Izolacja wrodzonych komórek limfatycznych macicy do analizy metodą cytometrii przepływowej

To jest metoda izolowania komórek limfoidalnych macicy zarówno od ciężarnych, jak i nieciężarnych myszy. Metoda ta może być stosowana w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak fenotypowanie FACS, sortowanie komórek, testy funkcjonalne, sekwencja RNA i proteomika. Protokół tutaj pokazuje, jak fenotypować wrodzone komórki limfoidalne macicy grupy 1 za pomocą cytometrii przepływowej.

Nasza metoda umożliwia ocenę składu i cech funkcjonalnych różnych subpopulacji limfocytów obecnych w tkance macicy zwierząt ciężarnych i nieciężarnych. Protokół ten pozwala na izolację limfocytów macicy przy jednoczesnym zachowaniu powierzchniowej ekspresji białka, żywotności i funkcjonalności komórek. Dzięki temu nadaje się do wielu późniejszych zastosowań.

Usunięcie płodu na początku eksperymentu i pobranie leukocytów to technicznie trudne kroki. Ponieważ jest to długotrwały eksperyment, po osiągnięciu etapów barwienia przeciwciał potrzebna jest szczególna uwaga i skupienie. Na początek przenieś tkankę macicy pobraną od ciężarnej myszy C57 Black Six na sterylną szalkę Petriego, a następnie za pomocą sterylnych narzędzi delikatnie usuń tłuszcz otaczający tkankę, uważając, aby tkanka nie wyschła.

Usuń płód, preparując każde miejsce implantacji sterylnymi narzędziami, a następnie przywróć macicę do oryginalnej pięciomililitrowej probówki zbiorczej zawierającej jeden mililitr pożywki zbiorczej. Za pomocą nożyczek zmiel tkankę w probówce zbiorczej, a następnie umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj trzy mililitry wstępnie podgrzanej mieszanki do trawienia enzymatycznego do probówki.

Inkubować probówkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem w celu zwiększenia aktywności trawienia enzymatycznego. Po zakończeniu inkubacji należy zawirować probówkę i utrzymać ją na lodzie, aby zahamować aktywność enzymatyczną, a następnie przenieść tkankę trawienną do odpowiednio oznakowanej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Przepłucz pięciomililitrową probówkę zbiorczą łącznie 10 mililitrami lodowatego pięciomilimolowego roztworu EDTA PBS, aby zebrać całą pozostałą tkankę i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Odwirować strawioną próbkę tkanki przez 10 minut w temperaturze 400 razy G. Wyrzucić supernatant, delikatnie strzepnąć osad, a następnie ponownie zawiesić w 10 mililitrach wstępnie podgrzanego pięciomilimolowego roztworu EDTA PBS. Aby zmniejszyć zlepianie się komórek, inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem, a następnie wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund. W celu usunięcia grudek komórek w nierozłączonej tkance, umieść sitko o średnicy 70 mikrometrów na sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie za pomocą tłoka sterylnej strzykawki o pojemności jednego mililitra przepchnij strawioną tkankę przez sitko do probówki.

Umyj sitko kilka razy łącznie 10 mililitrami zimnego PBS, aby zebrać wszystkie komórki, a następnie spędź 50-mililitrową probówkę wirówkową na 10 minut w 400 razy G. Po odrzuceniu supernatantu, wrodzone komórki limfoidalne można wyizolować przy użyciu opcji A lub opcji B. W przypadku opcji A, ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach 80% izotonii na wywołanie za pomocą pipety voy. Następnie, używając pipety na niskiej prędkości, ostrożnie nałóż osiem mililitrów, 40% na wywołanie roztworu, na ponownie zawieszone osady w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Pipetować powoli i w sposób ciągły, trzymając 15 mililitrów pod kątem około 45 stopni.

Nie naruszając nakładki, odwirować probówkę przez 20 minut przy sile 850 razy G ze średnim przyspieszeniem i minimalnymi przerwami w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, nie naruszając warstw na wywołanie. Następnie, nie naruszając pierścienia leukocytów na granicy dwóch roztworów na wywołanie, użyj sterylnej pipety Pasteura, aby wyrzucić wszystko z wyjątkiem 0,5 do jednego mililitra górnej warstwy na połączenie.

Starając się ograniczyć do minimum ilość roztworu na wywołanie zasysanego do pipety, ostrożnie zbierz pierścień leukocytów i przenieś komórki do nowej, oznakowanej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 10 mililitrów sterylnej pożywki RPMI uzupełnionej 10% ciepłem i aktywowanym FBS do komórek, a następnie odwiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i przystąpić do lizy czerwonych krwinek.

Aby wyizolować komórki za pomocą opcji B, po przepuszczeniu strawionej tkanki przez sitko komórkowe i odwirowaniu wyniku w zawiesinie komórek, jak pokazano wcześniej, ponownie zawieś osad z ośmioma mililitrami 35% izotoniku na wywołanie i pożywką RPMI, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 940 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej ze średnim przyspieszeniem i minimalnymi przerwami. Następnie, za pomocą aspiratora lub pipety, ostrożnie odessaj supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 14 mililitrach pożywki RPMI uzupełnionej 10% ciepłem i aktywowanym FBS.

Ponownie odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 500 razy G i w czterech stopniach Celsjusza, a następnie odrzucić supernatant przez aspirację i przystąpić do lizy czerwonych krwinek. Aby zlizować czerwone krwinki, ponownie zawieś próbkę w trzech mililitrach jednego roztworu lizującego X czerwone krwinki i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 10 mililitrów PBS do próbki, aby zatrzymać reakcję. Odwirować probówkę o stężeniu 400 razy G przez pięć minut po odrzuceniu supernatantu, dodać kolejne 10 mililitrów PBS i powtórzyć wirowanie.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki RPMI uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, a następnie przepuścić zawiesinę w komórce przez sterylne sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów. Po zliczeniu komórek dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do jednego do 2 milionów komórek w 100 mikrolitrach PBS i przystąp do barwienia i analizy facs. ILC grupy pierwszej macicy obejmują konwencjonalne komórki NK, komórki NK rezydujące w tkankach i ILC grupy pierwszej, których odsetek waha się w ciągu życia i ciąży.

Te podzbiory można rozróżnić za pomocą cytometrii przepływowej, najpierw bramkując komórki pod kątem ich zdolności do rozpraszania światła, następnie izolując pojedyncze do kupienia CD 45 dodatnie CD 3 ujemne komórki CD 19, a następnie identyfikując ILC grupy pierwszej, które są NK 1.1 i NKP 46 dodatnie. W grupie pierwszej ILC, CD49A ujemne EM dodatnie są konwencjonalnymi komórkami NK. CD49A dodatnie komórki Ems są komórkami NK rezydującymi w tkankach.

A CD49-dodatnie komórki Ems są ILC macicy grupy pierwszej. Barwienie limfocytów śledziony i macicy przeciwciałami anty NK P46 i anty NK 1.1 pokazuje, że limfocyty śledziony wyrażają na swojej powierzchni większe ilości NKP 46 niż ich maciczne odpowiedniki. W enzymatycznej dysocjacji tkanek epitopy powierzchniowe mogą ulegać zmianie w zależności od enzymów użytych w pożywce trawiącej.

Na przykład barwienie receptora MHC CD49 NKG2A jest słabe, gdy stosowana jest liberaza TM. Jednak trawienie liberazą DH zachowuje rozpoznanie NKG2A przez klon przeciwciała 1611. Około 6,5% ILC grupy pierwszej obecnych w próbkach tkanki macicy w 8,5 dniu ciąży jest pochodzenia krwionośnego.

Zanieczyszczenia krwi można wykluczyć poprzez barwienie przyżyciowe przeciwciałami anty CD45 sprzężonymi z fluorochromem. Umawiając się na spotkania czasowe, należy wziąć pod uwagę, że myszy prowadzą nocny tryb życia. Dlatego należy je ustawić jak najpóźniej po południu, ponieważ krycie nastąpi w nocy.

Również przy wyborze samic należy upewnić się, że nie mają one przegrody pochwowej. Zazwyczaj przeprowadzamy analizę cytometrii przepływowej, aby przyjrzeć się wielu białkom na zewnątrz komórek i wewnątrz komórek. Wykonujemy również ekstrakcję kwasów nukleinowych w celu zbadania ekspresji genów, w tym sekwencjonowania RNA.

Udaje nam się również obejść testy funkcjonalne, aby zbadać reakcje wrodzonych komórek limfoidalnych macicy.