Name: Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania wypławków jajnika u Schmidtea mediterranea do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał. Technika umożliwia wysokiej jakości obrazowanie komórek jajowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Instytut Medyczny Howarda Hughesa (LK i ASA) oraz Fundację Helen Hay Whitney (LHG). 
 
Dostęp do oryginalnych danych leżących u podstaw tego manuskryptu można uzyskać w Repozytorium Oryginalnych Danych Stowers pod adresem http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj robaki: karmić wypławki płciowe dwa razy w tygodniu organiczną pastą z wątroby, aby osiągnąć dojrzałość płciową. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, takie robaki są większe niż 1 cm długości i mają gonopory za ujściem gardła.</li>
	<li>Przygotuj rozwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące odczynniki: 16% paraformaldehyd (PFA); 50% wodny roztwór aldehydu glutarowego (GA); N-acetylo-L-cysteina (NAC); 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 2 mM KH2PO4.</li>
		<li>Rozcieńczyć 50% GA i 16% PFA PBS do końcowej mieszaniny 2,5% GA i 2% PFA. Rozcieńczyć 16% PFA z PBS do końcowego stężenia 4% PFA.</li>
		<li>Rozpuścić 5 g NAC w 100 ml PBS, aby uzyskać 5% roztwór roboczy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie jajników
<ol>
	<li>Dojrzałe płciowo robaki należy potraktować 5% NAC w naczyniu w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
	UWAGA: Duże robaki mogą się zwijać. Do spłaszczenia robaków można użyć szczotek lub końcówek do pipet. Użyta ilość 5% NAC jest minimalna, wystarczająca, aby pokryć powierzchnię szalki Petriego.</li>
	<li>Zastąp NAC 10 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i utrwal robaki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Rozpocznij preparację 10 minut po dodaniu 4% PFA i przeprowadź sekcję w 4% PFA, gdy robaki są naprawiane.</li>
	<li>Obserwuj pigmentację nabłonka, aby zlokalizować brzuszne sznury nerwowe, które pojawiają się jako dwie linie o jaśniejszej pigmentacji biegnące od przednich zwojów głowowych w kierunku ogona.</li>
	<li>Zlokalizuj jajniki. 
	UWAGA: Jajnik znajduje się tuż obok rdzenia nerwowego po stronie przyśrodkowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Polegaj na pigmentacji nabłonka, aby zlokalizować położenie jajnika w kierunku przednim i tylnym. Idealnie, pigmentacja nabłonka brzusznego w okolicy jajnika jest jaśniejsza niż otaczające obszary. U niektórych robaków pigmentacja nabłonka brzusznego nie zapewnia wystarczającej pewności. Robaki te można wyrzucić, ponieważ niektóre mogą nie mieć dobrze rozwiniętych jajników.</li>
	<li>Zweryfikuj położenie jajników, gdy przypuszczalne jajniki zostaną zlokalizowane przez pigmentację. 
	UWAGA: Po pierwsze, jajniki znajdują się z tyłu zwojów głowowych. Po drugie, ciemne jądra są boczne w stosunku do powierzchni grzbietowej powyżej jajnika. Jajniki znajdują się przed najbardziej przednim jądrem (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Czasami płaty jąder są umieszczone na poziomie jajników lub nieco przed nimi.</li>
	<li>Użyj dwóch noży chirurgicznych, aby przeciąć tylną i przednią część dwóch jajników (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C), aby całkowicie usunąć przednie i tylne fragmenty robaka. Użyj jednego noża, aby zakotwiczyć robaka i wyczyść drugi nóż używany do wykonywania nacięć.</li>
	<li>Wytnij środkową linię fragmentu jajnika, aby oddzielić dwa jajniki. Odwróć fragment, aby mieć brzuszną stronę do dołu.</li>
	<li>Oderwij tkankę grzbietową, aby odsłonić jelito (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D) za pomocą dwóch par spiczastych pęset (typ 5-SA). 
	UWAGA: Jajnik w kształcie kopuły znajduje się pod gałęziami jelit</li>.
	<li>Delikatnie usuń gałęzie jelita znajdujące się nad tkankami brzusznymi za pomocą końcówki pęsety lub miękkiej szczoteczki, aby odsłonić jajnik (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Usuń otaczające tkanki, aby usunąć jajnik (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F, G).</li>
	<li>Wyjmij jajniki i przenieś je do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przemycia 1 ml PBS.</li>
</ol>
3. Fiksacja dla TEM
<ol>
	<li>Myj jajniki w PBS przez 10 minut, delikatnie potrząsając. Trzymaj rurki w pozycji pionowej i pozwól jajnikom opaść na dno pod wpływem grawitacji. Powtórz pranie raz. 
	UWAGA: Jeśli jajniki nie toną, delikatnie wiruj przez 15 s za pomocą mini-wirówki stołowej (maksymalna prędkość 2000 × g).</li>
	<li>Zastąp PBS 2% PFA/2.5% GA/PBS.</li>
	<li>Utrwalić próbki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na wytrząsarce z prędkością 40 obr./min.</li>
	<li>Przechowywać próbki w utrwalaczu w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce z prędkością 40 obr./min.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie próbek dla TEM
<ol>
	<li>Umyj jajniki w PBS 3 razy po 10 minut każdy.</li>
	<li>Umyj jajniki w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) 3 razy po 10 minut każdy.</li>
	<li>Po utrwaleniu jajników w 2% wodnym roztworze OsO4 przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Na tym etapie pojemniki na próbki muszą być uszczelnione parafilmem. Przygotować 2% OsO4 z wodą uzdatnioną metodą odwróconej osmozy (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przepłukać próbki środkiem ddH2O 3 razy po 10 minut każda.</li>
	<li>Wstępnie wybarwić jajniki w 2% wodnym octanie uranylu (UA) przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Roztwór UA należy przefiltrować przed użyciem; Unikaj światła podczas barwienia en bloc. Przygotować 2% OsO4 z wodą uzdatnioną metodą odwróconej osmozy (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przepłukać próbki w ddH2O 4 razy, delikatnie mieszając, po 10 minut każda.</li>
	<li>Odwodnić jajniki w stopniowanej serii etanolowej (30%, 50%, 70%, 95% i dwa razy 100%, 10 min każdy roztwór), a następnie zrównoważyć je w dwóch inkubacjach (10 min) w tlenku propylenu.</li>
	<li>W celu infiltracji żywicą należy inkubować próbki w mieszaninie 50% tlenku propylenu/50% ciekłej żywicy epoksydowej przez noc w temperaturze 4 °C. Próbki infiltrować 100% żywicą epoksydową z 3 zmianami (1 h każda zmiana) z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Zanurz jajniki w 100% żywicy epoksydowej i polimeryzuj żywicę w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.</li>
</ol>
5. Ultramikrotomia
<ol>
	<li>Przycinanie blokowe i kontrola próbek za pomocą mikroskopu świetlnego
	<ol>
		<li>Przytnij bloki próbki do kształtu piramidy za pomocą żyletki.</li>
		<li>Ciąć odcinki o grubości 1-2 μm za pomocą noża szklanego lub diamentowego.</li>
		<li>Przenieś sekcje na szkiełko z kroplą wody, a następnie podgrzej szkiełko na płycie grzejnej, aż sekcje spłaszczą się i przylgną do powierzchni szkiełka podczas parowania wody.</li>
		<li>Przykryj sekcje kroplą 1% błękitu toluidynowego O i podgrzej je na gorącej płycie przez ~10 s. Opłucz szkiełko bieżącą wodą, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Sprawdź skrawki pod zwykłym mikroskopem świetlnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie, zbieranie i barwienie ultracienkich sekcji.
	<ol>
		<li>Ciąć ultracienkie odcinki o grubości 50-70 nm za pomocą noża diamentowego. Przenieś sekcje z łodzi wodnej z nożem na siatkę lub jednoszczelinowe siatki miedziane.</li>
		<li>Zabarwić sekcje w 2% UA przez 8 min. Myć kratki w ruchu ddH2O przez 30 s.</li>
		<li>Skrawki należy barwić 1% roztworem ołowiu przez 6 minut. Myć sekcje w działaniu ddH2O przez 1 minutę i wysuszyć na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Gromadzenie i analiza danych
<ol>
	<li>Zbieraj dane TEM za pomocą odpowiedniego oprogramowania, np. Digital Micrograph (więcej szczegółów w Tabeli materiałów).</li>
	<li>Eksploatacja oscyloskopu przy napięciu 80 kV. Włóż siatkę próbki do oscyloskopu, gdy próżnia jest gotowa.</li>
	<li>Włącz wiązkę, klikając Światło w menu. Obracaj pokrętłem intensywności na lewym panelu sterowania, aż czas automatycznej ekspozycji wyniesie ~1 s. Kliknij Start Acquire, aby uzyskać ostateczny obraz.</li>
	<li>Twórz trójwymiarowe modele elektromagnetyczne przy użyciu pakietu do przetwarzania, modelowania i wyświetlania obrazów typu open source (IMOD).</li>
</ol>
7. Barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Umyj wypreparowane jajniki (krok 2.16) w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml z 1 ml 1x PBS uzupełnionym 0,5% Triton X-100 (PBST). Umieść probówki na wytrząsarce w celu mieszania przy 40 obr./min przez 10 min. Pozwól rurkom stać w stojaku, a jajniki opadają grawitacyjnie. Zastąp pranie świeżym PBST i powtórz dwukrotnie.</li>
	<li>Trawić tkanki za pomocą 2 μg/ml proteinazy K i 0,1% dodecylosiarczanu sodu przez 10 minut w temperaturze pokojowej w PBST.</li>
	<li>Przepłukać strawione jajniki w PBST trzy razy przez 10 minut każde płukanie.</li>
	<li>Inkubować jajniki z 10% surowicą końską w PBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe od 1 do 100 w roztworze blokującym (10% surowicy końskiej w PBS z 0,5% Triton X-100). Jajniki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Umyj jajniki w PBST trzy razy przez 10 minut każde płukanie.</li>
	<li>Inkubować jajniki z przeciwciałami drugorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:300 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Umyj jajniki w PBST trzy razy, upewniając się, że pierwsze i trzecie płukanie trwa 10 minut. Wybarwić jądra jajników za pomocą Hoechst 33342 w rozcieńczeniu 1:300 w PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej w drugim płukaniu.</li>
	<li>Zamontuj jajniki na szkiełkach. 
	UWAGA: Mocowanie zapobiegające blaknięciu może być używane do przedłużania sygnałów fluorescencyjnych.</li>
</ol>

<ol><li>Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea+for+high-resolution+histology+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy.</a> Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).</li>
<li>Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+the+photoreceptor+of+the+planarian+Dugesia+dorotocephala.+I.+Normal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye.</a> Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).</li>
<li>Ishii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+the+protonephridial+flame+cell+of+the+freshwater+planarian+Bdellocephala+brunnea%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea.</a> Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).</li>
<li>Morita, M., Best, J. B., Noel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+studies+of+planarian+regeneration%3A+I.+Fine+structure+of+neoblasts+in+Dugesia+dorotocephala%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala.</a> Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).</li>
<li>Hyman, L. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHyman%2C+LH+%22The+invertebrates%3A+Platyhelminthes+and+Rhynchocoela%2C+the+acoelomate+Bilateria%22">The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria</a>. 2, 550(1951).</li>
<li>Higuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+categorization+of+fluorescence+activated+cell+sorted+planarian+stem+cells+by+ultrastructural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis.</a> Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).</li>
<li>Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+to+characterize+the+hermaphroditic+reproductive+system+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Developmental Biology. 11, 69(2011).</li>
<li>Handberg-Thorsager, M., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+nanos-like+gene+Smednos+is+expressed+in+germline+and+eye+precursor+cells+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+D-tryptophan+as+a+bioactive+substance+for+postembryonic+ovarian+development+in+the+planarian+Dugesia+ryukyuensis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis.</a> Scientific Reports. 7, 45175(2017).</li>
<li>Maezawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+D-amino+acid+oxidase+is+involved+in+ovarian+development+during+sexual+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction.</a> Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).</li>
<li>Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+planarian+reproductive+system+through+characterization+of+Schmidtea+mediterranea+CPEB+homologs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs.</a> Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+origin+of+the+germline+stem+cells+as+revealed+by+the+expression+of+nanos-related+gene+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians.</a> Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).</li>
<li>Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lophotrochozoan-specific+nuclear+hormone+receptor+is+required+for+reproductive+system+development+in+the+planarian%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian.</a> Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).</li>
<li>Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nanos+function+is+essential+for+development+and+regeneration+of+planarian+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+hormone+receptor+and+lipid+metabolism+axis+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+reproductive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs.</a> bioRxiv. , 279364(2018).</li>
<li>Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+direct+germline+development+and+somatic+gonad+function+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians.</a> PLoS Biology. 14, 1002457(2016).</li>
<li>Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+defects+caused+by+Smed-boule+RNA-interference+reveal+that+egg+capsule+deposition+occurs+independently+of+fertilization%2C+ovulation%2C+mating%2C+or+the+presence+of+gametes+in+planarian+flatworms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms.</a> PLoS Genetics. 12, 1006030(2016).</li>
<li>Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+premeiotic+function+for+boule+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).</li>
<li>Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+and+the+role+of+symmetrical+dimethylarginine+in+chromatoid+bodies+of+planarian+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells.</a> Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).</li>
<li>Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+in+planarians+identifies+novel+regulators+of+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development.</a> Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+analyses+of+planarian+meiosis+implicates+a+novel%2C+double-membraned+vesiculation+process+in+nuclear+envelope+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown.</a> bioRxiv. , 620609(2019).</li>
<li>Grudniewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signatures+of+somatic+neoblasts+and+germline+cells+in+Macrostomum+lignano%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano.</a> Elife. 5, 20607(2016).</li>
<li>Wudarski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-living+flatworm+Macrostomum+lignano%5BTitle%5D)+AND+%22Evodevo%22%5BJournal%5D)">The free-living flatworm Macrostomum lignano.</a> Evodevo. 11, 5(2020).</li>
<li>Wudarski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transgenesis+and+annotated+genome+sequence+of+the+regenerative+flatworm+model+Macrostomum+lignano%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano.</a> Nature Communications. 8 (1), 2120(2017).</li>
<li>Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaezawa%2C+T+%22Reproductive+and+Developmental+Strategies%3A+The+Continuity+of+Life%22">Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life</a>. Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. , Springer. Japan, Tokyo. 175-201 (2018).</li>
<li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11861-11865 (2003).</li>
<li>Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+%22soaking+method%22+for+RNA+interference+in+the+planarian+Dugesia+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica.</a> Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).</li>
<li>Rouhana, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+by+feeding+in+vitro-synthesized+double-stranded+RNA+to+planarians%3A+methodology+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics.</a> Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Te oparte na fiksacji procedury preparowania wypławków jajników ułatwią zrozumienie mejozy oocytów, a także rozwoju i regeneracji jajników. Rozmiary oocytów i ich somatycznych komórek podporowych mogą wynosić od 20 μm do 50 μm. Metody oparte na rozbiorach zapewnią dostęp do nienaruszonych komórek pojedynczego jajnika, którego nie można osiągnąć metodą sekcji lub całościowym montowaniem. Protokół ten ułatwi badanie nienaruszonej anatomii wypławków jajnika i biologii komórek jajowych w rozdzielczości komórkowej i subkomórk...

Anatomia płaska została zbadana za pomocą TEM w wielu tkankach1,2,3,4,5,6. Niewiele uwagi poświęcono jednak jajnikom czy oocytom. Niedostatek literatury na temat oocytów wynika częściowo z trudności w dostępie do tych komórek, co sprawia, że biologia wypławków oocytów jest w dużej mierze niezbadana. Narzędzia molekularne odkryły wiele mechanizmów regulacyjnych rozwoju jajników u wypławków za pomocą mikroskopii świetlnej lub fluorescencyjnej7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Wszystkie te eksperymenty przeprowadzano na całych robakach lub wycinkach histologicznych całych robaków. Protokoły barwienia przeciwciał i hybrydyzacji in situ na całych robakach obejmują rozległe etapy wybielania, mycia i oczyszczania tkanek, które są czasochłonne i zajmą kilka dni.
Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest zapewnienie dostępu do nienaruszonych, wypreparowanych wybrzuszeń jajników i oocytów, co usunie konieczność wybielania lub cięcia histologicznego i skróci czas mycia i oczyszczania tkanek w barwieniu przeciwciał i hybrydyzacji in situ. Wypreparowane jajniki poprawią również penetrację sondy lub przeciwciał oraz zwiększą głębokość i jakość obrazowania w mikroskopach świetlnych i elektronowych. Dostęp do wypreparowanych jajników i oocytów umożliwia prowadzenie badań w zakresie biologii komórki w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej z całymi, nienaruszonymi oocytami. Niedawne badanie na wypreparowanych jajnikach wypławkowych po raz pierwszy scharakteryzowało mejozę wypławków oocytów za pomocą TEM i mikroskopii konfokalnej21. Prace dostarczyły kompleksowego opisu nowego zjawiska zachodzącego podczas mejozy, zwanego pęcherzykiem otoczki jądrowej.
Tutaj prezentujemy szczegółowe procedury w sekcji wypławków jajników. Etap fiksacji był wystarczający, aby zachować strukturę komórek jajnika do preparacji i dalszej manipulacji (tj. przetwarzania do analizy TEM i mikroskopu świetlnego). Biorąc pod uwagę ich podobieństwo w budowie ciała i architekturze tkanek, protokół ten powinien być również szeroko informacyjny dla badania oocytów i ich jąder u kilku innych gatunków Platyhelminthes (np. rodzaju Dugesia lub Polycelis). Protokół ten jest prawdopodobnie nieistotny dla Macrostomum lignano ze względu na ich małe rozmiary i prawie przezroczystą architekturę ciała, co pozwoli na bezpośrednią obserwację jajnika i oocytów22,23,24. Obszar ciała, w którym znajdują się jajniki, jest bardziej rozpoznawalny optycznie (np. ciemniejszy pigment lub jaśniejszy pigment) u niektórych gatunków (np. Dugesia ryukyuensis9,25) niż S. mediterranea. Badania na tych gatunkach mogą w mniejszym stopniu opierać się na przedstawionych tutaj wytycznych dotyczących lokalizacji jajników u S. mediterranea, ale wykorzystują warunki fiksacji i rozwarstwienia.

<table><tbody><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td>Klasa EM</td></tr><tr><td>2% Wodna</td><td>mikroskopia elektronowa</td> OsO4 Nauki <td>19152</td><td></td></tr><tr><td>50% aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16320</td><td></td></tr><tr><td>Mikrografia cyfrowa</td> klasy EM <td>Gatan Inc.</td><td></td><td>Wersja 2.33.97.1, zbieranie danych TEM</td></tr><tr><td>Żywica Epon</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>14120</td><td>Embed 812 Zestaw, płyn, żywica epoksydowa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ted Pella</td><td>19207</td><td>Denaturowany</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Octan ołowiu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td></td><td></td>6080564</tr><tr><td>MilliQ woda</td><td></td><td></td><td>uzdatniona metodą odwróconej osmozy</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Diamond Anti Blaknięcie Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36965</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>75569</td><td>Klasa EM</td></tr><tr><td>&nbsp; Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>92319</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai G2 Spirit BioTWIN</td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa 541093</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Dostęp do komórek rozrodczych pozwala na badanie rozwoju komórek rozrodczych, mejozy i rekombinacji. Biotyp płciowy wypławka słodkowodnego, Schmidtea mediterranea, jest potężnym modelem bezkręgowców do badania specyfikacji epigenetycznej komórek rozrodczych. W przeciwieństwie do dużej liczby jąder i męskich komórek rozrodczych, wypławki jajowe są stosunkowo trudne do zlokalizowania i zbadania, ponieważ są tylko dwa jajniki, każdy z 5-20 oocytami. Głębsza lokalizacja w obrębie wypławka i brak ochronnych tkanek nabłonkowych również utrudniają bezpośrednią sekcję jajników wypławkowych. 
Ten protokół wykorzystuje krótki krok fiksacji, aby ułatwić lokalizację i rozbiór wypławków jajników do dalszej analizy w celu przezwyciężenia tych trudności. Wypreparowany jajnik nadaje się do badania ultrastrukturalnego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i barwienia immunologicznego przeciwciał. Technika preparacji opisana w tym protokole pozwala również na eksperymenty z zaburzeniami genów, w których jajniki są badane w różnych warunkach interferencji RNA (RNAi). Bezpośredni dostęp do nienaruszonych komórek rozrodczych w jajniku osiągnięty dzięki temu protokołowi znacznie poprawi głębokość i jakość obrazowania oraz umożliwi komórkowe i subkomórkowe badanie biologii oocytów.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu została opisana przez Guo i współpracowników21. Kluczem do udanej dysekcji jest prawidłowa identyfikacja pigmentacji jajników oraz punktów orientacyjnych dotyczących ich położenia. Strategia tej metody polega na przejściu od orientacji w szerokim obszarze do zlokalizowania konkretnego miejsca. Aby to osiągnąć, należy w pierwszej kolejności opierać się na wzorach pigmentacji grzbietowej i brzusznej (Rycina 1A,B</str...

Ten protokół przedstawia kroki podjęte w celu przeprowadzenia sekcji jajników u wypławków słodkowodnych, Schmidtea mediterranea. Wypreparowane jajniki są kompatybilne z barwieniem immunologicznym przeciwciał i analizą ultrastrukturalną z transmisyjną mikroskopią elektronową w celu zbadania biologii komórek jajowych i komórek somatycznych, zapewniając głębię i jakość obrazowania, które wcześniej były niedostępne.

Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, ...

Celem tej metody jest wypreparowanie jajników wypławka Schmidtea mediterranea w celu komórkowej i subkomórkowej analizy biologii oocytów za pomocą TEM lub barwienia przeciwciałami. Protokół ten wykorzystuje krótki etap fiksacji, aby ułatwić lokalizację i rozwarstwienie wypławków jajników, co zapewni głębię i jakość obrazowania, które wcześniej były niedostępne. Największą walką dla kogoś, kto nigdy wcześniej nie wykonywał tej techniki, będzie zlokalizowanie jajników po fiksacji.Pomocne będzie zapoznanie się z anatomią wypławków płciowych przed eksperymentem. Przygotuj się do eksperymentu, karmiąc wypławki płciowe organiczną pastą z wątroby dwa razy w tygodniu, aby osiągnąć dojrzałość płciową. Traktuj dojrzałe płciowo robaki 5% N-acetylo-L-cysteiną lub NAC w naczyniu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Zastąp NAC 10 mililitrami świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i utrwal robaki na godzinę w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu potrząsając. Rozpocznij sekcję 10 minut po dodaniu 4% paraformaldehydu, ponieważ robaki są naprawiane. Obserwuj pigmentację nabłonka, aby zlokalizować brzuszne sznury nerwowe, które pojawiają się jako dwie linie o jaśniejszej pigmentacji biegnące od przednich zwojów głowowych w kierunku ogona.Zlokalizuj przypuszczalne jajniki, obserwując pigmentację i potwierdź ich położenie. Za pomocą dwóch noży chirurgicznych wykonaj nacięcia z tyłu i z przodu jajników, aby całkowicie usunąć przednie i tylne fragmenty robaka. Użyj jednego noża do zakotwiczenia robaka, a drugiego noża do rozwarstwienia.Wyczyść nóż używany do wykonywania nacięć. Aby oddzielić dwa jajniki, przeciąć środkową linię fragmentu jajnika, a następnie odwrócić fragment brzuszną stroną w dół. Użyj dwóch par spiczastych pęset typu 5-SA, aby oderwać tkankę grzbietową, aby odsłonić jelito.Delikatnie usuń gałęzie jelit znajdujące się nad tkankami brzusznymi za pomocą końcówki pęsety lub miękkiej szczoteczki, aby odsłonić jajnik. Usuń otaczające tkanki, aby usunąć jajnik. Wyjmij jajniki i przenieś je do 1,5 mililitrowej tubki do przemycia 1 mililitrem PBS.Wzory pigmentacji grzbietowej i brzusznej wykorzystano do zlokalizowania położenia jajników. Nadmiar tkanki był usuwany krok po kroku. Po odsłonięciu jajnika otaczająca tkanka została odcięta.Jajniki zawierające wiele typów komórek somatycznych wykorzystano zarówno do analizy ultrastrukturalnej, jak i barwienia immunofluorescencyjnego. Wypreparowane jajniki pozwalają na wysokiej jakości obrazowanie anatomii komórkowej i subkomórkowej oocytów. Procedura ta powinna pozwolić na eksperymenty z interferencją RNA w celu zbadania molekularnych regulacji biologii oocytów.Technika ta doprowadziła do odkrycia nowego zjawiska w oocytach płazińców, polegającego na tym, że otoczka jądrowa rozpada się na pęcherzyki otaczające białka jądrowe, zamiast pozostać nienaruszona, czyli zamknięta mitoza lub rozpadać się na kawałki, czyli otwarta mitoza.

planarian-ovary-dissection-for-ultrastructural-analysis-antibody

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje procedurę identyfikacji i wycinania narządów z dorosłego danio pręgowanego.

Disekcja organów dorosłej rybki zebrafish

Sposób, w jaki nisze i komórki macierzyste tworzą się podczas rozwoju, jest istotnym zagadnieniem o praktycznym znaczeniu. W jajniku Drosophila komórki macierzyste linii zarodkowej oraz ich nisze somatyczne powstają podczas rozwoju larwalnego. Niniejszy film prezentuje sposób preparowania, barwienia i montowania gonad samic larw Drosophila w późnym trzecim stadium larwalnym (LL3).

Disekcja i barwienie jajników larw Drosophila

Tutaj prezentujemy adaptację metody pasywnej CLARITY i rekonstrukcji 3D do wizualizacji naczyń włosowatych jajników i naczyń włosowatych pęcherzyków w nienaruszonych jajnikach myszy.

Trójwymiarowa rekonstrukcja architektury naczyniowej jajnika myszy z pasywnym czyszczeniem CLARITY

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Przedstawiono metodę mikrodysekcji jajowodu myszy, która pozwala na pobranie poszczególnych segmentów przy zachowaniu integralności RNA. Ponadto opisano nieenzymatyczną procedurę dysocjacji komórek jajowodowych. Metody te są odpowiednie do późniejszej analizy genów i białek funkcjonalnie różnych segmentów jajowodów i zdysocjowanych komórek jajowodowych.

Mikrodysekcja i dysocjacja mysiego jajowodu: identyfikacja poszczególnych segmentów i izolacja pojedynczych komórek

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Protokół demonstruje prostą i łatwą metodę sekcji, odpowiednią dla dzikich wędrownych samic owadów schwytanych za pomocą pułapek z reflektorami. Technika ta może znacznie wyjaśnić ten sam gatunek, porównując obie tkanki rozrodcze, a mianowicie worek godowy i rozwój jajników samic owadów typu dzikiego.

Sekcja i klasyfikacja rozwoju jajników u samic owadów typu dzikiego

W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.

Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka

Poznaj metodę rozwarstwiania wypławków jajnika u Schmidtea mediterranea do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał. Technika umożliwia wysokiej jakości obrazowanie komórek jajowych.

Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał

Przeglądaj więcej filmów