Eksperymenty NMR pod wysokim ciśnieniem do wykrywania nisko położonych stanów konformacyjnych białek
29 czerwca 2021
Dostarczamy szczegółowy opis kroków wymaganych do złożenia ogniwa wysokociśnieniowego, ustawienia i nagrania eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem, a na koniec analizujemy zarówno intensywność szczytu, jak i zmiany chemiczne pod ciśnieniem. Eksperymenty te mogą dostarczyć cennych informacji na temat szlaków fałdowania i stabilności strukturalnej białek.
Wysokie ciśnienie jest metodą z wyboru do zmiany względnej populacji próbki konformacyjnej białka. Jest niezwykle przydatny do izolowania i charakteryzowania wysokoenergetycznych stanów konformacyjnych. W porównaniu ze wszystkimi metodami perturbacji, takimi jak pH czy temperatura, perturbacja ciśnienia jest łatwa do zastosowania i w pełni odwracalna.
Jest to również zaburzenie miejscowe, dotykające przede wszystkim obszarów z wnękami szklanymi lub pustymi przestrzeniami. Aby rozpocząć, wprowadź próbkę znakowaną azotem-15 do probówki cyrkonowej za pomocą szklanej pipety i upewnij się, że próbka jest osadzona na dnie probówki. Aby zapobiec mieszaniu się próbki z cieczą transmisyjną, należy nałożyć na próbkę 200 mikrolitrów oleju mineralnego, a następnie napełnić resztę rurki płynem transmisyjnym.
Umieść jednorazowy O-ring na rurce z tlenku cyrkonu i wsuń rurkę do podstawy. Następnie podłącz rurkę do wysokociśnieniowej linki mocującej i ręcznie dokręć podstawę do ogniwa. Następnie zastosuj moment obrotowy 14,7 niutonometrów, aby zapobiec wyciekom przy niższym ciśnieniu.
Aby sprawdzić integralność zespołu celi ciśnieniowej, należy zwiększyć ciśnienie w rurze do 300 barów na zewnątrz spektrometru za pomocą wspornika ogniwa i naczynia zabezpieczającego. Po 15 minutach zresetuj ciśnienie do jednego bara i sprawdź, czy nie ma wycieków czystą, niestrzępiącą się chusteczką. Włóż rurkę bezciśnieniową do spektrometru, ostrożnie prowadząc linkę mocującą.
Wsuń probówkę do spektrometru, aż probówka osiągnie pozycję siedzącą próbki. Zablokuj, podkładkuj, dopasuj i dostrój kanały protu i azotu, a zoptymalizowane podkładki zachowaj na przyszłość. Skonfiguruj spektroskopię zoptymalizowaną pod kątem relaksacji poprzecznej z hetero jednokwantową spektroskopią koherentną i kontynuuj rejestrację eksperymentu referencyjnego w warunkach atmosferycznych.
Nagraj serię eksperymentów 2D od jednego bara do 2,5 kilobara na każde 500 barów. Jeżeli znane są dokładne szybkości składania lub rozkładania, po każdym kroku co 500 barów należy pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 15 do 20 minut. Gdy dojdzie do punktu przegięcia przejścia składania lub rozkładania, nagraj dodatkowe eksperymenty, aby poprawić precyzję dopasowania.
Protokół ten został wykorzystany do zbadania zależności od ciśnienia RRM2, drugiego motywu rozpoznawania RNA heterogenicznej jądrowej rybonukleoproteiny A1. Spektroskopia zoptymalizowana pod kątem relaksacji poprzecznej z hetero spektroskopią koherentną z mono kwantową spektroskopią koherentną zebrano widma na jednym barze, 1,5 kilobara, dwóch kilobarach i 2,5 kilobara. RRM2 jest prawie całkowicie rozłożony w zakresie 2,5 kilobara. Poszczególne profile intensywności ciśnienia zostały dopasowane zgodnie z przedstawionym tutaj równaniem, aby uzyskać odpowiednie zmiany w standardowej energii swobodnej i objętości Gibbsa związane z reakcją rozwijania.
Po zmapowaniu struktury domeny, reszty o największej wielkości zmiany objętości znaleziono w rdzeniu strukturalnym domeny, podczas gdy te o najmniejszej wielkości zmiany objętości znajdowały się głównie w pętlach łączących między niciami beta i nicią beta do helisy końcowej C. Aby zbadać stopień ściśliwości i niejednorodności konformacyjnej zespołu stanu złożonego, przeanalizowano przesunięcia chemiczne protu. Poszczególne profile przesunięć chemicznych protu w funkcji ciśnienia dopasowano za pomocą przedstawionego równania, aby wyodrębnić współczynniki liniowe i nieliniowe specyficzne dla danego miejsca.
Reszty o największych współczynnikach nieliniowych znajdowały się głównie w rdzeniu strukturalnym domeny, podczas gdy reszty o najmniejszych współczynnikach nieliniowych znajdowały się głównie w pętlach łączących różne motywy strukturalne. Ważne jest, aby prawidłowo ustawić rurkę jako ustawione ciśnienie, aby zapobiec wyciekom. Jeśli dojdzie do wycieku, sonda prawdopodobnie będzie musiała zostać usunięta, aby usunąć wszelkie ślady oleju mineralnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule szczegółowo opisano montaż ogniwa wysokociśnieniowego oraz konfigurację eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem. Szczególną uwagę poświęcono analizie zmian natężenia sygnałów i przesunięć chemicznych pod wpływem ciśnienia, co pozwala na uzyskanie informacji na temat ścieżek zwijania białek oraz ich stabilności strukturalnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia strukturalna
Wstęp
- Wysokie ciśnienie zmienia stany konformacyjne białek.
- Jest to odwracalna metoda perturbacji.
- Ciśnienie wpływa przede wszystkim na obszary z objętościami wolnymi.
- Metoda użyteczna do charakteryzacji wysokenergetycznych stanów konformacyjnych.
Cel badania
- Opisanie etapów montażu ogniwa wysokociśnieniowego.
- Przygotowanie i rejestracja eksperymentów NMR w warunkach wysokiego ciśnienia.
- Analiza wpływu ciśnienia na struktury białek.
Zastosowane metody
- Wprowadzenie próbek znakowanych azotem-15 do rurki z cyrkonii.
- Przykrycie próbek olejem mineralnym w celu zapobiegania mieszaniu.
- Wypełnienie rurki cieczą transmisyjną.
- Rejestracja eksperymentów NMR pod wysokim ciśnieniem.
Główne wyniki
- Szczegółowa metodologia konfiguracji NMR pod wysokim ciśnieniem.
- Wgląd w ścieżki fałdowania białek.
- Analiza zmian natężenia sygnałów i przesunięć chemicznych.
- Charakterystyka stabilności strukturalnej pod wpływem ciśnienia.
Wnioski
- NMR pod wysokim ciśnieniem jest skuteczną metodą badania dynamiki białek.
- Dostarcza cennych informacji na temat stanów konformacyjnych białek.
- Metodologia ta może być zastosowana w różnych badaniach nad białkami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
NMR wysokociśnieniowy umożliwia zespołom biofarmaceutycznym badanie rzadko występujących, wysokoenergetycznych stanów konformacyjnych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia zwijania, stabilności i oligomeryzacji białek. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i minimalizuje ryzyko na wczesnym etapie odkrywania leków poprzez ujawnianie szczegółów mechanistycznych niedostępnych dla standardowych metod perturbacyjnych. Integracja NMR opartego na ciśnieniu z procesami odkrywania wspiera bardziej świadomą selekcję portfolio oraz decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację rzadkich stanów konformacyjnych istotnych dla funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez mapowanie stabilności w konkretnych miejscach oraz przejść fałdowania.
- Zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celu poprzez kwantyfikację lokalnej i globalnej stabilności białka.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych układów białkowych do dalszych analiz przesiewowych poprzez charakteryzację równowag zwijania i oligomeryzacji.
- Zapewnia ilościowe odczyty z rozdzielczością w konkretnych miejscach, co służy standaryzacji i powtarzalności testów.
- Umożliwia rzetelne porównanie wariantów białek lub efektów działania ligandów w warunkach kontrolowanych zaburzeń.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące stabilności strukturalnej z mechanizmami błędnego zwijania lub agregacji białek istotnymi dla danej choroby, jeśli jest to właściwe.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie informacji o heterogeniczności konformacyjnej i ściśliwości.
- Minimalizuje ryzyko w procesie translacyjnym dzięki wczesnemu wyjaśnieniu niedoskonałości biofizycznych na etapie rozwoju pipeline'u.
Integracja potoku i przepływu pracy
NMR wysokociśnieniowy wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc odwracalną i ilościową platformę perturbacyjną do charakterystyki białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów zwijania oraz równowag oligomeryzacji.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary przejść konformacyjnych na potrzeby opracowywania testów.
- Analityka: Generuje profile intensywności i przesunięć chemicznych specyficznych dla danej pozycji w celu porównania stanów strukturalnych.
- Badania translacyjne: Dostarcza informacji o heterogeniczności konformacyjnej istotnej dla modeli chorób, o ile jest to możliwe w danym systemie białkowym.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Zapewnia możliwość ponownego wykorzystania metod analitycznych dla różnych celów białkowych i pytań mechanistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji białkowych celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: zapewnia zestandaryzowaną, odwracalną i skalowalną perturbację w celu generowania powtarzalnych danych.
- Wartość strategiczna: umożliwia lepsze podejmowanie decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyk strukturalnych.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój białkowych celów terapeutycznych w oparciu o solidne dane biofizyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektroskopii NMR oraz obsługi aparatury wysokociśnieniowej.
- Wymaga specjalistycznego sprzętu, w tym ogniw wysokociśnieniowych i systemów zabezpieczających.
- Konieczne jest rygorystyczne przygotowanie próbek oraz stosowanie protokołów zapobiegania wyciekom.
- Może wymagać adaptacji dla różnych układów białkowych lub strategii znakowania.
- Ograniczenia operacyjne obejmują zakres ciśnień oraz czas równoważenia niezbędny do uzyskania dokładnych pomiarów.
