Name: Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj metodę wzrostu, oczyszczania i miareczkowania onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej do badań przedklinicznych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiej jakości zapasu wirusowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Saha były częściowo wspierane przez fundusze z DOD (W81XWH-20-1-0702) i Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin i Melissa R.M. Humphrey byli częściowo wspierani przez NIH (R01 CA160762).

1) wzrost oHSV
UWAGA: Upewnij się, że instytucjonalny komitet ds. bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzi przed rozpoczęciem pracy z oHSV. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem IBC nr 18007. Zachowaj środki ostrożności BSL2: wybielaj wszystkie pipety, końcówki, rurki i inne materiały, które mają kontakt z wirusem. Spryskaj rękawice 70% alkoholem izopropylowym przed opuszczeniem kaptura do hodowli komórkowych BSL2. Zawsze dokładnie myj ręce wodą z mydłem po pracy z wirusem.
<ol>
	<li>W dniu -1 zasiej niskopasażowe komórki Vero w 20 kolbach T-150 cm2 o gęstości 7-8 × 106 komórek/kolbę w zwykłym podłożu komórkowym Vero. 
	UWAGA: Pożywka Vero jest przygotowywana przez uzupełnienie zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (IFCS).</li>
	<li>W dniu 0 (komórki zlewają się w 80-90%) dodaj inokulum oHSV na komórki Vero.
	<ol>
		<li>Przygotowanie inokulum wirusa
		<ol>
			<li>Do amplifikacji wirusa należy użyć wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,01 (MOI może wahać się od 0,01 do 0,1 w zależności od zdolności replikacji wirusa). Użyj wzoru (1), aby obliczyć ilość wirusa (ml) na 20 kolb. 
			Ilość wirusa (ml) na 20 kolb = ilość potrzebnego wirusa (pfu)/miano wirusa (pfu/ml)(1)</li>
			<li>Do przygotowania inokulum wirusa należy użyć soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 1% IFCS (7 ml na kolbę T-150 cm2, tj. ~140 ml na 20 kolb). Dodaj wymaganą ilość oHSV do 140 ml wysokoglukozowego roztworu DPBS/1% IFCS, wiruj przez 1 minutę i utrzymuj mieszaninę gotową do dodania do komórek Vero.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umyj kolby T-150 cm2 2x DPBS o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionym 1% IFCS (10 ml/pranie). Odessać DPBS/1% IFCS i dodać 7 ml inokulum wirusa/kolby T-150 cm2.</li>
		<li>Delikatnie kołysać kolby przez 5 minut za pomocą kołyski kolby w celu prawidłowego rozprowadzenia inokulum na monowarstwie Vero, a następnie inkubować kolby w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny. Upewnij się, że półka inkubatora jest wypoziomowana.</li>
		<li>Usunąć inokulum i dodać DMEM uzupełniony 1% IFCS (25 ml / kolbę). Inkubować kolby przez 2-4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj kolby pod kątem 90-100% CPE (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Zbierz zakażone oHSV komórki Vero.
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant hodowli (~20 ml) z każdej kolby (pozostawić ~5 ml w każdej kolbie) do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub pojemnika na pożywkę.</li>
		<li>Użyj skrobaka do komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki z dna kolb. 
		UWAGA: Komórki powinny szybko zejść z kolb.</li>
		<li>Dodać ~15 ml supernatantu do hodowli (zebranego w kroku 1.4.1) do każdej kolby (co daje objętość ~20 ml w każdej kolbie, tj. 400 ml na 20 kolb) i delikatnie umyć dno kolb kilka razy za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml. 
		UWAGA: Nie pipetować energicznie. Staraj się, aby wszystkie komórki pozostały nienaruszone.</li>
		<li>Zebrać komórki (+ pożywkę) do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml na lodzie (użyć 8 probówek na 400 ml pobranych komórek z 20 kolb).</li>
		<li>Wirować komórki z masą 300 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać 1,25 ml (50%) buforu wirusa (VB) i 1,25 ml (50%) supernatantu hodowlanego (zebranego w kroku 1.4.1) do każdej probówki wirówkowej i dokładnie zawiesić każdą osadkę. Przenieś ponownie zawieszone komórki z ośmiu probówek wirówkowych o pojemności 50 ml do jednej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Patrz przygotowanie roztworu VB w Tabeli 1. Przefiltruj i wysterylizuj roztwór VB za pomocą filtra do sterylizacji mediów. Użyć 0,5 ml VB + 0,5 ml supernatantu na kolbę T-150 cm2 do ponownego zaparcia, tj. dla 20 kolb (20 ml) użyć 10 ml VB i 10 ml supernatantu do hodowli.</li>
		<li>Ponownie zawieszone komórki należy zamrozić za pomocą suchego lodu/100% etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2) oczyszczanie oHSV
<ol>
	<li>Szybkie zamrażanie (w suchym lodzie i 100% etanolu)/rozmrażanie (w ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C), a następnie sonikacja w kąpieli wodnej przez 1 minutę, w sumie 3 cykle, aby zapewnić prawidłową lizę komórek w celu uwolnienia wirusa w supernatancie. 
	UWAGA: Wykonuj sonikację przez 1 minutę przy użyciu zasilania 40 kHz, 120 V. Jeśli przestrajalny sonikator nie jest dostępny, użyj ultradźwiękowego sonikatora w kąpieli wodnej. Pobrać porcję o objętości 50 μl do miareczkowania w sekcji 3, która pomoże określić, który z poniższych etapów jest odpowiedzialny za potencjalną utratę wirusa podczas procedury oczyszczania.</li>
	<li>Potraktować lizat komórkowy nukleazą benzonazową (175 jednostek/ml) + 2 mM MgCl2 (1 M zapas = 2 μl/ml), wirować i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Umieścić probówkę na lodzie i wykonać następujące czynności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Osadzaj resztki komórek przez wirowanie na niskiej prędkości.
	<ol>
		<li>Wirować lizat komórkowy z prędkością 300 g przez 10 minut.</li>
		<li>Zebrać supernatant w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml VB, oznaczyć go jako osad-1 i przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w kroku 2.3.5; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Ponownie odwirować supernatant (otrzymany w kroku 2.3.2) z prędkością 500 g przez 10 minut.</li>
		<li>Zebrać supernatant w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml VB, oznaczyć go jako granulkę-2 i przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia w kroku 2.3.5; patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Połączyć ponownie zawieszone osady-1 (z 2.3.2) i osady-2 (z 2.3.4) w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml, wirować/sonikować (łaźnia wodna) 2x i wirować z prędkością 400 g przez 10 minut. Zebrać supernatant i połączyć go z supernatantem otrzymanym w kroku 2.3.4; patrz Rysunek 1). 
		UWAGA: Wykonuj sonikację przez 1 minutę przy użyciu zasilania 40 kHz, 120 V, aby zapobiec agregacji wirusów przed procedurą filtracji w kroku 2.4. Pobrać 50 μl podwielokrotności połączonego supernatantu do miareczkowania zgodnie z sekcją 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować złożony supernatant (~21 ml, tj. 20 ml z 1.4.6, 0,5 ml z 2.3.2 i 0,5 ml z 2.3.4) stosując następującą 3-etapową metodę filtracji.
	<ol>
		<li>Pobrać 21 ml supernatantu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml (5-7 ml za każdym razem dla łatwego przejścia przez filtr) i przepuścić go przez sterylny filtr membranowy z polifluorku winylidenu (PVDF) o grubości 5 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 1).
		<ol>
			<li>Dodać 1 ml VB do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml opróżnionej w 2.4.1 (w celu zebrania pozostałej śladowej ilości supernatantu wirusa), odwirować i przepuścić przez ten sam filtr PVDF 5 μm umieszczony na probówce 1 (co daje w sumie 22 ml filtratu). Przejdź do kroku 2.4.2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobrać 22 ml filtratu z probówki 1 (jak w ppkt 2.4.1) i przepuścić go przez sterylny filtr membranowy z mieszanego estru celulozy (MCE) o objętości 0,8 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 2).
		<ol>
			<li>Dodaj 1 ml VB do probówki 1 opróżnionej w kroku 2.4.2, wir i przepuść przez ten sam filtr MCE 0,8 μm umieszczony na probówce 2 (co daje w sumie 23 ml filtratu). Przejdź do kroku 2.4.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobrać 23 ml filtratu z probówki 2 (jak w ppkt 2.4.1) i przepuścić go przez sterylny filtr PVDF o pojemności 0,45 μm umieszczony na nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (oznaczonej jako PROBÓWKA 3).
		<ol>
			<li>Dodaj 1 ml VB do probówki 2 opróżnionej w kroku 2.4.3, wiruj i przepuść przez ten sam filtr PVDF 0,45 μm umieszczony na probówce 3 (co daje w sumie 24 ml filtratu). 
			UWAGA: Pobrać 50 μl podwielokrotności filtratu do miareczkowania w sekcji 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybkie wirowanie metodą gradientu sacharozy 
	UWAGA: W tym protokole zastosowano wirnik F13-14x50cy o stałym kącie. Zarówno wirnik, jak i wirówka muszą mieć temperaturę 4 °C przed przystąpieniem do następujących kroków.
	<ol>
		<li>Dodaj 10 ml lodowatego, sterylnie przefiltrowanego 25% roztworu sacharozy (przygotowanego przez rozpuszczenie 25 g sacharozy w proszku w 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka) do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Powoli (3 ml/min) dodać 24 ml filtratu wirusa (otrzymanego z kroku 2.4.3.1) na wierzch warstwy sacharozy. Należy zwrócić uwagę na zachowanie oddzielnych warstw filtratu wirusa i roztworu sacharozy. 
		UWAGA: Do 10 ml roztworu sacharozy można dodać do 30 ml warstwy wirusa.</li>
		<li>Odwirowywać probówkę przez 90 minut w temperaturze 22 620 g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Usunąć warstwę sklaratyny i sacharozy ze stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Osadek wirusa powinien być białawy. Pobrać 50 μl podwielokrotności supernatantu i 50 μl podwielokrotności warstwy sacharozy do miareczkowania w sekcji 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 10% roztworze glicerolu/PBS.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml sterylnego 10% glicerolu (rozcieńczonego w PBS) do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby przykryć osad. 
		UWAGA: Ilość ponownie zawieszonej mieszaniny może się różnić (np. 0,8-1,2 ml) w zależności od wielkości granulki. Mniejsza objętość dałaby wyższe stężenie wirusa.</li>
		<li>Umieść stożkową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na lodzie na 2-4 godziny. W tym okresie należy sonicate/wirtex granulki co 15 minut przez 30 sekund, aby pomóc w usunięciu/ponownym zawieszeniu granulki.</li>
		<li>Zbierz ponownie zawieszony osad (1 ml 10% glicerolu/PBS + wielkość granulki zwiększy całkowitą objętość do ~1,3 ml) w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. [Opcjonalnie: Dodaj kolejne 0,3 ml 10% glicerolu/PBS do tej samej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, aby zebrać pozostałą śladową ilość osadu, pipetować w górę iw dół i połączyć z ponownie zawieszonym osadem w kroku 2.6.3, aby uzyskać całkowitą objętość do ~1,6 ml.]
		<ol>
			<li>Jeżeli zawiesina w kroku 2.6.3 jest mętna lub mętna (z powodu resztek komórek), odwirować probówkę o masie 500 g przez 10 minut, przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i przejść do etapu 2.6.4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pobrać porcję 50 μl do miareczkowania oHSV w sekcji 3. Resztę roztworu (250 μl/podwielokrotność) przelać do sterylnych probówek do mikrowirówek z nakrętkami (dobrze zamkniętymi do długotrwałego przechowywania), zamknąć i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia (gotowe do badań eksperymentalnych po ustaleniu miana oHSV). 
		UWAGA: Wszystkie materiały, które mają kontakt z wirusem, muszą zostać wybielone lub poddane działaniu promieniowania ultrafioletowego przed wyjęciem z okapu lub utylizacją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Miareczkowanie oHSV i test płytki nazębnej
<ol>
	<li>Nasiona 1,7-1,8 x 105 komórek Vero/basenik w 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w pożywce z komórek Vero (DMEM z 10% IFCS; patrz krok 1.1). 
	UWAGA: Upewnij się, że komórki są jednorodnie rozmieszczone w całej studzience; Nie obracaj płytki, ponieważ może to spowodować gromadzenie się komórek w środku studzienek. Aby zapobiec wirowaniu, powoli kołysz płytką ręcznie w pionie, następnie w poziomie, a następnie delikatnie umieść płytkę w inkubatorze.</li>
	<li>Następnego dnia (gdy komórki osiągną 70-80% zbieżności), odessać pożywkę hodowlaną i dodać 1 ml / studzienkę PBS o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 1% IFCS. Pozostawić płytkę w kapturze do hodowli komórkowej do czasu zakończenia kroku 3.3.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć wirusa w probówkach polipropylenowych o pojemności 5 ml przy użyciu PBS/1% IFCS (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3). 
	UWAGA: Do rozcieńczania szeregowego użyć 50 μl podwielokrotności zebranej w kroku 2.6.4. Dopierwszej probówki (rozcieńczenie 10-3) dodać 2 μl wirusa w 1998 r. μL PBS/1% IFCS, wir. Do 2. probówki (rozcieńczenie 10-5) pobrać 10 μl z 1. probówki w 990 μl PBS/1% IFCS, wirować. Wtrzeciej probówce (rozcieńczenie 10-6) pobrać 100 μl zdrugiej probówki w 900 μl PBS/1% IFCS, wir; Kontynuować to 10-krotne seryjne rozcieńczanie aż do rozcieńczenia 10-9. Zobacz szczegóły w Rysunek 3.</li>
	<li>Odessać PBS/1% IFCS i dodać 0,7 ml/studzienkę seryjnie rozcieńczonego wirusa (zaczynając od 10-5 do 10-9) do komórek Vero. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby komórki wyschły.</li>
	<li>Delikatnie kołysz płytką na kołysku przez 5 minut w temperaturze pokojowej (aby zapewnić równomierne rozprowadzenie inokulum wirusa).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Podczas tego okresu inkubacji należy przygotować rozcieńczenie ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) w stosunku 1:1000 w DMEM uzupełnione 1% IFCS. W przypadku płytki 6-dołkowej przygotuj 12,5 ml tak, aby można było użyć 2 ml / dołek w kroku 3.7. Dostosuj rozcieńczenie, aby uwzględnić zmiany partii w ludzkiej IgG.</li>
	<li>Usunąć inokulum wirusa z dołków i dodać 2 ml / studzienkę 0,1% ludzkiej IgG (w celu zneutralizowania oHSV w pożywce hodowlanej i zapobieżenia tworzeniu się wtórnych blaszek) w DMEM uzupełnionym 1% IFCS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 3-4 dni. 
	UWAGA: Przezroczyste blaszki nazębne tworzą się zwykle w ciągu 3 dni.</li>
	<li>Mocowanie i barwienie płyt
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant i umieścić komórki w czystym metanolu (1 ml/studzienkę) na 5 minut. Usunąć metanol i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Rozcieńczyć barwnik Giemsa (1:5) wodą dejonizowaną i dodać 1 ml rozcieńczonej plamy Giemsa do studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.</li>
		<li>Usuń plamę, spłucz wodą z kranu i pozostaw płytki do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Policz blaszki za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
		<li>Opcjonalnie dla oHSV z wyrażeniem lacZ:
		<ol>
			<li>Usuń supernatant i utrwal komórki zimnym 0,2% aldehydem glutarowym/2% paraformaldehydem przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Usuń roztwór utrwalający i przemyj komórki 3x PBS.</li>
			<li>Dodać roztwór X-gal do komórek (1 ml/basenik) i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny 
			UWAGA: Plama X-gal powinna być przygotowana na świeżo w dniu barwienia; Długotrwałe przechowywanie może prowadzić do blaknięcia koloru. Patrz przygotowanie roztworu X-gal w Tabeli 1.</li>
			<li>Usuń plamę X-gal i umyj płytkę wodą z kranu przez 1 minutę.</li>
			<li>Przeciwbarwienie roztworem czerwieni neutralnej (1 ml / studzienkę) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Patrz przygotowanie roztworu czerwieni obojętnej w Tabeli 1.</li>
			<li>Myj talerz wodą z kranu przez 1 minutę; pozostaw talerze do wyschnięcia na powietrzu.</li>
			<li>Policz niebieskie blaszki za pomocą mikroskopu preparacyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz miano za pomocą wzoru (2) 
	Miano w pfu/ml (jednostki tworzące blaszkę miażdżycową) = liczba blaszek/0,7 ml × współczynnik rozcieńczenia (2) 
	UWAGA: Na przykład, jeśli w studzience do rozcieńczenia 10-9 znajduje się 25 blaszek, miano wynosi 25/0,7 × 109 = 35,7 × 109 = 3,57 × 1010 pfu/ml. Jest to końcowe miano podwielokrotności oHSV przygotowane w kroku 2.6.4.</li>
</ol>

<ol><li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses%3A+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li>
<li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+herpes+viruses+as+oncolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).</li>
<li>Nguyen, H. -M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virotherapy%22%5BJournal%5D)">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li>
<li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside%3A+an+overview+of+current+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514(2020).</li>
<li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy%3A+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).</li>
<li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400(2020).</li>
<li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+growth%2C+preparation%2C+and+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407(2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li>
<li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li>
<li>Herpes simplex virus: methods and protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).</li>
<li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+trial+to+prepared+%CE%B31+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Review+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li>
<li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-Flop+HSV-BAC%3A+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40(2006).</li>
<li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li>
<li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).</li>
<li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li>
<li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li>
<li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li>
<li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224(2013).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel%2C+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).</li>
<li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li>
<li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).</li>
</ol>

SDR jest współwynalazcą patentów związanych z onkolityczną wirusem opryszczki pospolitej, będących własnością i zarządzanych przez Uniwersytet Georgetown i Massachusetts General Hospital, które otrzymały tantiemy od Amgen i ActiVec Inc. i jest członkiem Naukowej Rady Doradczej EG 427. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół rozpoczyna się od wzrostu oHSV w komórkach Vero o niskim pasażu. Zbieganie się monowarstwy komórek Vero powinno wynosić ~ 80% w momencie inokulacji wirusa, ponieważ przerośnięte komórki mogą rozwijać ciasne struktury włókniste, które mogą zmniejszyć wnikanie oHSV do komórek Vero20. Po zaobserwowaniu 90-100% CPE, supernatant hodowli jest usuwany, komórki są zbierane, ponownie zawieszane w VB/supernatantze (patrz krok 1.4.6), zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w c...

Wirusy onkolityczne (OV) są nową i unikalną formą immunoterapii nowotworów. OV selektywnie replikują się w komórkach nowotworowych i poddają je lizie (oszczędzając normalne/zdrowe komórki)1, jednocześnie indukując odporność przeciwnowotworową2. Onkolityczny wirus opryszczki pospolitej (oHSV) jest jednym z najszerzej przebadanych wirusów spośród wszystkich OV. Jest najdalej posunięty w klinice, a Talimogene laherparepvec (T-VEC) jest pierwszym i jedynym OV, który otrzymał zgodę FDA w USA na leczenie zaawansowanego czerniaka3. Oprócz T-VEC, wiele innych genetycznie modyfikowanych oHSV jest testowanych przedklinicznie i klinicznie w różnych typach raka3,4,5,6,7,8. Obecna zaawansowana biotechnologia rekombinacji DNA jeszcze bardziej zwiększyła możliwości opracowania nowych kodów oHSV dla terapeutycznych transgenów3,5. Skuteczny system namnażania, oczyszczania i oznaczania miana oHSV ma kluczowe znaczenie, zanim jakikolwiek (nowo opracowany) oHSV będzie mógł zostać przetestowany do badań in vitro i in vivo. W tym artykule opisano prostą metodę krok po kroku wzrostu oHSV (w komórkach Vero), oczyszczania (metodą gradientu sacharozy) i miareczkowania (za pomocą testu płytki oHSV w komórkach Vero) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Można go łatwo zastosować w dowolnym środowisku laboratoryjnym o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) w celu uzyskania wysokiej jakości zapasów wirusa do badań przedklinicznych.
Vero, linia komórkowa nerki afrykańskiej zielonej małpy, jest najczęściej używaną linią komórkową do rozmnażania oHSV9,10,11,12,13 ponieważ komórki Vero mają wadliwy szlak sygnałowy interferonu przeciwwirusowego14. Inne linie komórkowe z inaktywowanym stymulatorem sygnalizacji genów interferonu (STING) mogą być również wykorzystywane do wzrostu oHSV 12,13. Protokół ten wykorzystuje komórki Vero do wzrostu oHSV i testu płytki nazębnej. Po namnażaniu komórki zakażone oHSV są zbierane, poddawane lizie i poddawane oczyszczaniu, w którym lizowane komórki są najpierw traktowane nukleazą benzonazy w celu degradacji DNA komórki gospodarza, zapobieżenia agregacji kwasu nukleinowego i białka i zmniejszenia lepkości lizatu komórkowego. Ponieważ prawidłowa aktywacja benzonazy często wymaga Mg2+, w tym protokole stosuje się 1-2 mM MgCl2 15. Szczątki komórek gospodarza z lizatu komórkowego poddanego działaniu benzonazy są dalej eliminowane przez filtrację seryjną przed wirowaniem z dużą prędkością w gradieniu sacharozy. Lepka poduszka z 25% roztworem sacharozy pomaga zapewnić wolniejsze tempo migracji wirusa przez warstwę sacharozy, pozostawiając składniki związane z komórkami gospodarza w supernatancie, poprawiając w ten sposób oczyszczanie i ograniczając utratę wirusa w granulce16. Oczyszczony oHSV jest następnie miareczkowany na komórkach Vero, a blaszki wirusowe są wizualizowane za pomocą barwienia Giemsa17 lub barwienia X-gal (dla oHSV kodujących LacZ)18.

<table><tbody><tr><td>Probówki wirówkowe 1,7 ml</td><td>Sigma</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polipropylenowe probówki</td> wirówkowe <td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki polipropylenowe</td><td>Falcon</td><td>352063</td> 50 ml polipropylenowe probówki Falcon 352098 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza Nukleaza</td><td>Sigma</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyklon</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Corning</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy" s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka immunoglobulina</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td> Filtr do sterylizacji mediów <td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>, 250 ml</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Filtr do sterylizacji mediów, 500 ml</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>Neutralny czerwony roztwór</td><td>Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher scientific</td><td>&nbsp; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>Wahacz płytowy</td><td>Fisher</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall ST 16R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R Wirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>sterylne probówki do mikrowirówek z nakrętkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 0,45 PVDF</td><td>MilliporeFiltr</td> strzykawkowy Sigma <td>SLHV033RS</td><td></td></tr>, <tr><td>0,8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy, 5 i mikro; m PVDF</td><td>MilliporeKolba hodowlana Sigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa kąpiel wodna</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

Wirusy onkolityczne (OV), takie jak onkolityczny wirus opryszczki pospolitej (oHSV), są szybko rozwijającą się strategią leczenia w dziedzinie immunoterapii nowotworów. OV, w tym oHSV, selektywnie replikują się i zabijają komórki rakowe (oszczędzając zdrowe/normalne komórki), jednocześnie indukując odporność przeciwnowotworową. Ze względu na te unikalne właściwości, strategie leczenia oparte na oHSV są coraz częściej stosowane w leczeniu raka, przedklinicznie i klinicznie, w tym zatwierdzony przez FDA talimogene laherparevec (T-Vec). Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie to trzy podstawowe techniki laboratoryjne dla wszystkich OV, w tym oHSV, zanim będą mogły zostać wykorzystane do badań eksperymentalnych. W tym artykule opisano prostą metodę amplifikacji oHSV krok po kroku w komórkach Vero. Gdy oHSV się namnażają, wywołują efekt cytopatyczny (CPE) w komórkach Vero. Gdy 90-100% zakażonych komórek wykazuje CPE, są one delikatnie zbierane, traktowane benzonazą i chlorkiem magnezu (MgCl2), filtrowane i poddawane oczyszczaniu metodą gradientu sacharozy. Po oczyszczeniu liczbę zakaźnych oHSV (oznaczonych jako jednostki tworzące płytki nazębne lub PFU) określa się za pomocą "testu płytkiowego" w komórkach Vero. Protokół opisany w niniejszym dokumencie może być wykorzystany do przygotowania materiału wyjściowego oHSV o wysokim mianie do badań in vitro w hodowlach komórkowych i doświadczeń in vivo na zwierzętach.

Krótki przegląd całego protokołu przedstawiono na Ryc. 1, która obrazuje krytyczne etapy wzrostu, oczyszczania i miareczkowania oHSV. Efekt cytopatyczny (CPE) w komórkach Vero można wykryć już 4 h po infekcji HSV19. Ryc. 2 pokazuje CPE w komórkach Vero w trzech różnych punktach czasowych po infekcji oHSV. Stopień CPE wzrasta wraz z upływem czasu. W niniejszym protokole CPE na poziomie 90-100% obserwuje się zazwyczaj w ciągu 48 h od inokul...

W tym manuskrypcie opisujemy prostą metodę wzrostu, oczyszczania i miareczkowania onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej do użytku przedklinicznego.

Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

Onkolityczny wirus opryszczki pospolitej jest nową formą immunoterapii nowotworów. Wydajny system namnażania wirusa, oczyszczania i oznaczania miareczkowego ma kluczowe znaczenie dla zastosowania w badaniach eksperymentalnych. Metoda ta jest bardzo prosta i może być łatwo zastosowana w każdym laboratorium na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, aby otrzymać wysokiej jakości materiał wirusowy do badań przedklinicznych.Produkcja wysokiej jakości, czystego materiału wirusowego ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest on wykorzystywany do badania przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej i opracowywania nowej formy immunoterapii nowotworów opartej na wirusach. Protokół ten może być stosowany do oczyszczania dowolnego wirusa opryszczki pospolitej typu dzikiego lub genetycznie modyfikowanego. Protokół ten powinien być łatwy do odczytania i przestrzegania dla osoby, która nigdy wcześniej nie wykonywała tej techniki.Wymienione materiały i odczynniki powinny być na miejscu przed wypróbowaniem tej techniki po raz pierwszy. Zacznij od umycia kolb T-150 o centymetrach kwadratowych dwukrotnie wyższym DPBS o wysokiej glukozie uzupełnionym 1% IFCS. Odessać DPBS i dodać siedem mililitrów inokulum wirusa do kolby.Delikatnie kołysać kolbami przez pięć minut i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 do 2 godzin. Następnie usunąć inokulum i dodać 25 mililitrów DMEM uzupełnionego 1% IFCS do każdej kolby. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa do czterech dni, zebrać 20 mililitrów supernatantu z każdej kolby do 50-mililitrowych probówek wirówkowych.Za pomocą skrobaka do komórek zeskrobać komórki z dna kolb. Dodać około 15 mililitrów wcześniej zebranego supernatantu hodowlanego do każdej kolby, aby zwiększyć objętość do 20 mililitrów, a następnie użyć sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów, aby delikatnie przemyć dno kolb kilka razy. Zebrać komórki z pożywką do 50-mililitrowych stożkowych probówek wirówkowych umieszczonych na lodzie.Odwirować probówki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dokładnie zawiesić każdą osadkę w 1,25 mililitra buforu wirusa lub VB i 1,25 mililitra wcześniej zebranego supernatantu hodowlanego. Wymieszaj wszystkie zawieszone granulki w jednej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów.Zamroź zawieszone komórki za pomocą suchego lodu i 100% etanolu i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Rozmrozić wcześniej zamrożone komórki w ciepłej łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i poddać sonikacji przez jedną minutę przez trzy cykle w łaźni wodnej. Dodaj 175 jednostek nukleazy benzonazy i dwa mikrolitry dwumilimolowego chlorku magnezu na mililitr lizatu komórkowego i wiru.Po 30 minutowej inkubacji i ciepłej kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza umieść probówkę na lodzie. Wiruj lizat komórkowy 300 razy G przez 10 minut. Zebrać supernatant w nowej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach VB. Oznacz go jako granulkę pierwszą.Ponownie odwirować zebrany supernatant w temperaturze 500 razy G przez 10 minut i przechowywać supernatant oddzielnie w świeżej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów do późniejszego wykorzystania. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach VB, oznaczając go jako pastylkę drugą. Połącz ponownie zawieszony osad jeden i osad drugi w nowej 1,75 mililitrowej probówce wirówkowej i wiruj i dwukrotnie sonikuj w łaźni wodnej przed wirowaniem probówek pod ciśnieniem 400 razy G przez 10 minut.Zebrać supernatant z 1,7 mililitrowej probówki wirówkowej i połączyć go z wcześniej zebranym supernatantem 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Przefiltruj supernatant przez sterylny filtr membranowy PVDF o grubości pięciu mikrometrów do nowej 50-mililitrowej probówki wirówkowej zwanej probówką pierwszą. Dodaj jeden mililitr VB do 50-mililitrowej probówki wirówkowej, opróżnionej po przefiltrowaniu supernatantu z poprzedniego etapu, wiru, i przepuść go przez ten sam filtr membranowy PVDF umieszczony na pierwszej probówce.Przepuścić filtrat z pierwszej probówki przez sterylny filtr membranowy MCE o średnicy 0,8 mikrometra umieszczony na nowej 50-mililitrowej probówce wirówkowej zwanej probówką drugą. Dodaj jeden mililitr VB do opróżnionej probówki pierwszej, wiru, i przepuść ją przez ten sam filtr MCE, który znajduje się na probówce drugiej. Przepuścić filtrat z probówki drugiej przez sterylny filtr PVDF o średnicy 0,45 mikrometra umieszczony na nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów, oznaczonej probówką trzecią.Jak opisano wcześniej, powtórzyć mycie probówki drugiej jednym mililitrem VB, aby dodać filtrat do probówki trzeciej. W tej reprezentatywnej analizie efekt cytopatyczny można było zaobserwować w komórkach Vero po 36, 48 i 72 godzinach od zakażenia oHSV z zaokrągleniem dotkniętych komórek. Rosnący poziom CPE w czasie jest widoczny, co widać za pomocą ekspresji mCherry.Po 72 godzinach od zakażenia blaszki wirusowe wybarwiono X-gal w celu uwidocznienia oHSV z ekspresją lacZ. Delikatne szorowanie komórek zakażonych wirusem i delikatne mycie dna kolby ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wszystkich komórek zakażonych HSV w stanie nienaruszonym, tak aby można było uzyskać zapas wirusa o wysokim mianie.

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Wirusy onkolityczne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu nowotworów. Zdolność do oceny podatności na zakażenie żywych próbek tkanek pobranych od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia jest unikalną zaletą tego podejścia terapeutycznego. Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania tkanek do zakażenia ex vivo wirusem onkolitycznym oraz późniejszą kwantyfikację wirusa.

Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Protokół opisuje wydajny i powtarzalny system modelowy do badania latencji i reaktywacji wirusa prostego opryszczki typu 1 (HSV-1). Test wykorzystuje homogeniczne kultury neuronów współczulnych i umożliwia molekularną analizę oddziaływań wirus-neuron przy użyciu różnych narzędzi, w tym interferencji RNA oraz ekspresji białek rekombinowanych.

System hodowli pierwotnych neuronów do badania latencji i reaktywacji wirusa opryszczki zwykłej

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Plaquing to rutynowa metoda używana do ilościowego oznaczania żywych wirusów w populacji. Chociaż plaqueing jest często nauczany w różnych programach nauczania mikrobiologii z bakteriami i bakteriofagami, plaqueing wirusów ssaków jest bardziej złożony i czasochłonny. Protokół ten opisuje procedury, które działają niezawodnie w przypadku regularnej pracy z wirusami opryszczki pospolitej.

Plaquing wirusów opryszczki pospolitej

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj metodę wzrostu, oczyszczania i miareczkowania onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej do badań przedklinicznych w warunkach bezpieczeństwa biologicznego poziomu drugiego. Protokół umożliwia uzyskanie wysokiej jakości zapasu wirusowego.

Wzrost, oczyszczanie i miareczkowanie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej

Przeglądaj więcej filmów