Name: Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metody oceny upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego przy użyciu C. elegans. Radial Locomotion Assay i Swimming Assay umożliwiają ilościową analizę ruchu i różnic między szczepami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy recenzentom za pomocne komentarze i sugestie. Dziękujemy Aleen Saxton, Brandonowi Hendersonowi i Jade Stair za wyjątkową pomoc techniczną. Dziękujemy Brianowi Kraemerowi i Rebecce Kow za pomoc w opracowaniu tych testów. Materiał ten jest wynikiem pracy wspartej zasobami i wykorzystaniem obiektów w systemie opieki zdrowotnej VA Puget Sound. Prace te zostały wsparte grantem ze Stanów Zjednoczonych (USA) Departament ds. Weteranów (VA) Laboratorium Biomedyczne Dział Badawczo-Rozwojowy [Grant na przegląd zasług #I01BX004044 dla N.F.L.]

<ol><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+Journal+of+Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet Journal of Rare Diseases. 4, 3(2009).</li>
<li>Arai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+a+component+of+ubiquitin-positive+tau-negative+inclusions+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 351 (3), 602-611 (2006).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitinated+TDP-43+in+frontotemporal+lobar+degeneration+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science. 314 (5796), 130-133 (2006).</li>
<li>Mejzini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+genetics%2C+mechanisms%2C+and+therapeutics%3A+Where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS genetics, mechanisms, and therapeutics: Where are we now.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1310(2019).</li>
<li>Tan, R. H., Ke, Y. D., Ittner, L. M., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS%2FFTLD%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">ALS/FTLD: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 177-196 (2017).</li>
<li>Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrthoList+2%3A+A+new+comparative+genomic+analysis+of+human+and+Caenorhabditis+elegans+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes.</a> Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transaction+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transaction of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models and Mechanisms. 13 (10), (2020).</li>
<li>Liachko, N. F., Guthrie, C. R., Kraemer, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+promotes+neurotoxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 30 (48), 16208-16219 (2010).</li>
<li>Robatzek, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+regulates+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+concert+with+a+G%28o%29%2FG%28q%29+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II regulates Caenorhabditis elegans locomotion in concert with a G(o)/G(q) signaling network.</a> Genetics. 156 (3), 1069-1082 (2000).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+track+of+worm+trackers%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2013).</li>
<li>Ringstad, N., Horvitz, B., Koelle, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRingstad%2C+N+%22WormBook%22">WormBook</a>. Hart, A. C. , 1551(2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie posiadają żadnych ujawnień.

Lokomocja radialna: Rozdzielczość tego testu można łatwo kontrolować, zmieniając zmienną czasową. Wydłużenie czasu ułatwia obserwację różnic między zwierzętami o ciężkich fenotypach, identyfikując w ten sposób subtelne różnice. Ponieważ jednak ten test mierzy przemieszczenie, jeśli czas testu zostanie zbyt długi, zwierzęta o normalnej ruchliwości, takie jak N2, będą przemieszczać się do krawędzi płytki, a zachowania związane z żerowaniem doprowadzą do cofnięcia się. Spowoduje to sztuczne zmniejszenie pomiaru przebytej odległości. Zbyt długie okresy czasowe mogą powodować zanik różnic między szczepami, szczególnie między zwierzętami o mniej poważnych fenotypach motorycznych, ponieważ zwierzęta stają się równomiernie rozproszone na płytce. Skrócenie zmiennej czasowej zapobiegnie znajdowaniu krawędzi płytki przez bardziej aktywne robaki. Ta metoda nie śledzi całkowitej odległości przebytej dla każdego robaka, ale kompresuje odległość przebytą dla każdego robaka do odległości liniowej od środka płytki. W związku z tym jest z natury mniej niezawodna niż metoda, która rejestruje całkowitą długość ścieżek poszczególnych robaków. Jednak test lokomocji promieniowej wymaga bardzo niewielkiego przeszkolenia badaczy, wykorzystuje stosunkowo niedrogie odczynniki, które są powszechnie dostępne w większości laboratoriów zajmujących się robakami, i jest wystarczająco czuły, aby uzyskać znaczące i powtarzalne wyniki. Dla laboratoriów, które preferują automatyczne śledzenie wideo, wcześniej opracowano kilka metod śledzenia i analizowania ruchów pełzania12 lub parametry oprogramowania używane do testu pływania w tym artykule można zmienić, aby umożliwić wykrywanie i analizę pełzania.
Eksperyment ten jest zwykle przeprowadzany w trzech niezależnych powtórzeniach, z zestawem 30-40 robaków na replikę. Każda replika jest dzielona na dwie różne płytki o średnicy 100 mm lub 150 mm, z 15-20 ślimakami na płytkę. Używanie większej liczby robaków niż jest to zalecane na talerz może utrudnić skuteczne nacięcie. Całkowita liczba uzyskana w wieku 90+ jest wystarczająco silna, aby ustalić znaczenie dla łagodnego, umiarkowanego lub ciężkiego upośledzenia motoryki. Zachowanie spójności w czasie między ocenianymi szczepami ma zasadnicze znaczenie dla dokładności i odtwarzalności. 30 minut to na ogół wystarczająco długo, aby ustalić różnice między umiarkowanymi i ciężkimi fenotypami, takimi jak szczepy transgeniczne eksprymujące ludzkiego mutanta TDP-43 w porównaniu z robakami typu dzikiego (ryc. 4). Jeśli zmienna czasowa ma zostać wydłużona, wskazane jest również zwiększenie rozmiaru tabliczki ze 100 mm do 150 mm. Czynniki środowiskowe, takie jak temperatura i wilgotność, mogą wpływać na ten test, który jest zwykle przeprowadzany w temperaturze pokojowej otoczenia, dlatego ważne jest, aby zawsze używać kontroli typu dzikiego (N2) podczas porównywania między powtórzeniami. Ponadto test ten może mierzyć ruchliwość niektórych szczepów, które nie wykazują normalnego zachowania podczas pływania w cieczy (młócenie), co czyni go użytecznym uzupełnieniem testu pływania.
Test pływacki: Wykorzystanie systemu obrazowania i akwizycji do automatyzacji śledzenia i analizy pływania robaków pozwala na uzyskanie rygorystycznych i bezstronnych danych. Jednak podczas początkowej konfiguracji eksperymentu istnieje kilka czynników, które muszą być kontrolowane między próbkami. Należą do nich czas przyzwyczajenia się do cieczy przed rozpoczęciem nagrywania, warunki otoczenia (tj. temperatura, wilgotność) oraz spójne ustawienia oświetlenia i nagrywania. Na etapie nagrywania dostępnych jest kilka funkcji, które pomagają zmniejszyć zmienność między płytami. Należą do nich zintegrowana kamera montowana na szynie i stolik z jasnym polem, który sprawia, że nagrywanie wideo jest spójne między płytami, osłona wokół stolika, która zapobiega odbiciom, odblaskom i ruchom powietrza podczas nagrywania, a także solidny pakiet oprogramowania, który niezawodnie wykrywa robaki i pozwala na ręczną korekcję ścieżek w post-processingu wideo. W tym protokole filmy z 35-milimetrową płytą z robakami są nagrywane przez 1 minutę, a następnie przetwarzane za pomocą pakietu oprogramowania. Po przetworzeniu ręczna korekta ścieżek zapewnia, że zachowania robaków są rejestrowane dokładnie bez mylących błędów śledzenia. Dane dotyczące liczby tur i czasu trwania toru są używane do określania zakrętów na minutę jako końcowego odczytu. Aby zapewnić odtwarzalność, dane są zbierane w co najmniej 3 niezależnych powtórzonych eksperymentach, z których każde obejmuje 40-50 zwierząt, aby uzyskać łączną końcową liczbę zwierząt 120-150. Liczba ta jest wystarczająca do odróżnienia niewielkich różnic w zachowaniu podczas pływania od robaków kontrolnych. Niektóre robaki mają deficyty motoryczne zbyt poważne, aby można je było uchwycić za pomocą testów pływackich. Na przykład, jeśli zwierzęta umieszczone w płynnym podłożu zwijają się zamiast wykonywać oczekiwaną reakcję młócenia, test ten nie zarejestruje dokładnie tych ruchów, a inny test ruchu, taki jak lokomocja promieniowa, może lepiej uchwycić te wady ruchliwości. Dostarczony protokół wykorzystuje dostępny na rynku system obrazowania (więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów ), ale inne systemy śledzenia robaków mogą zapewniać podobne narzędzie, a niektóre z nich są open source12. Wcześniej opublikowane metody opisują ręczną ocenę młócenia robaków13. Podczas gdy zautomatyzowana analiza generuje szereg wskaźników dla każdego pojedynczego robaka, wykrywanie zgięć ciała, które jest mierzone w uderzeniach na minutę, zapewnia spójne wyniki między eksperymentami i dobrze śledzi konwencjonalną ocenę młócenia robaków na oko.

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest wyniszczającą, związaną ze starzeniem się chorobą neurodegeneracyjną, która ma szczególny wpływ na neurony ruchowe. Choroba charakteryzuje się utratą neuronów ruchowych w mózgu i rdzeniu kręgowym oraz postępującym upośledzeniem motorycznym. Prowadzi to do poważnej niepełnosprawności funkcjonalnej i przedwczesnej śmierci, zwykle w ciągu 3-5 lat po diagnozie1. Mutacje w co najmniej 38 genach mogą powodować ALS; jednak większość pacjentów z ALS gromadzi wszechobecne inkluzje białka TDP-43 jako ich pierwotną patologię w neuronach i komórkach glejowych2,3,4. Opracowano szereg modeli zwierzęcych w celu zbadania mechanizmów leżących u podstaw powstawania lub przyczyniających się do ALS in vivo (recenzja w5). U C. elegans modele te obejmują genetyczne mutacje powodujące utratę funkcji w homologach genów powodujących ALS lub transgeniczną ekspresję ludzkich genów ALS. Modelowanie ALS u C. elegans ma wiele zalet. C. elegans to podatne, proste zwierzę o zróżnicowanym układzie nerwowym, dobrze scharakteryzowanych paradygmatach behawioralnych i znacznej homologii genetycznej do ludzi6,7. Istnieje wiele narzędzi do pracy z C. elegans, w tym solidne możliwości edycji genomu, fluorescencyjne reportery neurodegeneracji in vivo, paradygmaty badań przesiewowych RNAi, wykonalna genetyka oraz uznane testy behawioralne i fenotypowe. Modele ALS C. elegans podsumowują aspekty chorób ludzkich, w tym akumulację nierozpuszczalnego białka, neurodegenerację i wczesną śmierć8,9. Co więcej, dysfunkcja motoryczna charakteryzująca się zaburzeniami zarówno zachowań związanych z raczkowaniem, jak i pływaniem jest obecna w wielu modelach ALS C. elegans.
Ten protokół opisuje dwie metody charakteryzowania fenotypów motorycznych C. elegans: test lokomocji radialnej do oceny pełzania po twardej powierzchni oraz ocenę pływania w cieczy (młócenie) za pomocą automatycznego śledzenia i analizy WormLab. Te czułe metody charakteryzowania deficytów motorycznych pozwalają na porównania nasilenia i oferują narzędzia do pomiaru tłumienia i wzmacniania fenotypów motorycznych. Test lokomocji promieniowej określa ilościowo różnice w ruchliwości pełzania (sinusoidalny ruch na stałej powierzchni) między populacjami robaków. Test ten wykorzystuje naturalne, niestymulowane zachowanie eksploracyjne C. elegans, umieszczając robaki w jednym miejscu na talerzu i oznaczając ich ostateczną lokalizację po określonym czasie10. Alternatywnie, pływanie w płynie (młócenie) testy liczą zgięcia ciała poszczególnych robaków w określonym czasie. Ręczne liczenie zgięć ciała przez ludzkie oko jest czasochłonne i zazwyczaj wykazuje znaczną zmienność między eksperymentatorami. Zastosowanie wspomaganego komputerowo automatycznego śledzenia i analizy może wyeliminować znaczną część tej zmienności. Oprócz charakterystyki wyjściowego upośledzenia motorycznego w modelach ALS, zarówno testy lokomocji radialnej, jak i pływania mogą wykrywać modulację różnych fenotypów lokomotorycznych w wyniku interwencji genetycznych lub małocząsteczkowych. Metody te mają zastosowanie w badaniu modeli ALS i dowolnego szczepu C. elegans, który wykazuje zmienioną ruchliwość.

<table><tbody><tr><td>C. elegans</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>-</td><td>Kupuj swoje szczepy zgodnie z potrzebami, N2 jest użytecznym szczepem kontrolnym</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety Pasteura, szkło borokrzemianowe</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Szklana pipeta używana do tworzenia ślimaka - trzymaj szklaną pipetę w jednej ręce i ~1" drutu platynowego (trzymanego przez szczypce) w drugiej nad płomieniem, aby połączyć.&nbsp;</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, 35x10mm</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td>Płytki testowe do systemu obrazowania WormLab</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, 60x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-090</td><td>Talerze do robaków</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, 100x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Standardowa promieniowa płytka do badania lokomocji</td></tr><tr><td>Jednorazowe szalki Petriego, 150x15mm</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>Dłuższe ramy czasowe promieniowe Płytka do badania lokomocji</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>M80</td><td>Zakres do konserwacji robaków i ustawiania promieniowych testów lokomocji</td></tr><tr><td>Markery z drobną końcówką</td><td>VWR</td><td>52877-810</td><td>Potrzebujesz co najmniej 2 kolorów do testów lokomocji promieniowej. Do dokładności wymagane są drobne końcówki.</td></tr><tr><td>Skaner płaski</td><td>Amazon</td><td>Epson Perfection V850</td><td>Opcjonalny do badania lokomocji promieniowej. Protokół zakłada rozdzielczość 300 dpi, większość skanerów będzie działać dobrze</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH-Opcjonalne</td><td></td> <td>bezpłatne oprogramowanie dostarczane przez NIH -</td></tr> <tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/ M9 buffer</td><td>VWR</td><td>IC113037012</td><td>Medium używane do testu pływackiego. Można go wykonać od podstaw, patrz WormBook: Konserwacja C. elegans</td></tr><tr><td>NGM (Nematode Growth Medium)</td><td>VWR</td><td>76347-412</td><td>Podłoże używane do uprawy C. elegans. Może być wykonany od podstaw, patrz WormBook: Utrzymanie bakterii C. elegans</td></tr><tr><td>OP50&nbsp;</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis (CGC)</td><td>OP50</td><td>Podstawowe źródło pożywienia dla C. elegans</td></tr><tr><td>p1000 pipettor</td><td>VWR</td><td>76207-552</td><td>Pipetor, używany w teście pływackim</td></tr><tr><td>Końcówki P1000</td><td>VWR</td><td>83007-384</td><td>Końcówki do pipetatora, stosowane w testach pływackich</td></tr><tr><td>Drut platynowy, średnica 0,2032 mm</td><td>VWR</td><td>BT136585-5M</td><td>Drobny drut platynowy używany do tworzenia kilofa ślimakowego - trzymaj szklaną pipetę w jednej ręce i ~ 1 "drutu platynowego (trzymanego szczypcami) w drugiej nad płomieniem, aby połączyć.&nbsp;</td></tr><tr><td>Linijka</td><td>VWR</td><td>56510-001</td><td>Konieczność oceny testów lokomocji promieniowej</td></tr><tr><td>System obrazowania WormLab MBF</td><td>Bioscience</td><td>WormLab</td><td>System obrazowania obejmuje sprzęt WormLab (stolik jasnego pola, kamerę i obudowę) oraz oprogramowanie WormLab. https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system</td></tr></tbody></table>

ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego c. elegans

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Choroba neurodegeneracyjna, stwardnienie zanikowe boczne (ALS), charakteryzuje się postępującą utratą neuronów ruchowych, której towarzyszy osłabienie mięśni i upośledzenie motoryczne, które pogarsza się z czasem. Chociaż poczyniono znaczne postępy w określaniu genetycznych czynników ALS dla podgrupy pacjentów, większość przypadków ma nieznaną etiologię. Co więcej, mechanizmy leżące u podstaw dysfunkcji i zwyrodnienia neuronów ruchowych nie są dobrze poznane; W związku z tym istnieje ciągła potrzeba opracowania i scharakteryzowania reprezentatywnych modeli w celu zbadania tych procesów. Caenorhabditis elegans może dostosować swój ruch do fizycznych ograniczeń otoczenia, z dwoma podstawowymi paradygmatami ruchowymi badanymi w środowisku laboratoryjnym - pełzaniem po stałej powierzchni i pływaniem w cieczy. Reprezentują one złożoną interakcję między czuciem, neuronami ruchowymi i mięśniami. Modele ALS C. elegans mogą wykazywać upośledzenie w jednym lub obu tych paradygmatach ruchowych. Protokół ten opisuje dwa czułe testy do oceny ruchliwości u C. elegans: zoptymalizowany test lokomocji radialnej mierzący pełzanie po twardej powierzchni oraz zautomatyzowaną metodę śledzenia i analizy pływania w cieczy (młócenie). Oprócz scharakteryzowania wyjściowego upośledzenia motorycznego modeli ALS, testy te mogą wykrywać supresję lub wzmocnienie fenotypów w wyniku interwencji genetycznych lub małocząsteczkowych. W związku z tym metody te mają przydatność do badania modeli ALS i dowolnego szczepu C. elegans, który wykazuje zmienioną ruchliwość.

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Nasz protokół przedstawia dwa testy, określające ilościowo ruch C. elegans. Metody te oceniają fenotypy ruchliwości, takie jak te wykazywane przez modele stwardnienia zanikowego bocznego lub ALS. Test lokomocji radialnej jest opłacalną i łatwą metodą wykrywania pełzania po twardej powierzchni.Test pływacki wykorzystuje śledzenie komputerowe do bezstronnego wykrywania ruchów rzucania się w cieczy. Metody te są przydatne do ilościowego określania różnic ruchowych u C. elegans. Chociaż badamy ALS, mogą być one stosowane w każdym szczepie o zmienionej ruchliwości.Odwróć płytki testowe NGM do góry nogami. I oznacz spód identyfikatorem szczepów C.elegans, które mają być testowane. Zrób małą kropkę z markerem na środku odwróconej płytki.Podczas pracy z mikroskopem preparacyjnym przenieś robaki na środek płytki testowej. I ustaw minutnik na 30 minut. Połóż pokrywkę z powrotem na talerzu i odłóż ją na bok.Kontynuuj przenoszenie robaków, aż wszystkie szczepy znajdą się na wyznaczonych płytkach testowych. Po 30 minutach rozpocznij ocenianie pierwszej płytki, zdejmując pokrywkę i umieszczając płytkę ekranem do dołu pod mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj ostrość mikroskopu, aż wszystkie robaki będą widoczne przez świder.Używając pisaka w innym kolorze od środkowego punktu, umieść małą kropkę w miejscu każdego robaka. Sprawdź krawędź płytki, ponieważ niektóre robaki mogą się tam znaleźć. Policz także i zapisz, ile robaków nie poruszyło się od punktu środkowego.Zmierz odległość od punktu środkowego do końcowych oznaczeń lokalizacji dla każdego robaka i zapisz odległość za pomocą linijki. Pierwszy punkt robaka jest oznaczony myślnikiem. Rejestruj dane o długości dla każdej kropki po kolei, obracając płytkę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.Otwórz powiązane oprogramowanie, aby skonfigurować i nagrać filmy. Kliknij ikonę przechwytywania wideo. Naciśnij pokrętło ściemniacza i obróć je zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyregulować światło.W oknie przechwytywania wideo kliknij kartę ustawień i dostosuj tryb wideo do 2456x2052_Mono8, liczba klatek na sekundę do 14, wyjście jako monochromatyczne. Ekspozycja 0,00300 sekundy. Wzmocnienie do 1 dB.Gamma do jednego. I obróć do 180. Wróć do zakładki przechwytywania, wybierz folder nagrań i przypisz nazwę pliku, wprowadzając ją w polu tekstowym prefiksu pliku.Ustaw inne ustawienia przechwytywania, takie jak bufor, na 128 klatek i czas trwania na jedną minutę. Umieść zapaloną płytkę testową na stoliku urządzenia i wyśrodkuj ją na ekranie przechwytywania wideo, a następnie zdejmij pokrywę. Za pomocą mikropipety przemyć około 50 robaków w 1 ml M9 na płytkę testową.Delikatnie zakręć płytką, aby sprowadzić zwierzęta do środka, lub użyj mikropipety, aby dodać kilka kropli M9, aby oddzielić zwierzęta. Ustaw minutnik na 60 sekund, aby robaki mogły przyzwyczaić się do pływania. Wyreguluj pokrętło światła tak, aby wyświetlacz był tak jasny, jak to możliwe, bez prześwietlenia.Ręcznie wyreguluj ostrość aparatu, obracając pierścień ostrości na korpusie obiektywu aparatu, obserwując wyświetlacz. Po 60 sekundach naciśnij przycisk nagrywania, wybierz pierwszy przycisk w menu przepływu pracy Importuj sekwencję obrazów"i znajdź i kliknij dwukrotnie wideo. Z menu przepływu pracy wybierz Ustaw informacje o sekwencji"W nowym oknie menu sprawdź schemat nazewnictwa, dodaj notatki i zweryfikuj metadane.Wybierz Dostosuj obraz"i otworzy się nowe wyskakujące menu o nazwie Dopasowania obrazu". Dostosuj ustawienia przetwarzania obrazu, ustawiając wygładzanie tła na 10, wygładzanie gaussowskie na pięć, Wypełnij otwory na dwa, filtr małych obiektów na zero i pomijając segmentację całkowej pochodnej. Dostosuj poziom progu tak, aby zwierzęta były całkowicie wypełnione zielenią, ale nadal odróżniały się od tła.Następnie kliknij Zastosuj"Z menu przepływu pracy wybierz Wykryj i śledź"wybierz od trzech do siedmiu robaków i kliknij Wykryj robaki"przycisk w zakładce wykrywania. Przejdź do zakładki śledzenia. W parametrach śledzenia zaznacz opcję Użyj cofania i odznacz opcję Śledź robaki na krawędzi obrazu.Ustaw maksymalną śledzoną hipotezę na pięć. Ustaw tryb śledzenia na pływanie. Przejdź do sekcji ustawień zaawansowanych i ustaw ramki, których robaki mogą dotykać granicy, na 50.Robaki ramek mogą nakładać się na 500. Tolerancja położenia do 0,50. I tolerancja kształtu do 0,50.Zapisz te ustawienia i wdróż je dla wszystkich filmów w eksperymencie, zapisując je jako konfigurację. Przejdź do menedżera konfiguracji w lewym górnym menu ikon i kliknij Zapisz"Ikona. Nadaj tej konfiguracji nazwę i opis.I kliknij w porządku"W menu przepływu pracy kliknij Zapisz projekt"Śledź filmy, przechodząc do menu przepływu pracy i klikając Partia"Ikona. Kliknij przycisk Dodaj" w sekcji wyboru plików w tym menu przetwarzania wsadowego. Przejdź do wszystkich plików projektu do przetworzenia i wybierz je.Następnie kliknij Otwórz"Kliknij Start"przycisk i zwróć uwagę na zielony wskaźnik postępu na pierwszym pliku. Zezwalaj na przetwarzanie wszystkich plików. Po zakończeniu odczytywania wszystkich plików zamknij oprogramowanie.Wybierz Analizuj dane"Przejdź do podsumowania utworu. I użyj przycisku Eksportuj w prawym dolnym rogu, aby wyeksportować dane w formacie czytelnym dla arkusza kalkulacyjnego. Użyj liczby skrętów"i czasu trwania ścieżki", aby obliczyć skręty na minutę dla każdej ścieżki za pomocą funkcji arkuszy kalkulacyjnych.Niestymulowane rozproszenie larw L4 w stadium rozwojowym pięciu różnych szczepów mierzono za pomocą testu lokomocji radialnej. I przedstawione na wykresie w mikrometrach na przebytą minutę. Dane wyświetlane w postaci wykresów słupkowych sprawiają, że względne różnice między szczepami są wyraźniejsze.Natomiast końcowe przemieszczenie każdego robaka wykreślone na wykresie pozwala na lepszą wizualizację zmienności w populacji. Tempo pływania pod względem częstotliwości rzucania lub falowania w cieczy mierzono za pomocą bezstronnej oceny i analizy wspomaganej komputerowo. I przedstawione na wykresie w liczbie uderzeń na minutę.Dane z wykresu słupkowego ułatwiają dostrzeżenie względnych różnic między odkształceniami. Natomiast dane z każdego pojedynczego robaka są wykreślane na wykresie, co pozwala na lepszą wizualizację zmienności w populacji. W teście lokomocji radialnej łagodny szczep TDP-43 nie różnił się znacząco od szczepu N2 typu dzikiego.Jednak w teście pływackim zarówno łagodne, jak i silne szczepy TDP-43 nie tylko znacząco różniły się od N2 typu dzikiego, ale także od siebie nawzajem. Zmutowany szczep TDP-43 ALS ma poważne upośledzenie pełzania spowodowane lokomocją radialną i nie miota się w cieczy. Szczep wykazujący ekspresję tau ma poważne upośledzenie w lokomocji radialnej, ale może się miotać w teście pływackim.Najważniejszym aspektem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tych metod, jest utrzymanie spójnych kontroli między powtórzeniami. Gwarantuje to, że różnice w ruchliwości są spowodowane różnicami fenotypowymi, a nie warunkami środowiskowymi. Metody te zapewniają kompleksową ocenę dwóch głównych paradygmatów ruchliwości C.elegans.Metody obserwacji mogą obejmować dodatkową charakterystykę behawioralną, analizę biochemiczną lub badanie funkcji mięśni lub neuronów.

evaluation-motor-impairment-c-elegans-models-amyotrophic-lateral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Model mysi stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) poddano badaniu klinicznemu i behawioralnemu. Jako warunek wstępny dla towarzyszącej analizy immunohistologicznej szczegółowo przedstawiono przygotowanie rdzenia kręgowego.

Badania kliniczne i usuwanie rdzenia kręgowego w modelu mysim stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)

Ten film pokazuje proces oceny dysfunkcji motorycznej w modelu mysim poprzez podanie toksyny krztuścowej i inokulum zawierającego peptydy naśladujące mielinę i adiuwanty, a następnie testy na bieżni w celu oceny funkcji motorycznych i oceny wynikłego uszkodzenia nerwów w wyniku aktywacji immunologicznej i demielinizacji.

Ocena funkcji motorycznych w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia nerwu

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Prezentujemy udoskonalone protokoły, które pozwalają na monitorowanie in vivo funkcji jednostki motorycznej u myszy. Opisano techniki pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE) w mięśniach kończyn tylnych myszy unerwionych przez nerw kulszowy.

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

W tym badaniu demonstrujemy wykorzystanie kinematycznej analizy chodu opartej na obrazowaniu w płaszczyźnie brzusznej do monitorowania subtelnych zmian w koordynacji ruchowej, jak również postępu neurodegeneracji wraz z wiekiem w modelach mysich (np. linie myszy z mutacją endofiliny).

Analiza chodu zależnych od wieku zaburzeń motorycznych u myszy z neurodegeneracją

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Poznaj metody oceny upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego przy użyciu C. elegans. Radial Locomotion Assay i Swimming Assay umożliwiają ilościową analizę ruchu i różnic między szczepami.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

Przeglądaj więcej filmów