Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo
20 listopada 2021
Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.
Naczynia krwionośne mózgu to złożona sieć przenikających się tętnic, naczyń włosowatych i żyłek wstępujących. Naczynia te są otoczone komórkami ściennymi, takimi jak perycyty otaczające powłokę, które wyrażają aktynę alfa mięśni gładkich i znajdują się w pierwszych czterech gałęziach od przenikających tętnic. Używamy transgenicznych myszy Acta2-RCaMP 1.07 do wizualizacji stanów przejściowych wapnia w tych komórkach poprzez ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia RCaMP.
Wapń odgrywa dużą rolę w kurczeniu się tych komórek i kontroli przepływu krwi. Perycyty kapilarne znajdują się dalej w sieci naczyniowej i mogą być znakowane w innych modelach transgenicznych. Skupiamy się jednak na otoczce perycytów tą metodą.
Naszym myszom wszczepiono chirurgicznie przewlekłe okno czaszkowe, które umożliwia dostęp do układu naczyniowego mózgu w celu obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy niezbędne etapy przygotowania i wstrzyknięcie żyły ogonowej, a następnie dwie metody obrazowania fotonowego i analityczne potrzebne do uzyskania danych dotyczących wapnia w perycytach i informacji o przepływie krwi u znieczulonych zwierząt. Do wstrzyknięcia cewnika do żyły ogonowej wymagane są następujące elementy: strzykawki insulinowe, 15-centymetrowy kawałek rurki PE10, igły o rozmiarze 30, gaza, sól fizjologiczna, kleszcze, zielony barwnik dekstranowy fluoresceiny, szczypce i nożyczki.
Mamy również igłę ze znieczuleniem ketaminowym ksylazyną, którą wstrzykniemy przed obrazowaniem, ponieważ jest lepsza niż izofluran do pomiarów przepływu krwi. Za pomocą szczypiec oderwij igłę o rozmiarze 30 od piasty. Ostrożnie włożyć igłę w koniec rurki PE10 przymocowanej do strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną.
To jest cewnik do wstrzykiwań. Znieczulij mysz izofluranem i nałóż żel I-Lube. Umieść pole rękawic z ciepłą wodą na ogonie, aby rozszerzyć żyłę boczną.
Po oczyszczeniu ogona etanolem włóż igłę do żyły i delikatnie wstrzyknij sól fizjologiczną przez cewnik, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona. Zamień strzykawkę na cewniku na strzykawkę wypełnioną barwnikiem dekstranu fluoresceinowego. Powoli wstrzyknij barwnik, aby upewnić się, że do probówki nie dostały się pęcherzyki.
Zastrzykać strzykawkę z dekstranem strzykawką z solą fizjologiczną i przepłukać rurkę, aż w probówce nie pozostanie barwnik. Usunąć igłę i docisnąć gazą. Wstrzyknąć znieczulenie ketaminą ksylazyną do obrazowania.
Trzymając główkę myszy zamocowaną na poduszce grzewczej, wyczyść okno czaszki za pomocą aplikatorów dentystycznych. Nałóż żel ultradźwiękowy na okienko i ustaw ostrość przez obiektyw mikroskopu dwufotonowego. Do obrazowania dwóch fotonów używamy mikroskopu z dostrajanym laserem tytanowo-szafirowym do fluorescencji, wzbudzenia i fotopowielaczy do wykrywania emisji.
W oprogramowaniu mikroskopu ustaw długość fali na 990 nanometrów, aby wzbudzić zarówno RCaMP, jak i dekstran fluoresceinowy. Następnie ustaw moc lasera, regulując napięcie ogniwa pockel i czułość detektora PMT. Skanowanie na żywo z tymi parametrami i wyższą rozdzielczością można zobaczyć dodatnie komórki muralu RCaMP i fluorescencyjnie znakowane osocze krwi.
Zaleca się uzyskanie stosu głębokości w celu prawidłowego zlokalizowania perycytów w sieci naczyniowej. Po skupieniu się na górnej części tkanki w pobliżu naczyń PO, ustaw to jako punkt zerowy i górę stosu serii Zed, a następnie skup się w dół tkanki na żądanej głębokości i ustaw to jako spód stosu. Moc lasera musi być dostosowana tak, aby rosła, gdy mikroskop przesuwa się głębiej przez stos.
Otwierając serię Zed w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, połącz dwa kanały jako kolorowe obrazy i przeskanuj stos w poszukiwaniu interesujących perycytów i naczyń krwionośnych. Wybierz interesujące obszary, które zawierają perycyty i zapisz pozycje, aby pomóc w ponownym zlokalizowaniu tych miejsc w przyszłych sesjach obrazowania. Aby zebrać i przesunąć zdarzenie wapnia w perycytach, zwiększ szybkość akwizycji do ponad 10 klatek na sekundę.
Ustaw czas trwania obrazowania na 60 sekund i zaktualizuj ścieżkę zapisu, podając unikalną nazwę pliku. Powiększ optycznie naczynie, aby uwzględnić niższą rozdzielczość i uzyskać bliższy widok na perycyt. Zdobądź serię T.
Aby zmierzyć średnicę naczynia krwionośnego i prędkość czerwonych krwinek, wybierz skanowanie liniowe, aby rozpocząć jednowymiarowe skanowanie za pomocą mikroskopu. Najpierw ustaw czas trwania skanowania w milisekundach. Następnie narysuj linię, która przecina interesujące nas naczynie i porusza się równolegle wzdłuż naczynia.
Spowoduje to wygenerowanie kimografu średnicy naczynia po lewej stronie i smug czerwonych krwinek poruszających się po naczyniu po prawej. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać pełną listę programów i pakietów używanych w tym protokole. Najpierw ręcznie wybierz interesujące Cię obszary w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.
Załaduj plik serii T, weź średnią ze stosu i utwórz kolorowy obraz. Wybierz narzędzie wielokąta i obrysuj widoczne struktury otaczające perycyty, takie jak soma i wyrostki. Nadaj każdemu interesującemu regionowi unikalną nazwę i zapisz je jako folder zip, który można później załadować w oprogramowaniu do programowania.
Otwórz oprogramowanie do programowania i upewnij się, że foldery pakietów przetwarzania obrazu znajdują się w ścieżce. Zaimportuj serię wapnia T do oprogramowania do programowania i zdefiniuj, co znajduje się na każdym kanale. W tym przypadku jest to sygnał komórkowy na kanale pierwszym i osocze krwi na kanale drugim.
Wykreśl dane w formie filmu w oprogramowaniu do programowania, aby ułatwić wizualizację. W celu usunięcia zielonych fluorescencyjnych z dekstranu fluoresceinowego, który przenika do czerwonego kanału RCaMP, należy rozmieszać kanały w pakiecie do przetwarzania obrazu. Najpierw wybierz region, który zawiera tylko fluorofor 1, w tym przypadku RCaMP.
Po drugie, wybierz region, który zawiera tylko fluorofor 2, fluoresceinę w osoczu. Na koniec wybierz obszar tła, który nie ma ani fluoroforu. W ten sposób generowana jest matryca wkładu spektralnego, która jest stosowana do każdego piksela w każdym kanale.
Znacząco poprawia lokalizację sygnału RCaMP, co poprawi wykrywanie zdarzeń wapniowych w tych strukturach. Istnieje wiele sposobów analizowania danych obrazowania wapnia w pakietach do przetwarzania obrazu. Najpierw uruchom analizę sygnalizacji komórkowej na niezmieszanym filmie wapnia i załaduj interesujące regiony z folderu zip, które zostały wcześniej ręcznie wybrane z perycytów.
Ustaw współczynnik skali na jeden, ponieważ nie trzeba zmieniać rozmiaru regionów. Po przetworzeniu wygeneruj wykresy każdego ROY i znormalizowane ślady wapnia w różnych kolorach. Jeśli kod nie wykrywa większości zdarzeń wapnia w poszczególnych śladach, zmodyfikuj wbudowane parametry w polu optymalizacji, takie jak zmniejszenie progu dla danych filtrowanych krótkoprzepustowo do trzykrotności odchylenia standardowego okresu linii bazowej, który jest pierwszymi 30 ramkami serii T.
W celu wykrycia i sklasyfikowania sygnałów, znormalizowany ślad wapnia jest filtrowany długoprzepustowo i pasmowoprzepustowo, co pomaga wygładzić dane dotyczące amplitudy i oszacowań, ale także określić, czy sygnały są pojedynczymi pikami, wieloma pikami czy płaskowyżami. Wydrukuj dane jako plik CSV do dalszej analizy statystycznej. Przeprowadź analizę sygnalizacji komórkowej po raz drugi na niezmieszanym filmie wapnia i wybierz automatyczną identyfikację obszaru zainteresowania na podstawie aktywności i zmiany fluorescencji w trzech wymiarach: X, Y i czasie.
Wykreśl wyniki procesu, aby wyświetlić zidentyfikowane obszary zainteresowania w różnych kolorach. Jeśli algorytm nie wykryje ROY, które są wyraźnie widoczne gołym okiem na filmie, zmodyfikuj wbudowane parametry, takie jak zwiększenie filtra Gaussa, który wygładza dane w czasie i zmniejszenie progu znajdowania ROY do trzykrotności odchylenia standardowego linii bazowej. Narysuj ROY jako film w celu dalszej wizualizacji.
Wydrukuj dane jako plik CSV do dalszej analizy statystycznej. Zaimportuj plik danych kimografu ze skanowaniem liniowym do oprogramowania do programowania i zdefiniuj, co znajduje się na każdym kanale. Uruchom funkcję analizy średnicy w skanowaniu linii, co spowoduje otwarcie okna wyboru obszaru odpowiadającego średnicy w kimografie.
Narysuj ramkę poza granicami fluorescencyjnych kimografu, która odpowiada średnicy naczynia. Przetwarzaj tę klasę danych, aby zmierzyć pełną szerokość przy połowie maksimów dla średnicy naczynia i wygenerować wykres. Następnie uruchom analizę prędkości w analizie transformacji i narysuj ramkę wewnątrz obramowania fluorescencyjnych kimografu.
Przetwarzaj tę klasę danych w celu obliczenia prędkości, strumienia i gęstości liniowej czerwonych krwinek. Wydrukuj wyniki przepływu krwi jako plik CSV do dalszej analizy. Ręczne wybieranie struktur komórkowych pozwala na wykrycie wahań wapnia w tych regionach, w tym różnych typów pików sygnału, takich jak pojedyncze piki i wiele pików, po tym, jak znormalizowane ślady wapnia zostaną przefiltrowane dolnoprzepustowo i pasmowoprzepustowe.
Dodatkowo, obszary zainteresowania są identyfikowane poprzez grupowanie aktywnych pikseli, w których intensywność fluorescencji zmienia się w czasie, za pomocą algorytmów przetwarzania obrazu. Można to zastosować do dowolnego dynamicznego sygnału komórkowego, dostosowując czas, próg i parametry przestrzenne tak, aby obejmowały oczekiwany rozmiar i kształt sygnału. Zmniejszenie progu identyfikacji sygnału powoduje znalezienie większej liczby obszarów zainteresowania.
Czyste, hemodynamiczne kimografy są analizowane w celu zmierzenia średnicy i prędkości czerwonych krwinek w naczyniach krwionośnych w pobliżu otaczających perycytów. Średnicę oblicza się od pełnej szerokości przy połowie maksimum świetlówek. Prędkość czerwonych krwinek jest przybliżona na podstawie smug utworzonych z nieoznakowanych czerwonych krwinek, gdzie kąt jest wprowadzany do przemiany radonu w celu obliczenia prędkości.
Kimografy niskiej jakości, w których występuje nasycenie fluorescencyjne, słaby stosunek sygnału do szumu lub ruch pola obrazowania, tworzą niewiarygodne wykresy z punktami błędów, oznaczonymi jako czerwone krzyżyki, w których nie można określić danych. Jakość uzyskanych danych ma kluczowe znaczenie dla dobrego wyniku, a postępowanie zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole zapewnia dobre wyniki. W tym filmie przedstawiamy procedurę połączonego obrazowania wapnia perycytów otaczających mózg i pomiarów przepływu krwi za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych.
Techniki te są przydatne w rozwiązywaniu problemów dotyczących fizjologii i lokalizacji komórek ściennych w sieci naczyniowej mózgu, ale można je dostosować do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki w mózgu lub innym układzie narządów.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób pozyskiwania i analizy danych z obrazowania fluorescencyjnego poziomu wapnia w pericytach otaczających mózg oraz pomiary przepływu krwi u znieczulonych myszy. Dzięki zastosowaniu myszy transgenicznych Acta2-RCaMP 1.07 do wizualizacji, metoda ta umożliwia badaczom analizę przejściowych zmian stężenia wapnia w komórkach muralnych. Opisane metody można zaadaptować do badania różnych typów komórek oraz ich roli fizjologicznej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Fizjologia komórki
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Unaczynienie mózgu składa się z tętniczek, kapilar i żyłek, otoczonych przez komórki muralne.
- Otaczające je perycyty wykazują ekspresję alfa-aktyny mięśni gładkich i odgrywają rolę w regulacji przepływu krwi.
- Niniejsza metoda umożliwia wizualizację dynamiki wapnia w tych komórkach muralnych oraz powiązanych z nimi naczyniach krwionośnych.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowej metodologii obrazowania przejściowych zmian poziomu wapnia w pericytach.
- Umożliwienie badania fizjologicznej roli pericytów w przepływie krwi w mózgu.
- Opracowanie protokołu możliwego do adaptacji do innych typów komórek w celu przeprowadzenia podobnych badań.
Zastosowane metody
- Obrazowanie dwufotonowe dynamiki wapnia u myszy transgenicznych w znieczuleniu.
- Przygotowanie obejmuje wykonanie chronicznego okna czaszkowego oraz kaniulację żyły ogonowej w celu iniekcji barwnika.
- Pozyskiwanie danych polega na pomiarze aktywności perycytów i przepływu krwi przy użyciu zaawansowanych technik obrazowania.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie zdarzeń wapniowych w pericytach otaczających naczynia wraz z danymi dotyczącymi przepływu krwi.
- Zwiększona lokalizacja sygnałów RCaMP dzięki zastosowaniu macierzy wkładu widmowego poprawia dokładność danych.
- Metodologia ta umożliwia dynamiczną wizualizację odpowiedzi naczyniowych i sygnalizacji wapniowej.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia niezawodny protokół pozwalający zrozumieć role fizjologiczne komórek muralnych.
- Zastosowane techniki obrazowania dostarczają informacji na temat dynamiki wapnia istotnej dla regulacji przepływu krwi.
- Wnioski z badań znajdują zastosowanie w szerszym zakresie mechanizmów neuronalnych, plastyczności oraz biologii naczyniowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia bezpośredni pomiar dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w perycytach mózgowych, kluczowym typie komórek w sprzężeniu neuronaczyniowym i regulacji przepływu krwi. Poprzez powiązanie aktywności perycytów z parametrami hemodynamicznymi, metoda ta zapewnia odczyt mechanistyczny służący do walidacji celów w procesie odkrywania leków działających w OUN. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka związanego z celami naczyniowymi, dostarczając ilościowych i powtarzalnych danych na temat sygnalizacji komórkowej oraz funkcji naczyniowej in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar przejściowych zmian stężenia wapnia w perycytach otaczających naczynia, które regulują przepływ krwi w kapilarach.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów molekularnych w komórkach muralnych poprzez korelację sygnałów wapniowych z średnicą naczyń oraz prędkością erytrocytów.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego, łącząc zdarzenia wapniowe perycytów z parametrami hemodynamicznymi, co wspomaga mechanistyczny screening związków chemicznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszych badań przesiewowych poprzez ustanowienie powtarzalnego okna dla chronicznego obrazowania in vivo.
- Wyniki ilościowe: Generuje dane dotyczące śladów wapnia oraz parametry hemodynamiczne (średnica, prędkość) odpowiednie do standaryzacji analizy i porównań międzylaboratoryjnych.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w różnych badaniach poprzez umożliwienie mapowania obszarów zainteresowania oraz automatyczną detekcję sygnału za pomocą algorytmów przetwarzania obrazu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Łączy dynamikę wapnia w pericytach z dysfunkcją naczyniowo-nerwową, która jest charakterystyczna dla modeli chorób neurodegeneracyjnych i niedokrwiennych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi, zapewniając spójny odczyt aktywności komórek muralnych w różnych fazach eksperymentalnych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Redukuje niejednoznaczność w modulacji celów poprzez korelację sygnalizacji wewnątrzkomórkowej z funkcjonalnymi efektami naczyniowymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć — od testowania hipotez dotyczących celu po walidację przedkliniczną — stanowiąc funkcjonalny pomost między sygnalizacją komórkową a fizjologią na poziomie tkankowym.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar dynamiki wapnia w perycytach, które są kluczowymi regulatorami mózgowego przepływu krwi.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy wyników, w tym znormalizowane ślady wapnia i kymografy hemodynamiczne, służące do oceny wpływu związków.
- Analityka: Zapewnia pliki wyjściowe w formacie CSV gotowe do analizy statystycznej z rozdzielonych sygnałów, co umożliwia ilościowe porównanie częstotliwości, amplitudy i kinetyki zdarzeń wapniowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość w badaniach przedklinicznych dzięki możliwości longitudinalnego obrazowania tego samego okna czaszkowego w różnych punktach czasowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania dzięki ustandaryzowanym procedurom przygotowania chirurgicznego, wstrzykiwania barwnika oraz procesom przetwarzania obrazów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji celów naczyniowo-nerwowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji kaniulacji żyły ogonowej, ustawień dwufotonowych oraz protokołów rozdzielania widm (spectral unmixing).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie danych o funkcjonalnym zaangażowaniu celu powiązanych z odczytami hemodynamicznymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o odpowiedź naczyniową pośredniczoną przez perycyty.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie obsługi transgenicznych myszy, przeprowadzania operacji okna czaszkowego oraz mikroskopii dwufotonowej.
- Metoda opiera się na regulowanych systemach laserowych szafirowych z tytanem, fotopowielaczach oraz oprogramowaniu do przetwarzania obrazów służącym do rozplatania widmowego i analizy sygnału.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znieczulenia (ketamina/ksylazyna) oraz procedur wstrzykiwania barwników pomiędzy zespołami w celu zminimalizowania artefaktów przepływu.
- Stosowanie metody w odniesieniu do innych typów komórek lub organów wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów, w szczególności w zakresie wyboru promotora i kompatybilności wskaźników.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak limit głębokości obrazowania oraz przenikanie sygnału (bleed-through), które są niwelowane poprzez zastosowanie macierzy wkładu widmowego i odejmowanie tła.
