<ol>
	<li>Aby zlizować erytrocyty, ponownie zawiesić próbki w 3 ml 1x roztworu do lizy RBC i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 10 ml PBS do próbek, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 10 ml PBS i powtórzyć krok 4.3.</li>
	<li>Ponownie zawiesić każdą pastylkę w 1 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% inaktywowanego termicznie FBS.</li>
	<li>Przepuścić próbki przez sterylne sitka do komórek o wielkości 70 μm.</li>
	<li>Zliczanie komórek należy przeprowadzić za pomocą błękitu trypanowego i komory Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 1-2 milionów komórek w 100 μl PBS lub pożywki.</li>
</ol>
5. Strategia projektowania paneli i kontrole
UWAGA: Panel opisany w tym artykule nadaje się do dyskryminacji komórek uILC1, trNK i cNK i został zaprojektowany do użycia na 5-laserowym BD LSRFortessa. Można wprowadzić drobne modyfikacje w celu zbadania różnych populacji komórek i użycia alternatywnych fluorochromów. Zaleca się sprawdzenie konfiguracji urządzenia, użycie miareczkowanych przeciwciał w celu optymalnej separacji, zapoznanie się ze wskaźnikiem jasności producenta i użycie najjaśniejszych barwników dla antygenów o niskiej ekspresji, takich jak NKp46, oraz przestrzeganie ogólnych wytycznych19. Zaleca się włączenie kontroli Fluorescence Minus One (FMO) dla NKp46.
6. Barwienie wrodzonych komórek limfoidalnych do fenotypowania FACS
<ol>
	<li>Przenieś 1-2 miliony komórek na studzienkę do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.</li>
	<li>Obracać płytkę w temperaturze 400 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant, wrzucając go do zlewu.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórkowe w 100 μl PBS (bez białek i azydków) za pomocą pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Upewnij się, że PBS nie zawiera azydku sodu, Trisu ani żadnych białek do następnego etapu.</li>
	<li>Powtórz krok 6.2.</li>
	<li>Zawieś komórki w 50 μl możliwego do utrwalenia barwnika żywotności rozcieńczonego w PBS (bez białek i azydków) (1:1,000). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: Upewnij się, że PBS nie zawiera azydku sodu, Tris ani żadnych białek, takich jak FBS lub BSA, ponieważ może to spowodować zmniejszenie intensywności barwienia martwych komórek i/lub zwiększenie barwienia tła żywych komórek. 
	UWAGA: Jeśli barwnik żywotności jest sproszkowany, użyj pod maską.</li>
	<li>Dodać 150 μl PBS, ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety wielokanałowej, a następnie powtórzyć krok 6.2.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 25 μl buforu FACS (PBS uzupełniony 1% BSA lub 2% FBS) zawierającego odczynnik blokujący receptor Fc. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 25 μl powierzchniowego koktajlu przeciwciał. 
	UWAGA: Zawsze miareczkuj przeciwciała i optymalizuj panel przeciwciał przed eksperymentem.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.</li>
	<li>Dodać 150 μl buforu FACS do każdej studzienki, dokładnie wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.</li>
	<li>Powtórz krok 6.10. 
	UWAGA: Wykonaj dalsze kroki, korzystając z opcji A lub opcji B. Użyj opcji A, aby zabarwić komórki znacznikami powierzchni. Użyj opcji B, aby zbadać markery wewnątrzkomórkowe za pomocą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Kroki dla opcji A są następujące.
		<ol>
			<li>Zawiesić próbki w 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) na studzienkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Użyj PFA pod maską. Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby bezpiecznie pozbyć się odpadów/przedmiotów PFA, które miały kontakt z PFA (np. pipet).</li>
			<li>Powtórz krok 6.2 dwa razy. 
			UWAGA: Nie wyrzucaj, wrzucając do zlewu tutaj, ponieważ zawiera PFA. Odessać pipetą i wyrzucić odpady zgodnie z kartą bezpieczeństwa.</li>
			<li>Zawiesić próbki w 200 μl PBS.</li>
			<li>Przenieść próbki do oznakowanych probówek FACS i uzupełnić 100 μl PBS. Trzymaj probówki na lodzie lub w lodówce do czasu przetworzenia za pomocą analizy FACS. Pobrać próbki na cytometr przepływowy w ciągu 24 godzin.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kroki dla opcji B są następujące.
		<ol>
			<li>Zawiesić próbki w 100 μl roztworu utrwalającego/permeabilacyjnego na studzienkę (zawierającego paraformaldehyd) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. 
			UWAGA: Użyj PFA pod maską. Zapoznaj się z kartą charakterystyki, aby bezpiecznie pozbyć się odpadów/przedmiotów PFA, które miały kontakt z PFA (np. pipet).</li>
			<li>Powtórz krok 6.2. 
			UWAGA: Nie wyrzucaj, wrzucając do zlewu tutaj, ponieważ zawiera PFA. Odessać pipetą i wyrzucić odpady zgodnie z kartą bezpieczeństwa.</li>
			<li>Dodać 200 μl 1x buforu do permeabilizacji / mycia, dobrze wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.</li>
			<li>Powtórz krok 6.11.2.3.</li>
			<li>Ponownie zawiesić utrwalone i permeabilizowane komórki w 50 μl 1x buforu permeabilizacyjnego/myjącego zawierającego mieszaninę przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego.</li>
			<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności.</li>
			<li>Dodać 200 μl 1x roztworu do permeabilizacji / mycia, dobrze wymieszać, a następnie powtórzyć krok 6.2.</li>
			<li>Powtórz krok 6.11.2.7.</li>
			<li>Zawiesić próbki w 200 μl PBS.</li>
			<li>Przenieść próbki do oznakowanych probówek FACS i uzupełnić 100 μl PBS. Trzymaj probówki na lodzie lub w lodówce do czasu przetworzenia za pomocą analizy FACS. Pobrać próbki na cytometr przepływowy w ciągu 24 godzin 
			UWAGA: Po wykonaniu tego protokołu zawiesina komórek dziesiętnych jest gotowa do analizy FACS. Zaleca się rejestrowanie jak największej liczby zdarzeń na próbkę; Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy uzyskać co najmniej 1000-3000 zdarzeń w populacji rodzicielskiej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+code+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological code of pregnancy.</a> Science. 365 (6456), New York, N.Y. 862-863 (2019).</li>
<li>Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+immunological+and+microbial+aspects+of+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The unique immunological and microbial aspects of pregnancy.</a> Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).</li>
<li>Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCroy%2C+A+%22The+Guide+to+Investigation+of+Mouse+Pregnancy%22">The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy</a>. , Elsevier, Academic Press. (2014).</li>
<li>Filipovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definition+of+group+1+innate+lymphoid+cells+in+the+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus.</a> Nature Communications. 9 (1), 4492(2018).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DBA-lectin+reactivity+defines+mouse+uterine+natural+killer+cell+subsets+with+biased+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression.</a> Biology of Reproduction. 87 (4), 81(2012).</li>
<li>Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells%3A+active+regulators+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).</li>
<li>Gaynor, L. M., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+Functional+distinctions+and+influence+on+pregnancy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice.</a> Frontiers in Immunology. 8, 467(2017).</li>
<li>Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells.</a> Frontiers in immunology. 10, 960(2019).</li>
<li>Wilkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+NK+cells+regulate+endometrial+bleeding+in+women+and+are+suppressed+by+the+progesterone+receptor+modulator+asoprisnil%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil.</a> The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).</li>
<li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+%CE%B3+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification%2C+decidual+integrity%2C+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li>
<li>Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+direct+hemochorial+placentation+by+regulating+hypoxia-inducible+factor+dependent+trophoblast+lineage+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).</li>
<li>Crespo, ÂC., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+transfer+granulysin+to+selectively+kill+bacteria+in+trophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts.</a> Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).</li>
<li>Shmeleva, E. V., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+natural+killer+cells+at+the+intersection+between+reproduction+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity.</a> Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).</li>
<li>Kather, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neither+lymphotoxin+alpha+nor+lymphotoxin+beta+receptor+expression+is+required+for+biogenesis+of+lymphoid+aggregates+or+differentiation+of+natural+killer+cells+in+the+pregnant+mouse+uterus%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus.</a> Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).</li>
<li>Croy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).</li>
<li>Vander lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+et+Pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta Physiologica et Pharmacologica Neerlandica. 5 (2), 213-215 (1956).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Licensing+of+natural+killer+cells+by+host+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules.</a> Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4, Appendix 4I (2009).</li>
<li>Doisne, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition%2C+development%2C+and+function+of+uterine+innate+lymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells.</a> Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).</li>
<li>Peel, S. Fate of GMG Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeel%2C+S+%22Granulated+Metrial+Gland+Cells+Advances+in+Anatomy%2C+Embryology+and+Cell+Biology%22">Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology</a>. 115, Springer. Berlin. (1989).</li>
<li>Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+natural+killer+cells%3A+a+specialized+differentiation+regulated+by+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones.</a> Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).</li>
<li>Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+receptor+repertoire+in+mouse+uterine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells.</a> Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Metoda składa się z kilku krytycznych kroków omówionych poniżej. Pierwszym krytycznym krokiem jest uzyskanie ciąż synchronicznych mnogich, ponieważ względna częstość występowania populacji leukocytów zmienia się w czasie ciąży. Posiadanie wielu matek w tym samym dniu ciąży pozwala na powtórzenia biologiczne w tych samych eksperymentach lub łączenie limfocytów z poszczególnych matek w celu uzyskania większej liczby wymaganej do dalszych zastosowań. Krycie czasowe pozwala badaczowi określić poczęcie w ciągu 24 godzin. Chociaż myszy żyją około 2,5 roku, będą w wieku rozrodczym od 4-7 tygodni do 6-8 miesięcy. Ponieważ młodsze myszy zwykle produkują mniejsze młode, samice myszy na ogół nie są kojarzone, dopóki nie osiągną wieku 6-8 tygodni, a samce myszy do 8-10 tygodnia. Biorąc pod uwagę, że ruja trwa około 15 godzin u myszy i występuje co 4-5 dni, typowy wskaźnik krycia (ujawniony przez czop dopochwowy, patrz ryc. 4) wynosi około 25%. Dlatego ważne jest, aby wykorzystać myszy w rui i zaplanować wystarczającą liczbę, aby uzyskać wymaganą liczbę matek dla danego eksperymentu. Fazę cyklu rui można określić za pomocą cytologii wymazu z pochwy22. Szybkość korków można poprawić, odpoczywając samce na 48 godzin przed kryciem i wykorzystując efekt Whittena18. Alternatywnie można podać surowicę klaczy w ciąży, która naśladuje działanie endogennego hormonu folikulotropowego, indukującego dojrzewanie oocytów, a 42-50 godzin później ludzką gonadotropinę kosmówkową, która naśladuje działanie endogennego hormonu luteinizującego, wywołując owulację. To leczenie hormonalne omija wymóg rui i sprawia, że praktycznie wszystkie leczone samice są otwarte.
Drugim krytycznym krokiem jest zapewnienie jakości barwienia FACS. Przeciwciała stosowane w cytometrii przepływowej muszą być zawsze miareczkowane i stosowane w optymalnym stężeniu, a także konieczne jest sprawdzenie, czy trawienie enzymatyczne nie rozszczepia kluczowych epitopów antygenowych. Aby ocenić, czy enzym rozszczepi epitop, można równolegle wybarwić dwie frakcje tej samej próbki, z których jedna jest poddawana trawieniu enzymatycznemu, a druga mechanicznemu. Podobnie, zastosowanie odpowiednich kontroli i pojedynczych plam ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych. W rzadkich przypadkach koraliki mogą być używane do generowania pojedynczych próbek plam. Zaleca się, aby nie używać koralików do ustawiania napięć, ale raczej populacji komórek zawierających limfocyty i inne leukocyty, takie jak splenocyty. Jeśli używane są kulki, konieczne jest miareczkowanie przeciwciał do barwienia kulek, dzięki czemu intensywność fluorescencji barwionych kulek będzie porównywalna z intensywnością fluorescencji komórek. W przypadku trudności z oddzieleniem komórek dodatnich od ujemnych dla określonego markera, można również zastosować kontrolę FMO w celu ułatwienia bramkowania dla określonego markera. W przypadku markerów wewnątrzkomórkowych należy zastosować kontrolę izotypu, ponieważ barwienie wewnątrzkomórkowe może skutkować pozostałościami niezwiązanych przeciwciał, które mogą być nadal obecne w komórkach po etapach mycia, a tym samym zwiększać sygnał tła. Zaleca się przeprowadzenie próbek w ciągu 24 godzin od utrwalenia komórek, aby uzyskać najlepsze wyniki fenotypowania za pomocą analizy FACS, ponieważ autofluorescencja znacznie wzrasta w czasie, a intensywność fluorescencji niektórych przeciwciał może z czasem spadać.
Innym kluczowym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest dalsze zastosowanie zawiesiny jednokomórkowej uzyskanej za pomocą protokołu. W przypadku testów funkcjonalnych niezbędna jest praca w sterylnych warunkach. Podobnie w przypadku kolejnych badań omicznych ważne jest, aby pracować w sterylnych i wolnych od RNaz, DNaz i proteaz.
Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na fenotypowaniu ILC grupy 1, ale może być dostosowany do fenotypowania innych typów komórek poprzez modyfikację panelu przeciwciał. Zaleca się, aby wszystkie przeciwciała były testowane w stosunku do strawionej i niestrawionej zawiesiny komórkowej w celu wykrycia utraty/zmiany epitopów powierzchniowych w wyniku leczenia enzymatycznego. Podobnie, różne enzymy mogą być używane do trawienia tkanki i zwiększania wydajności komórek, ale ich wpływ na kluczowe epitopy antygenowe musi być dokładnie zbadany. Podczas gdy NKp46 jest dobrym markerem komórek NK śledziony i działa we wszystkich szczepach myszy laboratoryjnych, ekspresja NKp46 na komórkach uNK u myszy C57BL / 6 jest znacznie niższa niż na komórkach NK śledziony. Najlepiej jest bejcować jednocześnie zarówno dla NK1.1, jak i NKp46. W przypadku bezpośredniego porównania wielu narządów zaleca się traktowanie wszystkich próbek jednakowo, nawet jeśli trawienie enzymatyczne nie jest wymagane w przypadku tkanek takich jak śledziona lub szpik kostny. Chociaż przedstawiona tutaj metoda ma zastosowanie do macicy niebędącej w ciąży, izolacja pierścienia limfocytów za pomocą dwufazowego gradientu Percoll będzie wyzwaniem, a wydajność izolowanych komórek może być zbyt niska dla wiarygodnej analizy FACS, a zatem będzie wymagała łączenia komórek wyizolowanych z macicy pojedynczych, nieciężarnych myszy23.
Istnieją ograniczenia dotyczące protokołu, które należy wziąć pod uwagę przy interpretacji danych. Podobnie jak w przypadku wszystkich tkanek, krążące limfocyty pochodzące z krwi zostaną wyizolowane wraz z komórkami rezydującymi w tkance. Jeśli wykluczenie krążących limfocytów ma zasadnicze znaczenie dla interpretacji danych, można przeprowadzić barwienie przyżyciowe w celu oznakowania krążących komórek. Co więcej, drugim ograniczeniem protokołu jest to, że niektóre komórki zostaną utracone, ponieważ nie wszystkie komórki można wyekstrahować z tkanki. Najczęstsze problemy i ich rozwiązywanie przedstawiono w tabeli 2.
Historycznie rzecz biorąc, badanie komórek w tkankach opierało się na badaniu histologicznym skrawków tkanek. Znakomita recenzja Sandry Peel24 podsumowuje pracę wykonaną przez ponad 100 lat, aż do późnych lat 80. Opisy komórek, znanych później jako komórki uNK, rzeczywiście pojawiają się w rękopisach opublikowanych ponad pół wieku przed odkryciem limfocytów. Tak więc, przed odkryciem komórek NK w 1975 roku, a komórki uNK zostały wskazane jako matczyne komórki glikogenu lub ziarniste komórki gruczołu oddechowego. Anne Croy wniosła znaczący wkład w tę dziedzinę25 i uprzejmie nauczyła zespół sekcji, którą zoptymalizowała3 i która jest obecnie używana. Chociaż ma zasadnicze znaczenie w opisie morfologii i lokalizacji tkanek komórek uNK, klasyczne badanie histologiczne ogranicza się do wykrycia tylko kilku markerów na interesujących komórkach. W 2008 roku opisano metodę opartą na cytometrii przepływowej do jednoczesnego wykrywania wielu markerów na limfocytach macicy26. Jest to zasadniczo metoda, która została opisana w tym artykule. Nowsze technologie, takie jak transkryptomika przestrzenna i obrazowanie za pomocą cytometrii masowej, łączą w sobie moc histologii i cytometrii przepływowej, umożliwiając zarówno jednoczesne wykrywanie wielu genów lub białek, jak i zachowanie prawidłowej architektury tkanki.
Zastosowania opisanej tutaj metody są wielorakie i obejmują fenotypowanie FACS, test funkcjonalny (taki jak ELISPOT, degranulacja lub testy cytotoksyczne), sortowanie komórek oraz późniejszą transkryptomikę lub proteomikę. Dalsze zastosowania, które można by rozwinąć w oparciu o tę metodę, obejmują hodowlę i ekspansję dziesiętnych komórek NK po sortowaniu komórek lub wzbogacaniu przez ujemne zubożenie. Obecnie nie ma protokołu hodowli i namnażania mysich komórek uNK oraz zachowania ich żywotności i funkcjonalności przez dłuższy czas, w podobny sposób jak w przypadku ludzkich komórek NK, które mogą być hodowane i ekspandowane przez 7-14 dni przez dodanie IL-2 lub kombinacji IL-12 i IL-15. Optymalizacja takiej metody dla mysich komórek uNK zapewniłaby większą elastyczność podczas wykonywania testów funkcjonalnych i pozwoliłaby na testowanie wielu warunków z większą liczbą komórek. Z drugiej strony, wiadomo, że warunki hodowli modyfikują unikalny fenotyp limfocytów, a potencjalnie także ich funkcję.

Opisana tutaj jest prosta metoda uzyskania wysokiej wydajności limfocytów wrodzonych macicy z poszczególnych macic ciężarnych. Metoda ta zachowuje ekspresję powierzchni białka i funkcjonalność wrodzonych limfocytów macicy i nadaje się do kolejnych zastosowań, takich jak fenotypowanie FACS, RNAseq, proteomika lub testy funkcjonalne. W tym miejscu nacisk kładziony jest na fenotypowanie uILC grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.
Macica składa się z trzech warstw: endometrium, myometrium i perimetrium (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Endometrium to błona śluzowa wyściełająca światło macicy. Progesteron, wytwarzany przez ciałko żółte, przekształca błonę śluzową macicy w decidua. Mięśniówka macicy składa się z dwóch warstw mięśni gładkich, które tworzą ścianę macicy. Perimetrium to błona surowicza, która owija macicę i łączy ją z otrzewną za pomocą szerokiego więzadła zwanego mezometrium. W przekroju poprzecznym macicy część przeciwna do światła nazywana jest stroną mesometrialną, podczas gdy część bliska światłu nazywana jest stroną antymesometrialną. Błona śluzowa macicy i jelito grube zasiedlają różne leukocyty matczyne, w tym kilka typów komórek, w których wrodzone komórki odpornościowe stanowią zdecydowaną większość komórek. Wrodzone komórki limfoidalne (ILC), makrofagi, komórki dendrytyczne (DC), a także limfocyty T CD4 + i CD8 +, limfocyty T regulatorowe (Treg) i rzadkie limfocyty B mogą odgrywać ważną rolę w regulacji środowiska macicy przez cały okres ciąży1,2. ILC w macicy znajdują się nie tylko w błonie śluzowej, ale także w mięśniówce macicy u myszy. Obejmując wszystkie trzy grupy ILC, macica jest rzeczywiście narządem najgęściej zaludnionym przez ILC grupy 1. Wraz z transformacją strukturalną tkanek macicy w trakcie ciąży zmienia się również liczba i proporcja leukocytów macicy (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A dla przykładu zmian procentowych podzbiorów uILC grupy 1)3,4.
Gdy w tym artykule mowa jest o myszach, chodzi o szczep C57BL/6 myszy laboratoryjnych wsobnych. Myszy niekrewniacze (np. Myszy NMRI) są często wykorzystywane w badaniach reprodukcyjnych ze względu na ich wysoki wskaźnik reprodukcji. Jednak użycie szczepów wsobnych jest konieczne do uzyskania spójnych wyników, a ulubionym tłem genetycznym immunologa jest C57BL / 6, znany również jako B6.
Około 30% leukocytów macicy u matek B6 w połowie ciąży to uILC g1, które są definiowane przez cytometrię przepływową jako żywotne komórki CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ (<klasa silna="xfig">Rysunek 2B): proangiogenne NK rezydentne w tkance (trNK), IFN-g wytwarzające konwencjonalne NK (cNK) i uILC14,5. Odsetek komórek uNK jest jeszcze wyższy u ludzi, osiągając około 70% w pierwszym trymestrze6. Jest więcej podobieństw niż różnic między człowiekiem a myszą uNK i uILC7,8. Chociaż ważne jest, aby pamiętać o różnicach, przydatne jest zintegrowanie dostępnych informacji na temat tych dwóch gatunków. Kiedy połączy się informacje uzyskane z badania uILC u ludzi i gryzoni laboratoryjnych, staje się jasne, że komórki NK pomagają w zmianach homeostatycznych niezbędnych dla biologii macicy, w tym w utrzymaniu integralności tętnic9 i przebudowie tętnic spiralnych10, a także inwazji trofoblastów11,12. Odgrywają również określone role w obronie przed patogenami13,14. U myszy i szczurów, oprócz wypełniania decidua wokół miejsca implantacji, komórki NK gromadzą się między dwiema warstwami mięśniówki macicy matek w przejściowej strukturze znanej jako agregat limfatyczny mesometrialu ciąży (MLAp)15 (<silna klasa="xfig">Figura 1B), znana również w przeszłości jako gruczoł metrialny, której funkcja nie została jeszcze odkryta.
Opisany tutaj jest szczegółowy protokół metody stosowanej w laboratorium do izolowania limfocytów z macicy ciężarnych myszy przy użyciu kombinacji mechanicznej dezagregacji i trawienia enzymatycznego. Ponieważ w metodzie wykorzystuje się całą macicę, limfocyty wyizolowane z macicy podczas ciąży są mieszaniną komórek dziesiętnych i mięśniówek macicy. Możliwe jest dalsze wypreparowanie decidua ze ściany macicy i jego MLAp, co zostało opisane wcześniej16. Opisana tutaj metoda została opracowana w celu uzyskania limfocytów macicy przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji powierzchni białka, funkcjonalności komórkowej i żywotności. Rezultatem jest zawiesina pojedynczej komórki z minimalną ilością szczątkowych zanieczyszczeń komórkowych i wydajnością zwykle od 1 do 5 milionów komórek w połowie ciąży (10,5 dnia) dla macicy w ciąży. Zastosowania tej metody obejmują fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej, sortowanie komórek do późniejszych badań transkryptomicznych lub proteomicznych, badania funkcjonalne, takie jak produkcja cytokin wewnątrzkomórkowych, degranulacja, ELISPOT lub testy cytotoksyczne. Przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na identyfikacji ILC grupy 1, ale może być dostosowany do innych typów komórek, takich jak inne ILC, limfocyty T, limfocyty B, DC lub makrofagi z niewielkimi modyfikacjami panelu przeciwciał używanego do analizy FACS. Protokół może być również stosowany do izolowania komórek z innych tkanek oraz do łączenia macic niebędących w ciąży.

<table><tbody><tr><td>70 &mikro; Sitka do komórek m</td><td>: Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Przeciwciało Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>Przeciwciało BD</td><td>562701</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>Przeciwciało BD</td><td>562600</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>103108</td><td></td></tr><tr><td>CD49a</td><td>Przeciwciało BD</td><td>740262</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche (Sigma)</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało EOMES</td><td>eBioscience</td><td>12-4875-82</td><td></td></tr><tr><td>Blok Fc Trustain fcx</td><td>BioLegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10217-106</td><td></td></tr><tr><td>Bufor Fix/Perm (część zestawu do utrwalania/permeabilizacji BD Cytofix/Cytoperm)</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche (Sigma)</td><td>5401089001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy Pharmlyse</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało NK1.1</td><td>BioLegend</td><td>108739</td><td></td></tr><tr><td>NKp46&nbsp; Przeciwciało</td><td>BioLegend</td><td>137608</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór (bez metanolu)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1026</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14030-048</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x (bez Ca2+ lub Mg2+)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR international</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>RMPI-1640 medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Violet Utrwalany barwnik</td><td>żywotności BioLegend</td><td>423113</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Opisana tutaj jest prosta metoda izolowania i fenotypowania mysich komórek limfoidalnych macicy grupy 1 (g1 uILC) z indywidualnej macicy ciężarnej za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół opisuje, jak ustawić krycie czasowe w celu uzyskania wielu synchronicznych matek, mechaniczne i enzymatyczne trawienie ciężarnej macicy, barwienie zawiesin pojedynczych komórek oraz strategię FACS do fenotypu i dyskryminacji g1 uILC. Chociaż metoda ta nieuchronnie traci informację przestrzenną o rozmieszczeniu komórkowym w tkance, protokół został z powodzeniem zastosowany do określenia heterogeniczności uILC, ich odpowiedzi na czynniki matczyne i płodowe wpływające na ciążę, profilu ekspresji genów i ich funkcji.

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Nasza metoda umożliwia ocenę składu i cech funkcjonalnych różnych subpopulacji limfocytów obecnych w tkance macicy zwierząt ciężarnych i nieciężarnych. Protokół ten pozwala na izolację limfocytów macicy przy jednoczesnym zachowaniu powierzchniowej ekspresji białka, żywotności i funkcjonalności komórek. Dzięki temu nadaje się do wielu późniejszych zastosowań.Usunięcie płodu na początku eksperymentu i pobranie leukocytów to technicznie trudne kroki. Ponieważ jest to długotrwały eksperyment, po osiągnięciu etapów barwienia przeciwciał potrzebna jest szczególna uwaga i skupienie. Na początek przenieś tkankę macicy pobraną od ciężarnej myszy C57 Black Six na sterylną szalkę Petriego, a następnie za pomocą sterylnych narzędzi delikatnie usuń tłuszcz otaczający tkankę, uważając, aby tkanka nie wyschła.Usuń płód, preparując każde miejsce implantacji sterylnymi narzędziami, a następnie przywróć macicę do oryginalnej pięciomililitrowej probówki zbiorczej zawierającej jeden mililitr pożywki zbiorczej. Za pomocą nożyczek zmiel tkankę w probówce zbiorczej, a następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanej mieszanki do trawienia enzymatycznego do probówki.Inkubować probówkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem w celu zwiększenia aktywności trawienia enzymatycznego. Po zakończeniu inkubacji należy zawirować probówkę i utrzymać ją na lodzie, aby zahamować aktywność enzymatyczną, a następnie przenieść tkankę trawienną do odpowiednio oznakowanej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Przepłucz pięciomililitrową probówkę zbiorczą łącznie 10 mililitrami lodowatego pięciomilimolowego roztworu EDTA PBS, aby zebrać całą pozostałą tkankę i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować strawioną próbkę tkanki przez 10 minut w temperaturze 400 razy G. Wyrzucić supernatant, delikatnie strzepnąć osad, a następnie ponownie zawiesić w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego pięciomilimolowego roztworu EDTA PBS. Aby zmniejszyć zlepianie się komórek, inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem, a następnie wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund. W celu usunięcia grudek komórek w nierozłączonej tkance, umieść sitko o średnicy 70 mikrometrów na sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra przepchnij strawioną tkankę przez sitko do probówki.Umyj sitko kilka razy łącznie 10 mililitrami zimnego PBS, aby zebrać wszystkie komórki, a następnie spędź 50-mililitrową probówkę wirówkową na 10 minut w 400 razy G. Po odrzuceniu supernatantu, wrodzone komórki limfoidalne można wyizolować przy użyciu opcji A lub opcji B. W przypadku opcji A, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach 80% izotonii na wywołanie za pomocą pipety voy. Następnie, używając pipety na niskiej prędkości, ostrożnie nałóż osiem mililitrów, 40% na wywołanie roztworu, na ponownie zawieszone osady w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Pipetować powoli i w sposób ciągły, trzymając 15 mililitrów pod kątem około 45 stopni.Nie naruszając nakładki, odwirować probówkę przez 20 minut przy sile 850 razy G ze średnim przyspieszeniem i minimalnymi przerwami w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, nie naruszając warstw na wywołanie. Następnie, nie naruszając pierścienia leukocytów na granicy dwóch roztworów na wywołanie, użyj sterylnej pipety Pasteura, aby wyrzucić wszystko z wyjątkiem 0,5 do jednego mililitra górnej warstwy na połączenie.Starając się ograniczyć do minimum ilość roztworu na wywołanie zasysanego do pipety, ostrożnie zbierz pierścień leukocytów i przenieś komórki do nowej, oznakowanej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 10 mililitrów sterylnej pożywki RPMI uzupełnionej 10% ciepłem i aktywowanym FBS do komórek, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i przystąpić do lizy czerwonych krwinek.Aby wyizolować komórki za pomocą opcji B, po przepuszczeniu strawionej tkanki przez sitko komórkowe i odwirowaniu wyniku w zawiesinie komórek, jak pokazano wcześniej, ponownie zawieś osad z ośmioma mililitrami 35% izotoniku na wywołanie i pożywką RPMI, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 940 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej ze średnim przyspieszeniem i minimalnymi przerwami. Następnie, za pomocą aspiratora lub pipety, ostrożnie odessaj supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 14 mililitrach pożywki RPMI uzupełnionej 10% ciepłem i aktywowanym FBS.Ponownie odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 500 razy G i w czterech stopniach Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant przez aspirację i przystąpić do lizy czerwonych krwinek. Aby zlizować czerwone krwinki, ponownie zawieś próbkę w trzech mililitrach jednego roztworu lizującego X czerwone krwinki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 10 mililitrów PBS do próbki, aby zatrzymać reakcję. Odwirować probówkę o stężeniu 400 razy G przez pięć minut po odrzuceniu supernatantu, dodać kolejne 10 mililitrów PBS i powtórzyć wirowanie.Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, a następnie przepuścić zawiesinę w komórce przez sterylne sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów. Po zliczeniu komórek dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do jednego do 2 milionów komórek w 100 mikrolitrach PBS i przystąp do barwienia i analizy facs. ILC grupy pierwszej macicy obejmują konwencjonalne komórki NK, komórki NK rezydujące w tkankach i ILC grupy pierwszej, których odsetek waha się w ciągu życia i ciąży.Te podzbiory można rozróżnić za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw bramkując komórki pod kątem ich zdolności do rozpraszania światła, następnie izolując pojedyncze do kupienia CD 45 dodatnie CD 3 ujemne komórki CD 19, a następnie identyfikując ILC grupy pierwszej, które są NK 1.1 i NKP 46 dodatnie. W grupie pierwszej ILC, CD49A ujemne EM dodatnie są konwencjonalnymi komórkami NK. CD49A dodatnie komórki Ems są komórkami NK rezydującymi w tkankach.A CD49-dodatnie komórki Ems są ILC macicy grupy pierwszej. Barwienie limfocytów śledziony i macicy przeciwciałami anty NK P46 i anty NK 1.1 pokazuje, że limfocyty śledziony wyrażają na swojej powierzchni większe ilości NKP 46 niż ich maciczne odpowiedniki. W enzymatycznej dysocjacji tkanek epitopy powierzchniowe mogą ulegać zmianie w zależności od enzymów użytych w pożywce trawiącej.Na przykład barwienie receptora MHC CD49 NKG2A jest słabe, gdy stosowana jest liberaza TM. Jednak trawienie liberazą DH zachowuje rozpoznanie NKG2A przez klon przeciwciała 1611. Około 6,5% ILC grupy pierwszej obecnych w próbkach tkanki macicy w 8,5 dniu ciąży jest pochodzenia krwionośnego.Zanieczyszczenia krwi można wykluczyć poprzez barwienie przyżyciowe przeciwciałami anty CD45 sprzężonymi z fluorochromem. Umawiając się na spotkania czasowe, należy wziąć pod uwagę, że myszy prowadzą nocny tryb życia. Dlatego należy je ustawić jak najpóźniej po południu, ponieważ krycie nastąpi w nocy.Również przy wyborze samic należy upewnić się, że nie mają one przegrody pochwowej. Zazwyczaj przeprowadzamy analizę cytometrii przepływowej, aby przyjrzeć się wielu białkom na zewnątrz komórek i wewnątrz komórek. Wykonujemy również ekstrakcję kwasów nukleinowych w celu zbadania ekspresji genów, w tym sekwencjonowania RNA.Udaje nam się również obejść testy funkcjonalne, aby zbadać reakcje wrodzonych komórek limfoidalnych macicy.

isolation-uterine-innate-lymphoid-cells-for-analysis-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Izolacja komórek zrębu węzłów chłonnych to wieloetapowa procedura obejmująca trawienie enzymatyczne i mechaniczną dezagregację w celu uzyskania fibroblastycznych komórek siatkowatych, limfatycznych i komórek śródbłonka krwi. W opisanej procedurze krótkie trawienie jest połączone z automatyczną dezagregacją mechaniczną w celu zminimalizowania degradacji markerów powierzchniowych żywotnych komórek zrębu węzłów chłonnych.

Izolacja komórek zrębu mysich węzłów chłonnych

Użycie pobierania próbek cytoszczotek do pobierania limfocytów i monocytów z szyjki macicy jest minimalnie inwazyjną techniką, która dostarcza próbek do analizy odporności żeńskich dróg rodnych. W tym protokole opisujemy pobieranie próbek cytoszczotek i izolację komórek odpornościowych do testów cytometrii przepływowej.

Pobieranie, izolacja i analiza cytometryczna przepływowa próbek z ludzkiej szyjki macicy

Opisany tutaj jest protokół do izolowania i analizy naciekających leukocytów tkanek na styku matki i płodu (macica, decidua i łożysko) myszy. Protokół ten zachowuje integralność większości markerów powierzchniowych komórek i zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych komórek do dalszych zastosowań, w tym analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z tkanek myszy na granicy matczyno-płodowej

Rośnie zainteresowanie ilościową charakterystyką limfocytów jelitowych ze względu na coraz większą świadomość, że komórki te odgrywają kluczową rolę w różnych chorobach jelitowych i ogólnoustrojowych. W tym protokole opisujemy, jak izolować populacje pojedynczych komórek z różnych przedziałów jelita cienkiego w celu późniejszej charakterystyki cytometrii przepływowej.

Izolacja i charakterystyka cytometryczna mysich limfocytów jelita cienkiego

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji limfocytów z miejsc indukcyjnych, w tym tkanki limfatycznej związanej z jelitami, plam Peyera i drenujących węzłów chłonnych krezkowych, oraz miejsc efektorowych, w tym blaszki właściwej i nabłonka jelitowego układu odpornościowego jelita cienkiego.

Izolowanie limfocytów od układu odpornościowego myszy w jelicie cienkim

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Poznaj metodę izolacji wrodzonych komórek limfatycznych macicy myszy do analizy cytometrią przepływową. Protokół zachowuje żywotność komórek i ekspresję białek powierzchniowych, umożliwiając fenotypowanie podpopulacji limfocytów.

Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów