Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

Nasz protokół przedstawia dwa testy, określające ilościowo ruch C. elegans. Metody te oceniają fenotypy ruchliwości, takie jak te wykazywane przez modele stwardnienia zanikowego bocznego lub ALS. Test lokomocji radialnej jest opłacalną i łatwą metodą wykrywania pełzania po twardej powierzchni.

Test pływacki wykorzystuje śledzenie komputerowe do bezstronnego wykrywania ruchów rzucania się w cieczy. Metody te są przydatne do ilościowego określania różnic ruchowych u C. elegans. Chociaż badamy ALS, mogą być one stosowane w każdym szczepie o zmienionej ruchliwości.

Odwróć płytki testowe NGM do góry nogami. I oznacz spód identyfikatorem szczepów C.elegans, które mają być testowane. Zrób małą kropkę z markerem na środku odwróconej płytki.

Podczas pracy z mikroskopem preparacyjnym przenieś robaki na środek płytki testowej. I ustaw minutnik na 30 minut. Połóż pokrywkę z powrotem na talerzu i odłóż ją na bok.

Kontynuuj przenoszenie robaków, aż wszystkie szczepy znajdą się na wyznaczonych płytkach testowych. Po 30 minutach rozpocznij ocenianie pierwszej płytki, zdejmując pokrywkę i umieszczając płytkę ekranem do dołu pod mikroskopem preparacyjnym. Dostosuj ostrość mikroskopu, aż wszystkie robaki będą widoczne przez świder.

Używając pisaka w innym kolorze od środkowego punktu, umieść małą kropkę w miejscu każdego robaka. Sprawdź krawędź płytki, ponieważ niektóre robaki mogą się tam znaleźć. Policz także i zapisz, ile robaków nie poruszyło się od punktu środkowego.

Zmierz odległość od punktu środkowego do końcowych oznaczeń lokalizacji dla każdego robaka i zapisz odległość za pomocą linijki. Pierwszy punkt robaka jest oznaczony myślnikiem. Rejestruj dane o długości dla każdej kropki po kolei, obracając płytkę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.

Otwórz powiązane oprogramowanie, aby skonfigurować i nagrać filmy. Kliknij ikonę przechwytywania wideo. Naciśnij pokrętło ściemniacza i obróć je zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyregulować światło.

W oknie przechwytywania wideo kliknij kartę ustawień i dostosuj tryb wideo do 2456x2052_Mono8, liczba klatek na sekundę do 14, wyjście jako monochromatyczne. Ekspozycja 0,00300 sekundy. Wzmocnienie do 1 dB.

Gamma do jednego. I obróć do 180. Wróć do zakładki przechwytywania, wybierz folder nagrań i przypisz nazwę pliku, wprowadzając ją w polu tekstowym prefiksu pliku.

Ustaw inne ustawienia przechwytywania, takie jak bufor, na 128 klatek i czas trwania na jedną minutę. Umieść zapaloną płytkę testową na stoliku urządzenia i wyśrodkuj ją na ekranie przechwytywania wideo, a następnie zdejmij pokrywę. Za pomocą mikropipety przemyć około 50 robaków w 1 ml M9 na płytkę testową.

Delikatnie zakręć płytką, aby sprowadzić zwierzęta do środka, lub użyj mikropipety, aby dodać kilka kropli M9, aby oddzielić zwierzęta. Ustaw minutnik na 60 sekund, aby robaki mogły przyzwyczaić się do pływania. Wyreguluj pokrętło światła tak, aby wyświetlacz był tak jasny, jak to możliwe, bez prześwietlenia.

Ręcznie wyreguluj ostrość aparatu, obracając pierścień ostrości na korpusie obiektywu aparatu, obserwując wyświetlacz. Po 60 sekundach naciśnij przycisk nagrywania, wybierz pierwszy przycisk w menu przepływu pracy Importuj sekwencję obrazów"i znajdź i kliknij dwukrotnie wideo. Z menu przepływu pracy wybierz Ustaw informacje o sekwencji"W nowym oknie menu sprawdź schemat nazewnictwa, dodaj notatki i zweryfikuj metadane.

Wybierz Dostosuj obraz"i otworzy się nowe wyskakujące menu o nazwie Dopasowania obrazu". Dostosuj ustawienia przetwarzania obrazu, ustawiając wygładzanie tła na 10, wygładzanie gaussowskie na pięć, Wypełnij otwory na dwa, filtr małych obiektów na zero i pomijając segmentację całkowej pochodnej. Dostosuj poziom progu tak, aby zwierzęta były całkowicie wypełnione zielenią, ale nadal odróżniały się od tła.

Następnie kliknij Zastosuj"Z menu przepływu pracy wybierz Wykryj i śledź"wybierz od trzech do siedmiu robaków i kliknij Wykryj robaki"przycisk w zakładce wykrywania. Przejdź do zakładki śledzenia. W parametrach śledzenia zaznacz opcję Użyj cofania i odznacz opcję Śledź robaki na krawędzi obrazu.

Ustaw maksymalną śledzoną hipotezę na pięć. Ustaw tryb śledzenia na pływanie. Przejdź do sekcji ustawień zaawansowanych i ustaw ramki, których robaki mogą dotykać granicy, na 50.

Robaki ramek mogą nakładać się na 500. Tolerancja położenia do 0,50. I tolerancja kształtu do 0,50.

Zapisz te ustawienia i wdróż je dla wszystkich filmów w eksperymencie, zapisując je jako konfigurację. Przejdź do menedżera konfiguracji w lewym górnym menu ikon i kliknij Zapisz"Ikona. Nadaj tej konfiguracji nazwę i opis.

I kliknij w porządku"W menu przepływu pracy kliknij Zapisz projekt"Śledź filmy, przechodząc do menu przepływu pracy i klikając Partia"Ikona. Kliknij przycisk Dodaj" w sekcji wyboru plików w tym menu przetwarzania wsadowego. Przejdź do wszystkich plików projektu do przetworzenia i wybierz je.

Następnie kliknij Otwórz"Kliknij Start"przycisk i zwróć uwagę na zielony wskaźnik postępu na pierwszym pliku. Zezwalaj na przetwarzanie wszystkich plików. Po zakończeniu odczytywania wszystkich plików zamknij oprogramowanie.

Wybierz Analizuj dane"Przejdź do podsumowania utworu. I użyj przycisku Eksportuj w prawym dolnym rogu, aby wyeksportować dane w formacie czytelnym dla arkusza kalkulacyjnego. Użyj liczby skrętów"i czasu trwania ścieżki", aby obliczyć skręty na minutę dla każdej ścieżki za pomocą funkcji arkuszy kalkulacyjnych.

Niestymulowane rozproszenie larw L4 w stadium rozwojowym pięciu różnych szczepów mierzono za pomocą testu lokomocji radialnej. I przedstawione na wykresie w mikrometrach na przebytą minutę. Dane wyświetlane w postaci wykresów słupkowych sprawiają, że względne różnice między szczepami są wyraźniejsze.

Natomiast końcowe przemieszczenie każdego robaka wykreślone na wykresie pozwala na lepszą wizualizację zmienności w populacji. Tempo pływania pod względem częstotliwości rzucania lub falowania w cieczy mierzono za pomocą bezstronnej oceny i analizy wspomaganej komputerowo. I przedstawione na wykresie w liczbie uderzeń na minutę.

Dane z wykresu słupkowego ułatwiają dostrzeżenie względnych różnic między odkształceniami. Natomiast dane z każdego pojedynczego robaka są wykreślane na wykresie, co pozwala na lepszą wizualizację zmienności w populacji. W teście lokomocji radialnej łagodny szczep TDP-43 nie różnił się znacząco od szczepu N2 typu dzikiego.

Jednak w teście pływackim zarówno łagodne, jak i silne szczepy TDP-43 nie tylko znacząco różniły się od N2 typu dzikiego, ale także od siebie nawzajem. Zmutowany szczep TDP-43 ALS ma poważne upośledzenie pełzania spowodowane lokomocją radialną i nie miota się w cieczy. Szczep wykazujący ekspresję tau ma poważne upośledzenie w lokomocji radialnej, ale może się miotać w teście pływackim.

Najważniejszym aspektem, który należy wziąć pod uwagę w przypadku tych metod, jest utrzymanie spójnych kontroli między powtórzeniami. Gwarantuje to, że różnice w ruchliwości są spowodowane różnicami fenotypowymi, a nie warunkami środowiskowymi. Metody te zapewniają kompleksową ocenę dwóch głównych paradygmatów ruchliwości C.elegans.

Metody obserwacji mogą obejmować dodatkową charakterystykę behawioralną, analizę biochemiczną lub badanie funkcji mięśni lub neuronów.