Krystalizacja hydratu metanu na siedzących kropelkach wody
26 maja 2021
Opisujemy metodę tworzenia hydratu gazu na kropelkach wody siedzącej, aby zbadać wpływ różnych inhibitorów, promotorów i substratów na morfologię kryształu hydratu.
Można badać wpływ różnych dodatków na morfologię hydratów gazu i stabilność ciśnienia i temperatury. Jednak głównym celem jest ustalenie, w jaki sposób biomolekuły mogą oddziaływać i wpływać na hydraty gazu in situ. Główną zaletą tego protokołu jest to, że można w sposób powtarzalny bezpiecznie utworzyć otoczkę hydratu na siedzącej kropli.
Wyrównanie etapu kropli jest trudne i wymaga praktyki, ponieważ kropla ślizga się po nierównym scenie. Zapoznaj się również z połączeniami Swagelok i bezpieczeństwem dotyczącym gazów palnych pod wysokim ciśnieniem. Zacznij od podłączenia regulatora butli metanu do pompy za pomocą miedzianej rurki o wymiarach jeden na cztery cale za pomocą nowego zestawu nakrętek i tulejek.
Przyklej elastyczną końcówkę rurki dożylnej, przyciąć pod kątem do końca kaniuli, aby skierować kroplę w kierunku szafirowego okienka. Podłącz strzykawkę o pojemności jednego mililitra do kaniuli i wciągnij żądaną objętość wody dejonizowanej. Bez dołączonego zaworu igłowego lub szafirowego okienka włóż koniec kaniuli do górnej płyty i poćwicz wyrzucanie kropli na środek sceny.
Ponownie przymocuj szafirowe okno i podkładki za pomocą M8 i zamocuj górny zawór komory ciśnieniowej. Podłącz pleciony wąż ze stali nierdzewnej od pompy ciśnieniowej do komory ciśnieniowej. I dokładnie sprawdź, czy wszystkie połączenia od butli gazowej do komory ciśnieniowej są szczelne.
Otwórz zawór wlotowy komory ciśnieniowej i ustaw komorę ciśnieniową w akwarium. Następnie włóż światłowodowego źródła światła do portu oświetlenia komory ciśnieniowej. W akwarium wypełnionym etanolem i wodą w proporcji 50/50 dodaj więcej etanolu, gdy poziom roztworu spadnie w kolejnych tygodniach, aż znajdzie się na poziomie górnej części ogniwa ciśnieniowego, tuż poniżej połączenia źródła światła.
Ustaw agregat chłodniczy na temperaturę, która osiągnie około 0 do trzech stopni Celsjusza wewnątrz ogniwa i zacznij krążyć przez cewki. Włącz przepływ powietrza do przodu akwarium, aby zapobiec kondensacji na powierzchni akwarium. Uruchom dziennik temperatury w oprogramowaniu rejestratora danych.
Ustaw interwał skanowania na 30 sekund i poczekaj, aż temperatura wewnątrz celi ciśnieniowej ustabilizuje się na poziomie dwóch stopni Celsjusza. Po umieszczeniu aparatu włącz źródło światła na około 80% i otwórz oprogramowanie aparatu. W trybie Live View ustaw ostrość obiektywu kamery na wewnętrznej komorze komórki i dostosuj źródło światła, aby uzyskać najlepsze obrazowanie.
Rozpocznij nowy dziennik temperatury z jednosekundowym interwałem skanowania. Jeśli jest podłączony, odłącz wylotowy zawór iglicowy w górnym porcie komory ciśnieniowej. Podłącz strzykawkę o pojemności jednego mililitra do kaniuli i wciągnij żądaną objętość wody dejonizowanej.
Włóż kaniulę przez górną płytę, aż końcówka będzie widoczna w oprogramowaniu aparatu w trybie Live View. Usunąć kroplę płynu ze strzykawki przez centralną termoparę. Następnie ponownie zamocuj zawór iglicowy.
Ustaw ostrość kamery na kropli w komorze ciśnieniowej. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe co 60 sekund. Otwórz oprogramowanie przetwornika ciśnienia na laptopie.
Rozpocznij zbieranie danych na wykresie i dzienniku danych w interwale skanowania wynoszącym jedną sekundę i poczekaj, aż temperatura kropli ustabilizuje się w zakresie od zera do trzech stopni Celsjusza. Włącz pompę i sterownik. Zamknij zawór wlotowy pompy ciśnieniowej.
Otwórz zawór wylotowy pompy i zawory komory ciśnieniowej. Zmierz ciśnienie pompy, naciskając zero na sterowniku pompy ciśnieniowej. Wybierz Pompę A na sterowniku pompy ciśnieniowej, aby monitorować ciśnienie.
Upewnij się, że pompa ciśnieniowa jest pusta, jeśli w pompie znajdował się inny płyn niż metan. Zrób to, ustawiając maksymalny przepływ i stały przepływ na 100 mililitrów na minutę i naciskając Uruchom. Pozostaw go włączonego, aż pompa będzie pusta.
Zamknij zawór wylotowy pompy i otwórz zawór wlotowy pompy. Otwórz butlę z gazem i ustaw regulator butli gazowej na 1 000 kilopaskalów. Naciśnij przycisk Refill na sterowniku pompy ciśnieniowej.
Gdy pompa jest pełna i zbliża się do 1 000 kilopaskalów, zamknij zawór wlotowy pompy i butlę z gazem. Lekko otwórz zawór wylotowy pompy do ogniwa. Monitoruj ciśnienie w komorze ciśnieniowej w oprogramowaniu przetwornika ciśnienia, ponieważ może ono spaść ze względu na stosunkowo niższą temperaturę w komorze ciśnieniowej.
Ustaw maksymalny przepływ na 10 mililitrów na minutę, maksymalne ciśnienie na 5 000 kilopaskali i stałe ciśnienie na 1 000 kilopaskali na sterowniku pompy ciśnieniowej zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Naciśnij przycisk Uruchom. Po osiągnięciu 1 000 kilopaskali naciśnij Stop na sterowniku pompy i zamknij zawór wylotowy pompy.
Monitoruj ciśnienie w komorze ciśnieniowej, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Jeśli ciśnienie spadnie, użyj detektora nieszczelności cieczy, aby znaleźć nieszczelność na połączeniach i ostrożnie dokręć nieszczelne elementy. Jeśli ogniwo jest stabilne, otwórz wylot pompy i stopniowo ustawiaj stałe ciśnienie na 2 000, 3 000, 4 000 i 5 000 kilopaskalów, monitorując stabilność ogniwa, naciskając Stop po każdym ustawieniu.
Jeśli ciśnienie jest stabilne, zamknij wylot pompy i poczekaj około 12 do 24 godzin, aż gaz przeniknie do kropli. Przełącz tryb poklatkowy, aby robić zdjęcia co dwie do pięciu sekund. Dodaj suchy lód do górnej części komórki, aż otoczka hydratu będzie widoczna w upływie czasu.
Jeśli suchy lód ślizga się, przyklej taśmę wokół górnej części ogniwa. Obserwuj postęp powstawania hydratu metanu na zdjęciach poklatkowych przez dwie do sześciu godzin. Rozhermetyzuj ogniwo do 2 000 kilopaskali poprzez otwarcie wylotu pompy i ustawienie stałego ciśnienia na 2 000 kilopaskal, zwracając uwagę, kiedy następuje topnienie.
Po 30 minutach zwiększ ciśnienie w komórce ciśnieniowej do 5 000 kilopaskali , aby zaobserwować efekt pamięci. Zwróć uwagę, kiedy otoczka hydratu zaczyna się odbudowywać i pozwól jej się uformować przez 30 minut do dwóch godzin. Rozhermetyzuj ogniwo, otwierając wylot pompy i ustawiając stałe ciśnienie na 100 kilopaskalów.
Jeśli w komorze ciśnieniowej występuje ciśnienie resztkowe, lekko otwórz górny zawór komory ciśnieniowej o 1/16 cala. Zapisz dane dotyczące ciśnienia i temperatury jako pliki CSV. Usuń kroplę, wyjmując górny zawór komory ciśnieniowej i usuwając kroplę za pomocą strzykawki, kaniuli lub rurki dożylnej.
Postępuj zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie, jeśli istnieje obawa o zanieczyszczenie między badaniami. Istnieje wyraźna różnica morfologiczna w przypadku tworzenia się skorupy wymuszonej przez suchy lód, w której kropla wody przeszła z gładkiej powierzchni odbijającej światło do nieprzezroczystej powłoki hydratycznej z lekką powierzchnią dendrytyczną. Dodanie 100 mikrogramów na mililitr białek przeciw zamarzaniu typu pierwszego zmieniło morfologię hydratu poprzez wywołanie prążkowanych krawędzi wzdłuż kropli i wypukłości od górnej części kropli.
Po tym, jak otoczka hydratu rozwijała się przez godzinę, komórka została rozhermetyzowana do dwóch megapaskal, co doprowadziło do spadku temperatury o 2 do 5 stopni Celsjusza w pobliżu krzywej stabilności P/T. Ze względu na egzotermiczną dysocjację hydratów, dysocjacja hydratów została potwierdzona przez wizualne stopienie za pomocą obrazowania poklatkowego na początku spadku temperatury. Kontrole ujemne bez kropli i z kroplą, która nie tworzyła otoczki hydratowej, nie wykazały spadku temperatury podczas rozhermetyzowania.
Ponieważ wierzchołek każdego stopnia temperatury znajdował się powyżej wcześniej ustalonej krzywej stabilności P/T, krzywa regresji została obliczona na podstawie wierzchołka P/T tych prób. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać o dwóch rzeczach. Po pierwsze, sprawdź, czy wszystkie połączenia są bezpieczne przed zwiększeniem ciśnienia, a po drugie, przećwicz usuwanie kropli przed przymocowaniem szafirowego okienka.
Postępując zgodnie z tym protokołem, można obliczyć zużycie gazu, a także przeanalizować obrazy w celu obliczenia grubości powłoki hydratu, aby określić objętość utworzonego hydratu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano metodę tworzenia hydratów gazu na osiadłych kroplach wody w celu zbadania wpływu różnych inhibitorów, promotorów i podłoży na morfologię kryształów hydratu. Protokół ten umożliwia powtarzalne tworzenie powłok hydratowych, co ułatwia badanie oddziaływań biomolekularnych z hydratami gazu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hydraty gazów
- Interakcje biomolekularne
- Morfologia kryształów
Wprowadzenie
- Hydraty gazów są stałymi strukturami krystalicznymi powstałymi z gazu i wody.
- Zrozumienie ich morfologii jest kluczowe dla zastosowań w energetyce i naukach o środowisku.
- Biomolekuły mogą wpływać na tworzenie się i stabilność hydratów gazów.
- Powtarzalność eksperymentów jest niezbędna dla uzyskania wiarygodnych wyników.
Cel badania
- Zbadanie wpływu różnych dodatków na morfologię hydratów gazów.
- Ocena stabilności hydratów gazów w różnych warunkach ciśnienia i temperatury.
- Zbadanie interakcji biomolekuł z hydratami gazów in situ.
Zastosowane metody
- Tworzenie powłok hydratowych na kroplach osiadłych.
- Badanie wpływu inhibitorów i promotorów.
- Korzystanie z systemów gazowych wysokiego ciśnienia z zachowaniem protokołów bezpieczeństwa.
- Zapoznanie się z oprzyrządowaniem, takim jak połączenia Swagelok.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na kontrolowane tworzenie powłok hydratowych.
- Różne dodatki wykazują zróżnicowany wpływ na morfologię hydratów.
- Stabilność pod wpływem ciśnienia i temperatury może być systematycznie oceniana.
- Oddziaływania biomolekularne mogą być skutecznie badane in situ.
Wnioski
- Niniejszy protokół zapewnia niezawodny sposób badania hydratów gazów.
- Zrozumienie wpływu dodatków może prowadzić do lepszej kontroli procesu tworzenia hydratów.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat oddziaływań biomolekularnych z hydratami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia kontrolowane tworzenie powłok hydratu metanu na osiadłych kroplach wody w celu badania oddziaływań biomolekularnych z hydratami gazu w określonych warunkach ciśnienia i temperatury. Wspiera ona ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych fazach odkryć, umożliwiając systematyczną ocenę wpływu dodatków na morfologię i stabilność hydratów. Podejście to stanowi odtwarzalną platformę do walidacji celów w badaniach biofarmaceutycznych związanych z energetyką, w których tworzenie hydratów gazu wpływa na stabilność formulacji lub systemy dostarczania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu biomolekuł, takich jak białka przeciwzamrożeniowe, na morfologię kryształów hydratów, co wspiera testowanie postawionych hipotez.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany protokół odtwarzalnego tworzenia powłok hydratowych na kroplach osiadłych, co zmniejsza zmienność w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościową ocenę tworzenia się i dysocjacji powłoki hydratowej poprzez monitorowanie temperatury i ciśnienia w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analizy, umożliwiając wizualizację i fotografowanie zmian morfologicznych podczas tworzenia się hydratów i dekompresji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia badanie „efektu pamięci” podczas ponownego tworzenia się hydratów, co jest istotne dla zrozumienia histerezy w systemach biomolekularnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia testowanie różnych dodatków i substratów pod kątem morfologii hydratów, wspierając translacyjne dopasowanie biomarkerów w nauce o formulacjach.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowe etapy procesów badawczych, w których zrozumienie oddziaływań między hydratami gazu a biomolekułami pozwala na podejmowanie decyzji uwzględniających ryzyko w zakresie opracowywania formulacji i testów stabilności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań biomolekuł z hidratami gazu in situ, wyjaśniając ścieżki mechanistyczne.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów poprzez kontrolowane tworzenie powłoki hydratowej oraz monitorowanie stabilności P/T w czasie rzeczywistym.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym spadków temperatury podczas dekompresji oraz obliczeń grubości powłoki hydratowej na podstawie obrazowania poklatkowego.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną, umożliwiając ocenę wpływu dodatków na kinetykę tworzenia i morfologię hidratów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Układ komory ciśnieniowej może być ponownie wykorzystywany w wielu próbach do testowania różnych warunków, co wspiera skalowalne zastosowania w obszarze B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Umożliwia wiarygodne przewidywanie zachowania hydratów poprzez powiązanie obecności biomolekuł ze zmianami morfologicznymi i sygnaturami termicznymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom nanoszenia kropli, stopniowego zwiększania ciśnienia oraz kontroli temperatury.
- Wartość strategiczna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w oddziaływaniach między hydratami a biomolekułami, wspierając lepsze decyzje typu go/no-go w projektach formulacyjnych.
- Wpływ na portfolio: Pozwala na priorytetyzację dodatków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich wpływ na morfologię i stabilność hydratów w określonych warunkach P/T.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obsługi gazów pod wysokim ciśnieniem oraz bezpiecznego stosowania połączeń Swagelok.
- Niezbędna jest aparatura, w tym pompy ciśnieniowe, przetworniki, chłodnice oraz okna szafirowe do wizualizacji.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w protokołach wyrównywania kropli oraz obrazowania poklatkowego.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne podczas testowania różnych biomolekuł lub białek przeciwzamrożeniowych w określonych stężeniach.
- Ograniczeniem jest konieczność zapobiegania wyciekom i zapewnienia stabilności kropli na stole podczas cykli ciśnieniowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:40
Preparing the Equipment
2:22
Adding Water Droplet into the Pressure Cell Using Camera View on the Laptop
3:29
Pressurizing the Pressure Cell
6:56
Results: Representative Images of Methane Hydrate Shells and Analysis of Pressure-temperature Stability Diagram
8:08
Conclusion
