Name: Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: Poznaj metodologię eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem do badania dynamiki białek i stanów konformacyjnych. Technika ta pozwala izolować wysokoenergetyczne stany białek i analizować ich stabilność strukturalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Roy J. Carver Charitable Trust dla Juliena Roche'a. Dziękujemy J. D. Levengoodowi i B. S. Tolbertowi za uprzejme udostępnienie próbki RRM2.

UWAGA: Opisany tutaj protokół wymaga (i) pompy wysokociśnieniowej oraz komory z rurką z cyrkonii wzmocnionej glinem o znamionowej wytrzymałości 2.5 kbar18, (ii) oprogramowania SPARKY19 do analizy widm NMR oraz (iii) oprogramowania do dopasowywania krzywych.
1. Przygotowanie próbek, montaż komory wysokociśnieniowej i konfiguracja eksperymentów.
<ol>
	<li>Wybór buforu: Należy zastosować równą mieszankę buforów anionowych i kationowych, takich jak fosforanowy i Tris20,21. 
	UWAGA: pKa buforów anionowych, takich jak fosforanowy i MES, wiąże się z istotną objętością reakcji (tj. różnicą w cząstkowych objętościach molowych kwasu i produktów zjonizowanych). pH takich buforów może być zatem znacząco zmienione przez zmianę ciśnienia (~0,25-0,5 jednostki pH/kbar).</li>
	<li>Należy upewnić się, że wymagana objętość próbki jest zbliżona do objętości standardowej probówki NMR o średnicy 3 mm (~300μL).</li>
	<li>Wprowadzić próbkę znakowaną 15N do probówki z cyrkonu za pomocą pipety szklanej. Należy upewnić się, że próbka spoczywa na dnie probówki. Uzupełnić 200 μL oleju mineralnego, aby zapobiec mieszaniu się próbki z cieczą transmisyjną (np. wodą). Resztę probówki wypełnić cieczą transmisyjną.</li>
	<li>Nałożyć jednorazowy pierścień O-ring na górną część probówki z cyrkonu i wsunąć probówkę do podstawy (Rysunek 1A,B). Następnie podłączyć probówkę do przewodu wysokociśnieniowego i dokręcić podstawę do ogniwa, początkowo ręcznie. Następnie przyłożyć moment obrotowy 14,7 Nm, aby zapobiec wyciekom przy niższym ciśnieniu (Rysunek 1C,D).</li>
	<li>Aby sprawdzić szczelność zestawu ogniwa ciśnieniowego, należy napompować probówkę do ciśnienia 300 bar poza spektrometrem, korzystając z podpory ogniwa i naczynia zabezpieczającego. Odczekać 15 min, zredukować ciśnienie do 1 bar i sprawdzić szczelność za pomocą czystej ściereczki niepozostawiającej włókien.</li>
	<li>Wsunąć niepodciśnieniową probówkę do spektrometru, ostrożnie prowadząc przewód łączący. Przesuwać probówkę w spektrometrze, aż osiągnie ona pozycję roboczą próbki (Rysunek 1E).</li>
	<li>Zablokować, zshimmować, dopasować i nastroić kanały 1H i 15N w sposób rutynowy. 
	UWAGA: Parametry shimmingu dla probówek z cyrkonu przystosowanych do wysokiego ciśnienia różnią się znacznie od standardowych probówek NMR. Zaleca się zapisanie zoptymalizowanych ustawień shimmingu do przyszłego użytku.</li>
	<li>Skonfigurować eksperyment 1H-15N-HSQC lub TROSY-HSQC i zarejestrować eksperyment referencyjny w warunkach atmosferycznych (1bar).</li>
</ol>
2. Rejestracja eksperymentów NMR wysokociśnieniowych
<ol>
	<li>Stopniowo zwiększać ciśnienie od 1 bar do 2.5 kbar w przyrostach 500 bar, aby przetestować ogólną stabilność białka. Prędkość pompy ciśnieniowej ustawić domyślnie na ~18 bar/s. Jeśli dokładne szybkości zwijania/rozwijania nie są znane, pozwolić próbce na równowagowanie przez 15-20 min po każdym przyroście 500 bar. Zarejestrować widmo przy ciśnieniu 2.5 kbar.</li>
	<li>Stopniowo zmniejszać ciśnienie z powrotem do 1 bar w krokach 500 bar, aby przetestować odwracalność perturbacji ciśnieniowej. Zarejestrować kolejne widmo w warunkach atmosferycznych i porównać przesunięcia chemiczne oraz intensywności pików z widmem referencyjnym zarejestrowanym wcześniej w tych samych warunkach. 
	UWAGA: Jeśli piki korelacyjne stanu natywnego są bardziej intensywne po cyklu ciśnieniowym, może to wskazywać, że niewielkie agregaty obecne w roztworze przy ciśnieniu atmosferycznym uległy dysocjacji i prawidłowo się zwiniły. Z drugiej strony, spadek intensywności lub znaczące zmiany przesunięć chemicznych sugerują, że białko mogło ulec nieodwracalnemu błędnemu zwinięciu w warunkach wysokiego ciśnienia.</li>
	<li>Zarejestrować serię eksperymentów 2D od 1 bar do 2.5 kbar co 500 bar. Zaleca się przeprowadzenie dodatkowych eksperymentów w pobliżu punktu przegięcia przejścia zwijania/rozwijania, aby zwiększyć precyzję dopasowania.</li>
</ol>
3. Analiza zmian intensywności piku
<ol>
	<li>Przetworzyć wszystkie widma i przenieść przypisania szkieletu z widma referencyjnego przy ciśnieniu 1 bar do widma zarejestrowanego przy 500 bar, a następnie przenieść przypisania z 500 bar do 1 kbar i tak dalej. 
	UWAGA: Ponieważ ciśnienie wywołuje nierównomierne przesunięcie 1H i 15W przypadku przesunięć chemicznych nie należy po prostu kopiować przyporządkowania szkieletu z jednego widma do drugiego. Należy skorygować je ręcznie.</li>
	<li>W menu Sparky kliknij Szczyt &gt; Lista pików (lt)W Lista pików okno, kliknij w Opcje i wybierz opcję wyświetlania obu Częstotliwości (ppm) i Wysokość danychZapisz listę uzyskaną dla każdego widma.</li>
	<li>W oprogramowaniu do dopasowywania krzywych skopiuj tożsamość sygnałów krosowych oraz wartości intensywności piku tak, aby wartości ciśnienia (w barach) stanowiły zmienną na osi X, a intensywność zmienną na osi Y.</li>
	<li>Jeśli całkowity lub niemal całkowity (&gt;obserwuje rozfałdowanie (80%), dopasuj profile intensywności poszczególnych pików, aby wyznaczyć odpowiednio zmianę energii swobodnej i zmianę objętości podczas rozfałdowania, stosując prosty model dwustanowy: 
	<img alt="Wzór na równowagę zwijania białek \(I = \frac{I_F}{1+e^{-\frac{\Delta G_U^0 + \Delta V_U(p-p_0)}{RT}}}\)." src="/files/ftp_upload/62701/62701eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">                                     Równ. 1 
	gdzie „I” to obserwowana intensywność sygnału krosowego przy danym ciśnieniu p i IF jest intensywnością tego samego sygnału korelacyjnego w stanie w pełni sfałdowanym. R to stała gazowa, T to temperatura bezwzględna, ΔGU0 standardowa różnica energii swobдной Gibbsa między stanem rozfałdowanym a pofałdowanym przy ciśnieniu atmosferycznym p0 (1 bar) oraz ΔVu zmiana objętości podczas rozwijania. Przy ciśnieniu p w barach i temperaturze T w kelwinach, R = 1,987 cal/K, ΔGU0 jest w cal/mol, a ΔVU jest w cal/mol/bar. Pomnóż ΔVU wartości uzyskane z dopasowania przez 41,84 w celu konwersji na mL/mol. ΔVU wartości te zazwyczaj mieszczą się w zakresie od -50 do -150 mL/mol dla białek globularnych22Wszystkie parametry są tutaj przedstawione w odniesieniu do reakcji rozwijania, lecz mogą zostać łatwo przeliczone na parametry reakcji zwijania (ΔGU0 = -ΔGF0 oraz ΔVU = -ΔVF).</li>
</ol>
4. Analiza zmian przesunięcia chemicznego
<ol>
	<li>Zorganizuj kolumny w oprogramowaniu w taki sposób, aby punkty ciśnienia były zmienną, a przesunięcia chemiczne 1H wyekstrahowane z list Sparky stanowiły oś Y.</li>
	<li>Dopasuj zależność przesunięć chemicznych 1H od ciśnienia do prostego równania kwadratowego: 
	δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2                    Równanie 2 
	Gdzie δ(p) to zmierzone przesunięcie chemiczne 1H sygnału korelacyjnego przy danym ciśnieniu p, a δ0(p0) to przesunięcia chemiczne 1H tego samego sygnału w widmie referencyjnym zarejestrowanym przy 1 bar. B1 i B2 reprezentują parametry pierwszego i drugiego rzędu wyrażone odpowiednio w ppm/bar i ppm/bar2.</li>
</ol>

<ol><li>Alderson, R. T., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+invisible+protein+states+with+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probing+invisible%2C+low-populated+states+of+protein+molecules+by+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+An+application+to+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).</li>
<li>Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+enzyme+motions+by+solution+NMR+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion.</a> Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).</li>
<li>Ishima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMG+relaxation+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CPMG relaxation dispersion.</a> Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).</li>
<li>Longo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+exchange+saturation+transfer+%28CEST%29%3A+an+efficient+tool+for+detecting+molecular+information+on+proteins%27+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour.</a> Analyst. 39, 2687-2690 (2014).</li>
<li>Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+exchange+kinetics+and+atomic+resolution+dynamics+in+high-molecular-weight+complexes+using+dark-state+exchange+saturation+transfer+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Clore, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavities+determine+the+pressure+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cavities determine the pressure unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).</li>
<li>Chen, C. R., Makhatadze, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinant+of+the+effects+of+hydrostatic+pressure+on+protein+folding+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability.</a> Nature Communications. 8, 14561(2017).</li>
<li>Roche, J., Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+pressure+denaturation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Lessons from pressure denaturation of proteins.</a> Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244(2018).</li>
<li>Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+and+compressibility+differences+between+protein+conformations+revealed+by+high-pressure+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR.</a> Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).</li>
<li>Akasaka, K., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-lying+excited+states+of+proteins+revealed+from+non-linear+pressure+shifts+in+1H+and+15N+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR.</a> Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).</li>
<li>Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+conformational+fluctuation+of+proteins+by+pressure+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation.</a> Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).</li>
<li>Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+snapshots+of+a+fluctuating+protein+structure%3A+ubiquitin+at+30+bar-3+kbar%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar.</a> Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).</li>
<li>Roche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((remodeling+of+the+folding+free+energy+landscape+of+Staphylococcal+nuclease+by+cavity-creating+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations.</a> Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).</li>
<li>Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cavities+and+hydration+in+the+pressure+unfolding+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).</li>
<li>Maeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavity+as+a+source+of+conformational+fluctuation+and+high-energy+state%3A+High-pressure+NMR+study+of+a+cavity-enlarged+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme.</a> Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).</li>
<li>Peterson, R. W., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-contained+high-pressure+cell%2C+apparatus%2C+and+procedure+for+the+preparation+of+encapsulated+proteins+dissolved+in+low+viscosity+fluids+for+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 76, 094101(2005).</li>
<li>Goddard, T. D., Kneller, D. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoddard%2C+TD+%22Sparky+3%22">Sparky 3</a>. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).</li>
<li>Caro, J. A., Wand, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+high-pressure+NMR+spectroscopy+and+its+applications+in+protein+biophysics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology.</a> Methods. 148, 67-80 (2018).</li>
<li>Kitamura, T., Itoh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+volume+of+protonic+ionization+for+buffering+agents.+Prediction+of+pressure+dependence+of+pH+and+pOH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Solution+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH.</a> Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).</li>
<li>Royer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+volume+changes+in+pressure-induced+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).</li>
<li>Erlach, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+nonliner+pressure-induced+chemical+shift+changes+and+thermodynamic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters.</a> Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).</li>
<li>de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+reconcile+the+physical+and+chemical+unfolding+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+The+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. M., Roche, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+NMR+techniques+for+the+study+of+protein+dynamics%2C+folding+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili manuskrypt. Deklarują brak konfliktu interesów.

Badanie to szczegółowo opisuje protokół zaimplementowany do badania strukturalnych i termodynamicznych reakcji białek na zaburzenia ciśnienia. Eksperymenty wysokociśnieniowe zarejestrowane tutaj na RRM2 pokazują, że duże różnice w wartościach ΔVU , wskazujące na nie w pełni kooperatywne rozwijanie, można znaleźć w stosunkowo małym białku jednodomenowym. Podobny obraz wyłania się z analizy zmian przesunięcia chemicznego 1H pod wpływem ciśnienia. Należy zauważyć, że Kalbitzer i współpracownicy wykazal...

Od dawna wiadomo, że wysokoenergetyczne, słabo zaludnione stany konformacyjne białek i kompleksów białkowych odgrywają kluczową rolę w wielu szlakach biologicznych1,2,3. Dzięki eksperymentom opartym między innymi na sekwencjach impulsów Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5 oraz transferze nasycenia wymiany ciemnego (DEST)6 (między innymi), spektroskopia NMR roztworu stała się metodą z wyboru do charakteryzowania przejściowych stanów konformacyjnych7. Wraz z tymi eksperymentami można wprowadzić perturbacje, takie jak temperatura, pH lub chemiczne denaturanty, aby zwiększyć względną populację podstanów konformacyjnych o wyższej energii. Podobnie, równowaga białkowa może być również zaburzona przez zastosowanie wysokiego ciśnienia hydrostatycznego. W zależności od wielkości zmiany objętości związanej z odpowiednimi zmianami konformacyjnymi, wzrost ciśnienia o kilkaset do kilku tysięcy prętów może znacznie ustabilizować wyższy stan energetyczny lub spowodować całkowite rozwinięcie białka8,9,10. Widma NMR białek zazwyczaj wykazują dwa rodzaje zmian ciśnienia hydrostatycznego: (i) zmiany przesunięć chemicznych i (ii) zmiany intensywności pików. Zmiany przesunięcia chemicznego odzwierciedlają zmiany na granicy faz białko-woda powierzchniowa i/lub lokalna kompresja struktury białka w szybkiej skali czasowej (względem skali czasowej NMR)11. Crosspeak wykazujący dużą nieliniową zależność od ciśnienia przesunięć chemicznych może wskazywać na obecność stanów konformacyjnych o wyższej energii12,13. Z drugiej strony, szczytowe zmiany intensywności wskazują na główne przejścia konformacyjne w powolnej skali czasu, takie jak zmiany w populacjach stanów złożonych/rozłożonych. Obecność fałdowanych produktów pośrednich lub wyższych stanów energetycznych można wykryć na podstawie dużych zmian wielkości zmiany objętości po rozwinięciu, mierzonych dla różnych reszt danego białka14,15,16,17. Opierając się na naszym doświadczeniu, nawet małe białka, które są zwykle klasyfikowane jako foldery dwustanowe, wykazują niejednorodne reakcje na nacisk, co dostarcza przydatnych informacji na temat ich lokalnej stabilności fałdowania. Opisano tutaj protokół pozyskiwania i analizy intensywności piku amidu i zależności od ciśnienia 1H zmian chemicznych, wykorzystując jako białko modelowe izolowany motyw rozpoznawania RNA 2 (RRM2) heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1 (hnRNPA1).

<table><tbody><tr><td>Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>NMRCELL-B</td><td></td></tr><tr><td>Sparky3</td><td>Uniwersytet Kalifornijski San Francisco, Kalifornia</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Xtreme-60 Pompa strzykawkowa</td><td>Daedalus Innovations LLC</td><td>XTREME-60</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymenty nmr pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek

High-Pressure NMR Experiments for Detecting Protein Low-Lying Conformational States

Wysokie ciśnienie to dobrze znana metoda perturbacji, która może być użyta do destabilizacji białek globularnych i dysocjacji kompleksów białkowych w odwracalny sposób. Ciśnienie hydrostatyczne napędza równowagę termodynamiczną w kierunku stanu (stanów) o dolnej objętości molowej. Rosnące ciśnienie stwarza zatem możliwości precyzyjnego dostrojenia stabilności białek globularnych i równowagi oligomeryzacji kompleksów białkowych. Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem pozwalają na szczegółową charakterystykę czynników rządzących stabilnością białek globularnych, ich mechanizmów fałdowania i mechanizmów oligomeryzacji poprzez połączenie precyzyjnej zdolności dostrajania stabilności zaburzeń ciśnienia i rozdzielczości miejsca oferowanej przez spektroskopię NMR roztworu. W tym miejscu przedstawiamy protokół badania lokalnej stabilności fałdowania białka za pomocą zestawu eksperymentów 2D 1H-15N zarejestrowanych od 1 bara do 2,5 kbar. Kroki wymagane do akwizycji i analizy takich eksperymentów są zilustrowane danymi uzyskanymi w domenie RRM2 hnRNPA1.

Opisany tutaj protokół został zastosowany do zbadania zależności od ciśnienia RRM2, drugiego motywu rozpoznawania RNA białka hnRNPA1 (pozostałości 95-106), który jest niemal całkowicie rozfałdowany w zakresie 2,5 kbar (&gt;90%). Widma 1H-15N zarejestrowano przy ciśnieniach 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar i 2,5 kbar (Rysunek 2). Ponieważ przy 2,5 kbar żaden z natywnych pików korelacyjnych nie był widoczny powyżej poziomu szumu, wszystkim odpowiadającym ...

Dostarczamy szczegółowy opis kroków wymaganych do złożenia ogniwa wysokociśnieniowego, ustawienia i nagrania eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem, a na koniec analizujemy zarówno intensywność szczytu, jak i zmiany chemiczne pod ciśnieniem. Eksperymenty te mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków fałdowania i stabilności strukturalnej białek.

Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek

High-pressure is a well-known perturbation method that can be used to destabilize globular proteins and dissociate protein complexes in a reversible ...

Wysokie ciśnienie jest metodą z wyboru do zmiany względnej populacji próbki konformacyjnej białka. Jest niezwykle przydatny do izolowania i charakteryzowania wysokoenergetycznych stanów konformacyjnych. W porównaniu ze wszystkimi metodami perturbacji, takimi jak pH czy temperatura, perturbacja ciśnienia jest łatwa do zastosowania i w pełni odwracalna.Jest to również zaburzenie miejscowe, dotykające przede wszystkim obszarów z wnękami szklanymi lub pustymi przestrzeniami. Aby rozpocząć, wprowadź próbkę znakowaną azotem-15 do probówki cyrkonowej za pomocą szklanej pipety i upewnij się, że próbka jest osadzona na dnie probówki. Aby zapobiec mieszaniu się próbki z cieczą transmisyjną, należy nałożyć na próbkę 200 mikrolitrów oleju mineralnego, a następnie napełnić resztę rurki płynem transmisyjnym.Umieść jednorazowy O-ring na rurce z tlenku cyrkonu i wsuń rurkę do podstawy. Następnie podłącz rurkę do wysokociśnieniowej linki mocującej i ręcznie dokręć podstawę do ogniwa. Następnie zastosuj moment obrotowy 14,7 niutonometrów, aby zapobiec wyciekom przy niższym ciśnieniu.Aby sprawdzić integralność zespołu celi ciśnieniowej, należy zwiększyć ciśnienie w rurze do 300 barów na zewnątrz spektrometru za pomocą wspornika ogniwa i naczynia zabezpieczającego. Po 15 minutach zresetuj ciśnienie do jednego bara i sprawdź, czy nie ma wycieków czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Włóż rurkę bezciśnieniową do spektrometru, ostrożnie prowadząc linkę mocującą.Wsuń probówkę do spektrometru, aż probówka osiągnie pozycję siedzącą próbki. Zablokuj, podkładkuj, dopasuj i dostrój kanały protu i azotu, a zoptymalizowane podkładki zachowaj na przyszłość. Skonfiguruj spektroskopię zoptymalizowaną pod kątem relaksacji poprzecznej z hetero jednokwantową spektroskopią koherentną i kontynuuj rejestrację eksperymentu referencyjnego w warunkach atmosferycznych.Nagraj serię eksperymentów 2D od jednego bara do 2,5 kilobara na każde 500 barów. Jeżeli znane są dokładne szybkości składania lub rozkładania, po każdym kroku co 500 barów należy pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 15 do 20 minut. Gdy dojdzie do punktu przegięcia przejścia składania lub rozkładania, nagraj dodatkowe eksperymenty, aby poprawić precyzję dopasowania.Protokół ten został wykorzystany do zbadania zależności od ciśnienia RRM2, drugiego motywu rozpoznawania RNA heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1. Spektroskopia zoptymalizowana pod kątem relaksacji poprzecznej z hetero spektroskopią koherentną z mono kwantową spektroskopią koherentną zebrano widma na jednym barze, 1,5 kilobara, dwóch kilobarach i 2,5 kilobara. RRM2 jest prawie całkowicie rozłożony w zakresie 2,5 kilobara. Poszczególne profile intensywności ciśnienia zostały dopasowane zgodnie z przedstawionym tutaj równaniem, aby uzyskać odpowiednie zmiany w standardowej energii swobodnej i objętości Gibbsa związane z reakcją rozwijania.Po zmapowaniu struktury domeny, reszty o największej wielkości zmiany objętości znaleziono w rdzeniu strukturalnym domeny, podczas gdy te o najmniejszej wielkości zmiany objętości znajdowały się głównie w pętlach łączących między niciami beta i nicią beta do helisy końcowej C. Aby zbadać stopień ściśliwości i niejednorodności konformacyjnej zespołu stanu złożonego, przeanalizowano przesunięcia chemiczne protu. Poszczególne profile przesunięć chemicznych protu w funkcji ciśnienia dopasowano za pomocą przedstawionego równania, aby wyodrębnić współczynniki liniowe i nieliniowe specyficzne dla danego miejsca.Reszty o największych współczynnikach nieliniowych znajdowały się głównie w rdzeniu strukturalnym domeny, podczas gdy reszty o najmniejszych współczynnikach nieliniowych znajdowały się głównie w pętlach łączących różne motywy strukturalne. Ważne jest, aby prawidłowo ustawić rurkę jako ustawione ciśnienie, aby zapobiec wyciekom. Jeśli dojdzie do wycieku, sonda prawdopodobnie będzie musiała zostać usunięta, aby usunąć wszelkie ślady oleju mineralnego.

high-pressure-nmr-experiments-for-detecting-protein-low-lying

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego do badania interakcji białko-białko pomiędzy 15znakowanymi N dzikimi i zmutowanymi białkami envoplakiny a nieznakowanym białkiem wimentyny. Udana interakcja między envoplakiną typu dzikiego a wimentyną prowadzi do rozległego poszerzenia linii i zaniku pików w widmach NMR, podczas gdy brak interakcji między zmutowaną envoplakiną a wimentyną skutkuje dobrze rozdzielonymi pikami w widmach NMR.

Magnetyczny rezonans jądrowy do badania oddziaływań białko-białko na poziomie atomowym

Magnetyczny rezonans jądrowy jest jednym z najważniejszych narzędzi spektroskopowych. W tym artykule przedstawiono opracowanie nowego podejścia pod wysokim ciśnieniem, obecnie do 10,1 GPa. Otwiera to nowe okno na fizykę i chemię materii skondensowanej, w której badania nad wysokimi ciśnieniami mają ogromne znaczenie.

Magnetyczny rezonans jądrowy o wysokiej czułości przy ciśnieniu giga-paskalowym: nowe narzędzie do badania właściwości elektronicznych i chemicznych materii skondensowanej w ekstremalnych warunkach

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

Tutaj prezentujemy protokół szczegółowo opisujący pozyskiwanie, przetwarzanie i analizę serii eksperymentów NMR mających na celu scharakteryzowanie interakcji białko-glikan w roztworze. Przedstawiono najpopularniejsze metodologie oparte na ligandach i białkach, które niewątpliwie przyczyniają się do rozwoju glikobiologii strukturalnej i badań nad rozpoznawaniem molekularnym.

Rozplątywanie oddziaływań glikan-białko: magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) na ratunek

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) może scharakteryzować dynamikę strukturalną białka w sposób specyficzny dla reszt. Udostępniamy praktyczny protokół do rejestrowania eksperymentów z relaksacją NMR 15N R1 i R2 oraz eksperymentów z heterojądrowym efektem Overhausera (hetNOE) {1H}-15N, wrażliwych na skalę czasową od pikosekund do nanosekund.

NMR 15N Eksperymenty relaksacyjne do badania dynamiki strukturalnej białek z pikosekundy na nanosekundy

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Poznaj metodologię eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem do badania dynamiki białek i stanów konformacyjnych. Technika ta pozwala izolować wysokoenergetyczne stany białek i analizować ich stabilność strukturalną.

Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek

Przeglądaj więcej filmów