Rozwarstwienie wypławków jajnika do analizy ultrastrukturalnej i barwienia przeciwciał
10 września 2021
Ten protokół przedstawia kroki podjęte w celu przeprowadzenia sekcji jajników u wypławków słodkowodnych, Schmidtea mediterranea. Wypreparowane jajniki są kompatybilne z barwieniem immunologicznym przeciwciał i analizą ultrastrukturalną z transmisyjną mikroskopią elektronową w celu zbadania biologii komórek jajowych i komórek somatycznych, zapewniając głębię i jakość obrazowania, które wcześniej były niedostępne.
Celem tej metody jest wypreparowanie jajników wypławka Schmidtea mediterranea w celu komórkowej i subkomórkowej analizy biologii oocytów za pomocą TEM lub barwienia przeciwciałami. Protokół ten wykorzystuje krótki etap fiksacji, aby ułatwić lokalizację i rozwarstwienie wypławków jajników, co zapewni głębię i jakość obrazowania, które wcześniej były niedostępne. Największą walką dla kogoś, kto nigdy wcześniej nie wykonywał tej techniki, będzie zlokalizowanie jajników po fiksacji.
Pomocne będzie zapoznanie się z anatomią wypławków płciowych przed eksperymentem. Przygotuj się do eksperymentu, karmiąc wypławki płciowe organiczną pastą z wątroby dwa razy w tygodniu, aby osiągnąć dojrzałość płciową. Traktuj dojrzałe płciowo robaki 5% N-acetylo-L-cysteiną lub NAC w naczyniu w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Zastąp NAC 10 mililitrami świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu i utrwal robaki na godzinę w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu potrząsając. Rozpocznij sekcję 10 minut po dodaniu 4% paraformaldehydu, ponieważ robaki są naprawiane. Obserwuj pigmentację nabłonka, aby zlokalizować brzuszne sznury nerwowe, które pojawiają się jako dwie linie o jaśniejszej pigmentacji biegnące od przednich zwojów głowowych w kierunku ogona.
Zlokalizuj przypuszczalne jajniki, obserwując pigmentację i potwierdź ich położenie. Za pomocą dwóch noży chirurgicznych wykonaj nacięcia z tyłu i z przodu jajników, aby całkowicie usunąć przednie i tylne fragmenty robaka. Użyj jednego noża do zakotwiczenia robaka, a drugiego noża do rozwarstwienia.
Wyczyść nóż używany do wykonywania nacięć. Aby oddzielić dwa jajniki, przeciąć środkową linię fragmentu jajnika, a następnie odwrócić fragment brzuszną stroną w dół. Użyj dwóch par spiczastych pęset typu 5-SA, aby oderwać tkankę grzbietową, aby odsłonić jelito.
Delikatnie usuń gałęzie jelit znajdujące się nad tkankami brzusznymi za pomocą końcówki pęsety lub miękkiej szczoteczki, aby odsłonić jajnik. Usuń otaczające tkanki, aby usunąć jajnik. Wyjmij jajniki i przenieś je do 1,5 mililitrowej tubki do przemycia 1 mililitrem PBS.
Wzory pigmentacji grzbietowej i brzusznej wykorzystano do zlokalizowania położenia jajników. Nadmiar tkanki był usuwany krok po kroku. Po odsłonięciu jajnika otaczająca tkanka została odcięta.
Jajniki zawierające wiele typów komórek somatycznych wykorzystano zarówno do analizy ultrastrukturalnej, jak i barwienia immunofluorescencyjnego. Wypreparowane jajniki pozwalają na wysokiej jakości obrazowanie anatomii komórkowej i subkomórkowej oocytów. Procedura ta powinna pozwolić na eksperymenty z interferencją RNA w celu zbadania molekularnych regulacji biologii oocytów.
Technika ta doprowadziła do odkrycia nowego zjawiska w oocytach płazińców, polegającego na tym, że otoczka jądrowa rozpada się na pęcherzyki otaczające białka jądrowe, zamiast pozostać nienaruszona, czyli zamknięta mitoza lub rozpadać się na kawałki, czyli otwarta mitoza.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje preparatykę jajników u słodkowodnego planarii Schmidtea mediterranea, mającą na celu umożliwienie analizy komórkowej i subkomórkowej biologii oocytów. Metoda ta poprawia jakość i głębokość obrazowania dzięki zastosowaniu takich technik jak transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) oraz immunostaining z użyciem przeciwciał.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Analiza oocytów
- Biologia planariów
Wstęp
- Anatomia płaskostek rozmnażających się płciowo jest kluczowa dla przeprowadzenia skutecznej sekcji.
- Karmienie płaskostek organiczną pastą wątrobianą sprzyja osiągnięciu dojrzałości płciowej.
- Położenie jajników określa się na podstawie wzorców pigmentacji nabłonka.
Zastosowane metody
- Metody dyssekcji chirurgicznej
- Słodkowodna planaria Schmidtea mediterranea
- Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) i barwienie immunofluorescencyjne
Główne wyniki
- Efektywna lokalizacja i wypreparowanie jajników z płaskuniek rozmnażających się płciowo.
- Wysokiej jakości obrazowanie struktur komórkowych i typów komórek somatycznych.
- Metoda umożliwia prowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem interferencji RNA w celu badania regulacji molekularnych.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia nową technikę analizy komórek rozrodczych u planariów.
- Pozwala ono na pogłębienie wiedzy na temat biologii oocytów i stanowi wsparcie dla przyszłych badań genetycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezpośredni dostęp do nienaruszonych jajników planariów umożliwia analizę rozwoju komórek zarodkowych w wysokiej rozdzielczości, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Niniejszy protokół ułatwia ilościowe obrazowanie i analizę molekularną biologii oocytów, zwiększając wiarygodność predykcyjną w badaniach linii zarodkowej. Podejście to ma na celu wsparcie walidacji celów oraz genomiki funkcjonalnej w procesach badawczych biologii rozrodu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę rozwoju komórek rozrodczych oraz procesów mejozy.
- Wspiera walidację funkcjonalną zaburzeń genów poprzez interferencję RNA w oocytach.
- Zwiększa klarowność mechanistyczną w celu wyboru i minimalizacji ryzyka związanego z celami reprodukcyjnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzację przygotowania nienaruszonych jajników do późniejszego obrazowania oraz analiz opartych na przeciwciałach.
- Umożliwia powtarzalną analizę ilościową struktur komórkowych i podkomórkowych.
- Pozwala na rzetelną ocenę funkcji genów w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad epigenetyką linii zarodkowej i architekturą komórkową.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną celów rozrodczych.
- Oferuje predykcyjne spostrzeżenia na temat konserwowanych mechanizmów biologii oocytów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół sekcji integruje się z wczesnymi etapami odkrywania i walidacji celów, umożliwiając późniejsze analizy ultrastrukturalne oraz immunobarwienie. Wspiera on przepływy pracy od testowania hipotez po ocenę funkcji genów w systemach linii zarodkowej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia prowadzenie badań opartych na hipotezach dotyczących specyfikacji komórek zarodkowych i regulacji mejozy.
- Przesiewanie: Dostarcza gotową do analizy tkankę jajnika do obrazowania ilościowego i przesiewania przeciwciał.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze odczyty komórkowe i subkomórkowe do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy podstawowe odkrycia z przedkliniczną oceną celów terapeutycznych w obszarze rozrodu.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół dla różnorodnych badań nad linią zarodkową i perturbacjami genetycznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celów komórek zarodkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy sekcji jajników i obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w ramach portfela biologii rozrodu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów linii zarodkowej i badań nad funkcjami genów z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu anatomii planariów oraz technik sekcji.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury transmitacyjnej mikroskopii elektronowej oraz immunobarwienia.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności przygotowania tkanek i obrazowania.
- Można zastosować odpowiednie modyfikacje dla innych bezkręgowych lub modelowych systemów linii zarodkowej.
- Metoda jest ograniczona przez niewielką liczbę i głębokie położenie oocytów planariów.
