Name: Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metody oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotne oraz nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki. Techniki in vitro pozwalają zminimalizować testy na zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie otrzymali żadnych funduszy na tę pracę.

1. Kultura pHCEC i iHCEC
<ol>
	<li>Hoduj pHCEC i iHCEC w ludzkim podłożu nabłonkowym oka (HOEM) z następującymi suplementami: 6 mM L-glutaminy, 0,002% suplementu pożywki komórkowej O (tabela materiałów), 1,0 μM epinefryny, 0,4% suplementu pożywki komórkowej P (tabela materiałów), 5 μg/ml insuliny rh, 5 μg/ml apo-transferyny i 100 ng/ml hemibursztynianu hydrokortyzonu w kolbach hodowlanych pokrytych kolagenem-1 (18 ml w kolbie hodowlanej o długości 75 cm2).</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę w kolbach co 2-3 dni, usuwając pożywkę po tym, jak komórki osiągną ~80% konfluencji. Dodać roztwór dysocjacyjny bez czerwieni fenolowej i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C aż do całkowitego odłączenia komórek. Zneutralizować roztwór dysocjacyjny za pomocą DMEM/F12 za pomocą surowicy, a następnie odwirować komórki przy 500 × g. Usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem i ponownie zawiesić komórki w pożywce HOEM.</li>
</ol>
2. Określanie wielkości komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Wysiewać zarówno pHCEC, jak i iHCEC na pokrytych kolagenem szalkach Petriego ze szkiełkami nakrywkowymi o stężeniu 1 × 105 z 1 ml HOEM. Hodować pHCEC i iHCECs, jeden zestaw kultur przez 24 godziny, a drugi zestaw kultur przez 48 godzin, w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po okresie inkubacji wybarwić komórki 500 μl roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego kalceinę (4 μM), homodimer-1 etydyny-1 (8 μM) i anektynę V (5 μl w 500 μl buforu – koniugat Alexa Fluor 647) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po wybarwieniu komórek wyreguluj mikroskop pod kątem wychwytywania długości fal wzbudzenia/emisji 488/515 nm dla kalceiny-AM, 543/600 nm dla homodimeru etydyny-1 i 633/665 nm dla aneksyny V za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy i wykonaj stosy Z, aby ocenić rozmiar komórki w trzech wymiarach.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać obrazy dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D), znajdź obszar do zobrazowania za pomocą apochromatycznego obiektywu wodnego 40x/1,2. Za pomocą laserów Argon (488) (pierwszy skan), HeNe1 (543) (drugi skan i HeNe2 (633) (trzeci skan) skanuj w trzech oddzielnych kanałach za pomocą rozdzielaczy wiązki, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis i NFT 545 LP560, LP505.</li>
		<li>Użyj wielościeżkowego skanowania sekwencyjnego, aby zredukować przesłuchy. 
		UWAGA: LP505 jest używany do kanału 2 z laserem 488 do wychwytywania emisji barwnika kalceinowego. LP560 jest używany w kanale 3 z laserem 543 do przechwytywania emisji homodimeru etydyny 1. NFT 635 jest używany z laserem 633 do przechwytywania emisji aneksyny V. Zadaniem HFT jest oddzielenie światła wzbudzającego i emisyjnego. NFT rozdziela światło, odbijając światło < określonej długości fali do oddzielnego kanału, jednocześnie przepuszczając światło > określoną długość fali do drugiego kanału. Filtry LP blokują fale krótsze niż określona długość fali i przepuszczają dłuższe fale.</li>
		<li>Aby obrazować w 3D, ustaw konfokalną na stos Z i zeskanuj co najmniej 20 klatek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Narażenie komórek na promieniowanie UV
<ol>
	<li>Wysiewać komórki w 5 × 104/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny. Po okresie inkubacji zmniejszyć objętość pożywki w studzienkach do 300 μl. Następnie wystaw komórki na działanie promieniowania UV (zarówno UVA o sile 6,48 W/m2, jak i UVB o sile 1,82 W/m2, ponieważ w tym samym czasie w inkubatorze włączane są lampy UVA i UVB) w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 5 i 20 minut w oddzielnych eksperymentach.</li>
	<li>Po napromieniowaniu UV dodać 200 μl świeżego HOEM do każdej studzienki i inkubować przez 20 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji zebrać supernatant komórkowy do każdej studzienki i przenieść go do sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C. Aby określić poziomy cytokin uwalnianych przez pHCEC i iHCEC po ekspozycji na promieniowanie UV, użyj testu cytokin multipleksowych i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo następujące cztery cytokiny: IL-6, IL-8, IL-1β i TNF-α.</li>
	<li>Dodaj odczynnik do oznaczania metabolicznego do komórek w studzienkach.</li>
	<li>Przygotować 10% odczynnik do oznaczania metabolizmu w DMEM/F12. Zastąpić pożywkę hodowlaną w każdym dołku 1 ml 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję każdego roztworu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych przy długościach fal wzbudzenia/emisji 530/590 nm.</li>
</ol>
4. Narażenie komórek na toksyny chemiczne
<ol>
	<li>Komórki nasienne w wieku 5 × 104/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 3 godziny. Po okresie inkubacji usunąć pożywkę i wystawić komórki na działanie 1 ml toksyn chemicznych (BAK 0,001%,H2O20,01% i SDS 0,0025% w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) przez 5 i 15 minut.</li>
	<li>Po wystawieniu na działanie toksyn chemicznych usuń toksyny ze studzienek, spłucz 1 ml PBS i dodaj 1 ml HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji przeprowadzić test metaboliczny, zastępując pożywkę 1 ml 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubując w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny. Zmierz fluorescencję za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek wielodołkowych przy długościach fal wzbudzenia/emisji 530/590 nm.</li>
	<li>Po 20-godzinnej inkubacji przenieść supernatanty komórkowe z dołków do oddzielnych sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 2 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C. Określić ilościowo cytokiny uwalniane przez pHCEC i iHCEC po ekspozycji na chemikalia. Użyj tej samej platformy multipleksowej, która służy do oceny cytokin z komórek poddanych działaniu promieniowania UV. Użyj testu cytokin multipleksowych zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo następujące cztery cytokiny: IL-6, IL-8, IL-1β i TNF-α.</li>
</ol>
5. Badanie komórek wystawionych na działanie różnych stężeń BAK
<ol>
	<li>Komórki nasienne w temperaturze 1 × 105/ml HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Po okresie inkubacji należy usunąć pożywkę i wystawić komórki na działanie 1 ml toksyn chemicznych (BAK 0,001%, BAK 0,005% i BAK 0,01% w PBS) przez 5 minut.</li>
	<li>Po ekspozycji usuń toksyny chemiczne, przepłucz studzienki 1 ml PBS i dodaj 1 ml HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji wybarwić komórki 500 μl roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego kalceinę (4 μM), homodimer-1 etydyny-1 (8 μM) i anektynę V (5 μl w 500 μl buforu-koniugat Alexa Fluor 647) przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Ustawić mikroskop do pomiaru intensywności aneksyny V, barwienie kalceiną AM i etydyną-1 przy długościach fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 630/675 nm, 495/515 nm i 528/617 nm. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeprowadź test normalności i test równych wariancji przed wykonaniem analizy wariancji (ANOVA), testu Welch ANOVA lub testu Kruskala-Wallisa. Użyj odpowiedniego testu post-hoc do porównania każdej badanej grupy. Ustaw p < 0,05.</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

Autor, Lyndon W. Jones, w ciągu ostatnich 3 lat, za pośrednictwem CORE, otrzymał wsparcie badawcze lub honoraria wykładowców od następujących firm: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage i Visioneering. Lyndon Jones jest również konsultantem i/lub zasiada w radzie doradczej firm Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis i Ophtecs. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oceniono potencjalne różnice w stosowaniu dwóch rodzajów HCEC. Komórki umieszczono w tym samym pożywce (HOEM) o identycznych stężeniach komórek, a następnie wystawiono na działanie krótkich i długich okresów promieniowania UV i trzech toksyn ocznych. Dawki promieniowania UV i substancji chemicznych zostały dobrane na podstawie ich efektów fizjologicznych, które były wystarczająco szkodliwe dla komórek, aby wywołać reakcje pośrednie, które można było porównać. Czasy ekspozycji wynoszące 5 i 20 minut dla promieniowania UV ...

Badania toksykologiczne in vitro są przeprowadzane w celu przewidywania toksycznych skutków chemikaliów i innych czynników, które mogą powodować uszkodzenia komórek. W ocenie toksyczności dla rogówki ludzkie komórki nabłonka rogówki (HCEC) zostały wykorzystane w modelach do oceny tych efektów1,2,3,4. Modele te zazwyczaj oceniają efekty fizjologiczne, takie jak zmiany w aktywności metabolicznej komórki, proliferacja komórek i inne funkcje komórki, takie jak produkcja i uwalnianie cytokin zapalnych. Do tych badań toksykologicznych wybrano komórki z różnych źródeł, aby ocenić szkodliwy wpływ chemikaliów i promieniowania UV na HCECs2,3. Linie pHCEC są dostępne w firmach, które dostarczają te komórki z tkanek dawców dorosłych. Komórki pierwotne można potraktować dypazą i delikatnie zeskrobać z rogówki w celu hodowli5. Komórki są następnie testowane pod kątem wirusów i zanieczyszczeń, a następnie wysyłane w kriokonserwacji w 10% sultlenku dimetylu.
Zaletą pierwotnych linii komórkowych jest to, że komórki są genetycznie identyczne z komórkami dawcy. Jest to idealne rozwiązanie, ponieważ model in vitro powinien w jak największym stopniu naśladować tkankę in vivo. Wadą pierwotnych linii komórkowych jest to, że mają ograniczoną liczbę podziałów komórkowych lub pasaży6. Ograniczona liczba dostępnych komórek ogranicza liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić z pojedynczą hodowlą pierwotną, zwiększając koszt eksperymentów.
Uwiecznione linie komórkowe były również używane w modelach toksyczności hodowli komórkowych. Jednak w przeciwieństwie do pierwotnej linii komórkowej uzyskanej z tkanki in vivo, unieśmiertelniona linia komórkowa została genetycznie zmieniona. Unieśmiertelnione komórki są tworzone przez włączenie genów wirusa do DNA komórek pierwotnych6,7,8. Komórki z udaną inkorporacją genów wirusa są wybierane do unieśmiertelnionej linii komórkowej. Zaletą nieśmiertelności jest to, że pozwala na nieskończoną szybką proliferację, zapewniając nieograniczoną liczbę komórek do wykonywania wielu eksperymentów przy użyciu tej samej linii komórkowej. Pozwala to na zachowanie spójności między eksperymentami i zmniejszenie kosztów.
Oprócz zmian w genach, które ograniczały proliferację komórek, mogą również wystąpić zmiany w ekspresji genów o krytycznej funkcjonalności9. Dlatego wadą stosowania unieśmiertelnionych komórek jest to, że mogą one już nie reprezentować oryginalnych komórek in vivo pod względem ich reakcji na różne bodźce zewnętrzne10. Porównania obejmowały obserwację toksycznego wpływu chemikaliów na pierwotne i unieśmiertelnione ludzkie keratocyty rogówki11, a także unieśmiertelnione HCEC i pierwotne komórki nabłonka rogówki królika12. Porównanie wpływu toksyn na pierwotne ludzkie keratocyty i unieśmiertelnione keratocyty nie wykazało istotnych różnic11. Korzystając z metod opisanych w tym artykule, zostanie określona skuteczność tych testów do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn ocznych na pHCEC i iHCECs.
Wybrano trzy toksyny do oczu powszechnie stosowane w testach in vitro: BAK,H2O2 i SDS. BAK to kationowy środek konserwujący powszechnie stosowany w roztworach okulistycznych13,14, H2O2 jest powszechnie stosowany do dezynfekcji soczewek kontaktowych15, a SDS to anionowy środek powierzchniowo czynny występujący w detergentach i szamponach14. Podobnie jak toksyny oczne, promieniowanie UV może również powodować znaczne uszkodzenia HCECs3. Ponadto nadmierna ekspozycja na promieniowanie UV może powodować stan oczu znany jako fotokeratitis charakteryzujący się objawami łzawienia, wrażliwości na światło i uczuciem szorstkości16.
Istnieje nieograniczona liczba pierwotnych kultur komórkowych, które mogą być użyte, oraz różne unieśmiertelnione linie komórkowe, które zostały już opracowane. W związku z tym podjęto badanie w celu porównania pierwotnych HCEC z unieśmiertelnioną linią HCEC w celu określenia podobieństw i różnic między modelami, które zawierają te typy komórek.
W tym badaniu użyto mikroskopii, aby ocenić możliwe różnice między pHCEC i iHCEC w fizjologicznej reakcji komórek na promieniowanie UV i toksyny. Oceniono również wpływ promieniowania UV i substancji chemicznych na aktywność metaboliczną komórek i uwalnianie cytokin zapalnych dla dwóch linii komórkowych. Znaczenie określenia różnic między dwiema liniami komórkowymi polega na zrozumieniu optymalnego wykorzystania tych linii komórkowych do oceny: 1) wpływu promieniowania UV na komórki, 2) wpływu toksyn na komórki oraz 3) wynikających z tego zmian w metabolizmie, żywotności komórek i uwalnianiu cytokin komórkowych do przyszłych badań.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Kolba wentylowana</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>To jest marka BioCoat, pokryta kolagenem</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Roztwór buforowy do barwienia</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Mikroskop Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 z konfokalnym laserowym mikroskopem skaningowym Zeiss System 510</td><td>Carl Zeiss Inc., Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 48 Płytki dołkowe</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>To jest marka BioCoat, pokryta kolagenem</td></tr><tr><td>Cytacja 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>Potrafi odczytać fluorescencję od 280 - 700 nm (do testu 540/590)</td></tr><tr><td>Hykon surowicy bydlęcej płodu</td><td></td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nabłonka rogówki</td><td>University of Ottawa</td><td>N/A</td><td>SV40-unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka rogówki od dr M. Griffitha (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) i zostały scharakteryzowane Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funkcjonalne odpowiedniki ludzkiej rogówki zbudowane z linii komórkowych. Nauka. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Human Ocular Epithelia Media (HOEM) z następującymi suplementami:</td> <td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCMC001</td><td>Pożywka bazowa Epigro uzupełniona 6 mM L-glutaminą, 0,002% EpiFactor O (suplement pożywki komórkowej O w artykule), 1,0 i mu; M Epinefryna, 0,4% EpiFactor P (suplement pożywki komórkowej P w artykule), 5 i mu; g/ml rh Insulina, 5 &mu; g / ml Apo-transferyny i 100 ng / ml hemibursztynianu hydrokortyzonu w kolbach hodowlanych pokrytych kolagenem-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).</td></tr><tr><td>Żywy martwy homodimer kalcien i etydyny</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MezoScale Discovery (MSD) Instrument QuickPlex SQ 120</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Panel prozapalny człowieka MSD II (4-Plex) Test V-Plex</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x stężenie, więc dodaj 1 ml do każdych 99 ml pożywki</td></tr><tr><td>Pierwotne komórki nabłonka rogówki</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik fluorescencyjnych płytek wielodołkowych SpectraMax</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (roztwór do dysocjacji komórek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

określanie toksyczności promieniowania uv i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Ten artykuł opisuje metody pomiaru toksyczności promieniowania ultrafioletowego (UV) i toksyn ocznych na pierwotnych (pHCEC) i unieśmiertelnionych (iHCEC) ludzkich hodowlach komórek nabłonka rogówki. Komórki wystawiono na działanie promieniowania UV i toksycznych dawek chlorku benzalkoniowego (BAK), nadtlenku wodoru (H2O2) i dodecylosiarczanu sodu (SDS). Aktywność metaboliczną mierzono za pomocą testu metabolicznego. Uwalnianie cytokin zapalnych mierzono za pomocą testu interleukiny multi-plex (IL)-1β, IL-6, IL-8 i czynnika martwicy nowotworów alfa (TNF-α), a komórki oceniano pod kątem żywotności za pomocą barwników fluorescencyjnych. 
Szkodliwy wpływ promieniowania UV na aktywność metaboliczną komórek i uwalnianie cytokin wystąpił po 5 minutach ekspozycji na promieniowanie UV dla iHCEC i 20 minutach dla pHCEC. Podobne procentowe spadki aktywności metabolicznej iHCEC i pHCEC wystąpiły po ekspozycji na BAK,H2O2lub SDS, a najbardziej znaczące zmiany w uwalnianiu cytokin wystąpiły w przypadku IL-6 i IL-8. Mikroskopia komórek naświetlonych fluorescencyjnie i pHCEC BAK wykazała śmierć komórek przy 0,005% ekspozycji na BAK, chociaż stopień zabarwienia etydyną był większy w iHCEC niż pHCEC. Wykorzystując wiele metod oceny skutków toksycznych za pomocą mikroskopii, oceny aktywności metabolicznej i produkcji cytokin, można określić toksyczność promieniowania UV i toksyn chemicznych zarówno dla pierwotnych, jak i unieśmiertelnionych linii komórkowych.

Wielkość komórek 
Pierwotne i unieśmiertelnione HCECs wizualizowano za pomocą trzech barwników fluorescencyjnych, które odzwierciedlają trzy różne stadia żywotności komórek. Komórki żywe są zielone (calcein-AM), martwe są czerwone (ethidium homodimer-1), a komórki apoptotyczne są żółte (annexin V – kolor skorygowany komputerowo w celu lepszej wizualizacji sygnału fluorescencyjnego). Komórki żywe zawierają esterazy w cytoplazmie i przekształcają calcein-AM w kalceinę. Komórki martwe posiadają błony kom...

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Metoda ta może być stosowana do oceny in vitro toksyczności nowych preparatów produktów okulistycznych. Poprzez udoskonalenie stężeń substancji chemicznych i preparatów produktów przy użyciu komórek oka in vitro, wykorzystanie zwierząt do oceny bezpieczeństwa nowych produktów może zostać zminimalizowane. Testy in vitro oceniają punkty końcowe toksyczności, których nie można ocenić in vivo, takie jak określenie wpływu substancji chemicznej na funkcję mitochondriów, integralność błony komórkowej i aktywność enzymów.Ocena toksyczności komórkowej in vitro jest kluczem do zrozumienia potencjalnych mechanizmów toksyczności. Ma to zasadnicze znaczenie dla ustalenia maksymalnej tolerowanej dawki terapeutycznych substancji chemicznych w oku. Procedurę zademonstruje Nijani Nagaarudkumaran, badacz z Jones Laboratory.Zacznij od umieszczenia zarówno pHCEC, jak i iHCEC na pokrytych kolagenem szalkach Petriego ze szklaną dolną pokrywą w stężeniu 1 x 10 do 5 z 1 mililitrem ludzkiego nabłonka oka lub HOEM. Hoduj pHCEC i iHCECs 1 zestaw kultur przez 24 godziny, a drugi zestaw przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po inkubacji wybarwić komórki 500 mikrolitrami roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego 4 mikromolowe kalceiny, 8 mikromolowe homodimery etydyny 1 i aneksynę 5 przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po wybarwieniu komórek wyreguluj konfokalny laserowy mikroskop skaningowy, aby uchwycić długości fal wzbudzenia i emisji, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Uzyskaj dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazy zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie. Wysiewaj komórki w proporcjach 5 x 10 do 4 na mililitr HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem 1 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 3 godziny.Po inkubacji zmniejsz objętość pożywki w studzienkach do 300 mikrolitrów. Następnie wystaw komórki na działanie promieniowania UVA o mocy 6,48 wata na metr kwadratowy i promieniowania UVB o mocy 1,82 wata na metr kwadratowy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 i 20 minut w oddzielnych eksperymentach. Po napromieniowaniu UV dodaj 200 mikrolitrów świeżego HOEM do każdej studzienki i inkubuj przez 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Następnego dnia zbierz supernatant komórek w każdej studzience i przenieś go do sterylnych 2-mililitrowych probówek polipropylenowych. Zawiesić supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby określić poziomy cytokin uwalnianych przez pHCEC i iHCEC po ekspozycji na promieniowanie UV, użyj multipleksowego testu cytokin i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo interleukinę 6, interleukinę 8, interleukinę-1 beta i TNF-alfa.Przygotować 10% odczynnik do oznaczania metabolizmu w DMEM i F12. Zastąp pożywkę hodowlaną w każdym dołku 1 mililitrem 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 4 godziny. Zmierz fluorescencję każdego roztworu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych przy wzbudzeniu 530 nanometrów i długości fali emisji 590 nanometrów.Komórki nasienne w ilości 5 x 10 do czwartej na mililitr HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem 1. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 3 godziny. Po inkubacji usuń pożywkę i wystaw komórki na działanie 1 mililitra toksyn chemicznych, które obejmują 0,001% chlorku benzalkoniowego lub BAK, 0,01% nadtlenku wodoru i 0,0025% dodecylosiarczanu sodu w PBS przez 5 i 15 minut.Po wystawieniu na działanie toksyn chemicznych usuń toksyny ze studzienek, spłucz 1 mililitrem PBS i dodaj 1 mililitr HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji wykonaj test metaboliczny, zastępując pożywkę 1 mililitrem 10% roztworu do oznaczania metabolizmu i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 4 godziny. Zmierz fluorescencję każdego roztworu za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych przy wzbudzeniu 530 nanometrów i długości fali emisji 590 nanometrów.Po 20-godzinnej inkubacji przenieść supernatanty komórkowe z dołków do oddzielnych sterylnych probówek polipropylenowych o pojemności 2 mililitrów i zamrozić je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Użyj tej samej platformy multipleksowej, która służy do oceny cytokin z komórek poddanych działaniu promieniowania UV, postępując zgodnie z instrukcjami zestawu, aby określić ilościowo interleukinę 6, interleukinę 8, interleukinę-1 beta i TNF-alfa. Komórki nasienne w ilości 1 x 10 do 5 na mililitr HOEM w każdym dołku 24-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem 1 i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Po inkubacji usuń pożywkę i wystaw komórki na działanie 1 mililitra toksyn chemicznych, w tym 0,001% BAK, 0,005% BAK i 0,01% BAK w PBS przez 5 minut. Po ekspozycji usuń toksyny chemiczne, przepłucz studzienki 1 mililitrem PBS i dodaj 1 mililitr HOEM do każdej studzienki. Po 20 godzinach inkubacji wybarwić komórki 500 mikrolitrami roztworu buforowego do barwienia aneksyny zawierającego kalceinę, homodimer etydyny i aneksynę 5 przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dostosuj mikroskop do pomiaru intensywności przy długościach fal wzbudzenia i emisji 630 i 675 nanometrów dla aneksyny 5, 495 i 515 nanometrów dla kalceiny AM oraz 528 i 617 nanometrów dla barwienia etydyny 1. Następnie uzyskaj obrazy komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Okazało się, że iHCEC są małymi komórkami o wielkości od 10 do 20 mikrometrów, a pHCEC mieściły się w zakresie od 20 do 50 mikrometrów po 24 godzinach wzrostu.Podobne różnice w zakresie wielkości zaobserwowano dla iHCEC i pHCEC po 48 godzinach wzrostu. W porównaniu z komórkami bez ekspozycji na promieniowanie UV, aktywność metaboliczna napromieniowanych pHCEC była znacznie zmniejszona po 20 minutach ekspozycji. W przypadku iHCEC aktywność metaboliczna zmniejszyła się w przypadku komórek napromieniowanych zarówno po 5, jak i 20 minutach.W związku z tym potrzeba było dłuższego czasu ekspozycji, aby zmniejszyć aktywność metaboliczną pHCEC niż iHCEC. Maksymalne uwalnianie cytokin przez iHCEC przypadało na 5 minut ekspozycji na promieniowanie UV. Maksymalne uwalnianie cytokin dla pHCEC nastąpiło po 20 minutach ekspozycji na promieniowanie UV.Jeśli chodzi o całkowite ilości uwolnionych cytokin zapalnych, pHCEC uwalniały znacznie więcej interleukiny-1 beta, interleukiny 8 i TNF-alfa niż iHCEC, podczas gdy iHCEC uwalniały więcej interleukiny 6. Zarówno pHCEC, jak i iHCEC wykazały zmianę w uwalnianiu interleukiny 6 po ekspozycji na wszystkie trzy substancje chemiczne. BAK spowodował zmniejszenie uwalniania interleukiny 6 w porównaniu z kontrolą zarówno dla pierwotnych, jak i unieśmiertelnionych HCEC.Nadtlenek wodoru spowodował zwiększenie uwalniania interleukiny 6 z iHCEC i zmniejszenie uwalniania z pHCEC. Zarówno pHCEC, jak i iHCEC zostały znacząco uszkodzone na poziomie 0,005% i 0,1% BAK. Po przeprowadzeniu oceny in vitro toksyczności dla komórek oka można przeprowadzić dalsze badania nad zwierzęcymi modelami toksyczności ocznej w celu określenia wpływu produktu ocznego na nerwy rogówki lub układ odpornościowy oka.Techniki te są niezbędne do określenia mechanizmów toksyczności chemicznej i toksyczności preparatu produktu dla oka i pomogą zminimalizować wykorzystanie zwierząt do badań rozwojowych produktu.

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test fluorometryczny in vitro, który ma na celu ocenę wpływu preparatów sztucznych łez na komórkową aktywność metaboliczną komórek nabłonka rogówki przy użyciu roztworu niebieskiego Alamar na bazie resazuryny. Nietoksyczny preparat utrzymuje komórki w zdrowym, metabolicznie aktywnym stanie, ułatwiając redukcję rezazuryny do wysoce fluorescencyjnej rezorufiny.

Test alamarBlue: czuła metoda fluorometryczna do badania cytotoksycznego wpływu preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

Celem tego protokołu jest ocena, czy różne preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą modelu in vitro. Po wystawieniu na działanie preparatów sztucznych łez i wysuszeniu, ludzkie komórki nabłonka rogówki są oceniane pod kątem aktywności metabolicznej.

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

W niniejszej pracy opisujemy szczegółową metodę hodowli pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów tkanki dróg oddechowych człowieka, w tym ich różnicowania na granicy faz powietrze-ciecz. Metoda ta zapewnia obfite źródło pierwotnych komórek do badania roli nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobach ludzkich płuc.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

Poznaj metody oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotne oraz nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki. Techniki in vitro pozwalają zminimalizować testy na zwierzętach.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki (Wideo) | JoVE Journal

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Przeglądaj więcej filmów