Name: Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w perycytach otaczających naczynia mózgu u myszy transgenicznych Acta2-RCaMP 1.07 in vivo. Technika dwufotonowa pozwala badać dynamikę sygnałów wapniowych i regulację przepływu krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

J. Meza jest wspierany przez stypendia z Mitacs i Research Manitoba. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez Canadian Institutes for Health Research, Research Manitoba, Manitoba Medical Service Foundation, fundusze na rozpoczęcie działalności z University of Manitoba i Brain Canada za pośrednictwem Canada Brain Research Fund, przy wsparciu finansowym Health Canada i Azrieli Foundation. Poglądy wyrażone w niniejszym dokumencie niekoniecznie reprezentują poglądy Ministra Zdrowia lub Rządu Kanady.

<ol><li>Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+Developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Berthiaume, A. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+pericytes+in+vivo+maintains+capillary+coverage+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+compartmentalization+of+functional+hyperemia+from+the+synapse+to+the+pia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia.</a> Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li>
<li>Gonzales, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+pericytes+determine+the+direction+of+blood+flow+at+capillary+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).</li>
<li>Hartmann, D. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+structure+and+distribution+in+the+cerebral+cortex+revealed+by+high-resolution+imaging+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice.</a> Neurophotonics. 2 (4), 041402(2015).</li>
<li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).</li>
<li>Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+blood+flow+in+the+normal+and+ischemic+brain+is+controlled+by+arteriolar+smooth+muscle+cell+contractility+and+not+by+capillary+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes.</a> Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).</li>
<li>28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021).</li>
<li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> JoVE. (143), e56297(2019).</li>
<li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li>
<li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIPS%3A+an+extensible+toolbox+for+cellular+and+hemodynamic+two-photon+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis.</a> Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li>
<li>Nilsson, H., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotion%3A+mechanisms+and+physiological+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+interventions%22%5BJournal%5D)">Vasomotion: mechanisms and physiological importance.</a> Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).</li>
<li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+arbors+in+layer+II+%2F+III+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecna metoda dostarcza szczegółowych informacji na temat wstrzykiwania żyły ogonowej myszy za pomocą cewnika, akwizycji obrazu za pomocą mikroskopu dwufotonowego dla stosów głębokości, filmów sygnalizacji wapniowej komórek, tworzenia kymografów hemodynamicznych oraz analizy wapniowej i hemodynamicznej za pomocą naszych algorytmów przetwarzania obrazu17 (Figura 1). Techniki te mają kilka zalet, które poprawiają wyniki obrazowania in vivo i skracają czas, zasoby i stres zwierząt podczas sesji. Po pierwsze, użycie cewnika do wstrzykiwania żyły ogonowej zapewnia większą kontrolę nad igłą, strzykawką i ilością substancji wstrzykiwanej do krążenia myszy. Dodatkowo zapobiega wstrzykiwaniu barwnika w tkankę ogona, oszczędzając drogie odczynniki. Po drugie, używamy transgenicznych myszy, które wykazują ekspresję genetycznie kodowanych czujników wapnia w osłonie perycytów i pokazują, jak zlokalizować je w sieci naczyniowej mózgu za pomocą głębokościowego stosu z, co ułatwia identyfikację i relokację komórek w kolejnych sesjach obrazowania w dłuższej perspektywie. Jest to ważny czynnik w badaniach perycytów i zapewnia prawidłową klasyfikację komórek 6,7. Po trzecie, podajemy nasze parametry do zbierania filmów wapniowych i hemodynamicznych danych ze skanowania liniowego, które są dobrym punktem wyjścia do pomiaru dynamicznych sygnałów komórkowych. Na koniec przedstawiamy nasze algorytmy przetwarzania obrazu17, kompleksowy zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu, który zawiera wiele podejść do wstępnego przetwarzania obrazu (takich jak rozmieszanie widmowe), analiza obrazu wapnia i analiza hemodynamiczna (średnica, prędkość itp.). Algorytmy te mogą generować wykresy w celu szybkiej i łatwej wizualizacji danych, jednocześnie minimalizując poziom wiedzy użytkownika wymaganej do analizy wyników. Co więcej, można go zautomatyzować za pomocą kilku wierszy kodu, aby szybko przetwarzać wsadowo wiele zestawów danych o tych samych parametrach. Może to potencjalnie poprawić wizualizację danych i czas zainwestowany przez badacza.
Kluczem do zebrania dobrych danych obrazowania wapnia jest dostosowanie mocy lasera i ustawień PMT w celu uzyskania wyraźnego sygnału fluorescencji, ale także zbieranie danych z wystarczającą liczbą klatek na sekundę, aby uchwycić całe zdarzenie wapniowe. Dane w tym protokole zostały pozyskane z prędkością 10-11 klatek na sekundę, co pozwala uchwycić wolniejsze oscylacje wapnia w perycytach osłonki. Istnieje również kilka kroków podczas analizy, które mogą poprawić wynik analizy. Po pierwsze, rozmieszanie widmowe jest korzystne, jeśli widma emisyjne fluoroforów w znacznym stopniu się pokrywają (ryc. 2). Fluoresceina-dekstran został użyty w tym protokole, ponieważ jest to opłacalny i dostępny na rynku koniugat dekstranu, który jest powszechnie stosowany do pomiarów hemodynamicznych5. Dezmiksowanie spektralne pomaga oczyścić dane w celu lepszego wykrywania sygnałów wapniowych, ale można również zastosować alternatywne fluorofory o węższych widmach emisyjnych. Po drugie, ręczny wybór struktur komórkowych jako ROI (ryc. 3) jest przydatny do klasyfikowania zdarzeń wapniowych w różnych regionach subkomórkowych, takich jak soma lub gałęzie procesu. Wybór zwrotu z inwestycji na podstawie aktywności (ryc. 4)16 dostarcza więcej informacji przestrzennych i czasowych na temat poszczególnych zdarzeń związanych z wapniem. Może to być pomocne przy określaniu częstotliwości zdarzeń wapniowych na danym obszarze lub propagacji zdarzeń do innych obszarów komórkowych. Wykorzystanie oprogramowania programistycznego do analizy danych obrazowych może zaoszczędzić badaczom wiele godzin czasu podczas przetwarzania wsadowego, ale wymaga pewnej początkowej inwestycji czasowej w dostosowanie parametrów w celu uzyskania optymalnych wyników. Najważniejszymi czynnikami są oczekiwany rozmiar (wμm2) obszaru aktywnego, a także czas trwania sygnału (należy określić minimalny czas sygnału i maksymalny czas sygnału). Badacze muszą najpierw przeanalizować kilka przykładowych filmów z serii T, aby jak najlepiej określić, które parametry pasują do ich danych. Wreszcie, słabej jakości dane uzyskane pod mikroskopem mogą znacznie utrudnić analizę wapnia i hemodynamiki (ryc. 6). Dlatego na początku należy zadbać o optymalizację ustawień akwizycji mikroskopu. Mając na uwadze te czynniki, protokół ten można dostosować do obrazowania wapnia lub analizy innych dynamicznych sygnałów komórkowych (np. fluorescencyjnego sodu, potasu, metabolitów lub wahań napięcia) w innych tkankach lub typach komórek.
Istnieje kilka ograniczeń tego protokołu. Po pierwsze, dane są zbierane w znieczuleniu, które wpływa na aktywność mózgu i może wpływać na przepływ krwi. Podobne obrazowanie można wykonać u obudzonych myszy, które są szkolone do akceptowania fiksacji głowy w celu uzyskania bardziej fizjologicznych rezultatów. Dodatkowo należy pamiętać, że 2-wymiarowe obrazy trójwymiarowej komórki i naczynia krwionośnego zbieramy in vivo. Dlatego możemy uchwycić tylko frakcję zdarzeń wapniowych w tych komórkach lub przepływ krwi w jednej sekcji naczynia krwionośnego na raz.
Innym ograniczeniem, na które należy zwrócić uwagę, jest to, że dwufotonowe obrazowanie wapnia jest wrażliwe na artefakty ruchu, w których ruch do i z płaszczyzny ogniskowej może być mylony z wahaniami wapnia. Protokół ten został wykonany w znieczuleniu, co ogranicza ruch zwierzęcia; Jednak artefakty ruchowe mogą być wprowadzane przez częstość oddechów myszy, tętno, możliwy obrzęk tkanek, a w przypadku poszycia perycytów, skurcz naczyń lub wazomotorię 4,6,18,19. Artefakty ruchu można złagodzić za pomocą kilku strategii. Pakiety przetwarzania obrazu używane w tym protokole obejmują opcjonalny krok korekcji ruchu, który wykorzystuje silnik konwolucyjny 2D do wyrównania obrazów w serii T w oparciu o widzialne unaczynienie13,17. Klatki ze znaczącymi zmianami w płaszczyźnie ogniskowej są identyfikowane przez ten algorytm i mogą być wyłączone z analizy. Dodatkowo możliwe jest stosowanie strategii statystycznych w ramach pakietów przetwarzania obrazowania, takich jak wskaźnik Z podczas generowania śladów fluorescencyjnych w celu normalizacji fluktuacji wapnia wywołanych ruchem20. Najbardziej niezawodnym podejściem do uwzględnienia artefaktów ruchu w obrazowaniu dwufotonowym jest połączenie ekspresji dwóch wskaźników fluorescencyjnych w tej samej komórce, takich jak wskaźnik wapnia (np. GCaMP) i reporter fluorescencyjny (np. mCherry), który jest niezależny od wapnia. Wahania w reporterze fluorescencyjnym można następnie przypisać ruchowi i są one odejmowane od sygnału wskaźnika wapnia w celu normalizacji artefaktów ruchu.
Celem tego protokołu jest zapewnienie jasnego zrozumienia, w jaki sposób zbierać optymalne dane dotyczące obrazowania wapnia i przepływu krwi in vivo oraz przedstawienie nowych metod i narzędzi analitycznych, które naukowcy mogą wdrożyć w celu poprawy swoich wyników. Techniki te można zastosować do badania roli różnych populacji perycytów w kontroli przepływu krwi lub w różnych stanach chorobowych mózgu. Te parametry obrazowania mogą być również wykorzystywane do badania przepływu wapnia i krwi w innych typach komórek i układach narządów, a podobne zasady mają zastosowanie do innych technik obrazowania dynamicznego, które są możliwe dzięki innym genetycznie kodowanym czujnikom, poza wapniem.

Unaczynienie ośrodkowego układu nerwowego składa się z przenikających tętniczek, naczyń włosowatych i żyłek wstępujących. W ramach tej sieci komórki ścienne, takie jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych, otaczają tętniczki i perycyty, rozszerzają procesy komórkowe wzdłuż pierwszych gałęzi tętniczek i naczyń włosowatych1. Wydaje się, że perycyty pełnią kilka ról w mózgu, w tym utrzymanie bariery krew-mózg1,2, migracja i ruchliwość3, potencjalne właściwości komórek macierzystych i regulacja przepływu krwi w mózgu4,5,6. Wiele funkcjonalnych ról perycytów zostało powiązanych z fluktuacjami wewnątrzkomórkowego wapnia, które mogą regulować rozszerzanie lub kurczenie się tych komórek4,5,6.
Kilka ostatnich badań ustaliło kryteria identyfikacji różnych typów perycytów mózgu7,8. Komórki ścienne w pierwszych 4 gałęziach tętniczek penetrujących otaczają perycyty w oparciu o ekspresję białka kurczliwego α aktyny mięśni gładkich (αSMA) i ich wystających, jajowatych somatów z procesami, które owijają się wokół naczyń krwionośnych7,8,9. Aby zobrazować fluktuacje wapnia w otaczających perycytach, protokół ten wykorzystuje nową transgeniczną linię myszy, Acta2-RCaMP1.07, znaną również jako Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10. Myszy te wykazują ekspresję czerwonego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, RCaMP1.07, w komórkach eksprymujących αSMA (komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycyty otaczające powłokę). Kolonie hodowlane są utrzymywane poprzez krzyżowanie zwierząt niebędących nosicielami z hemizygotami. RCaMP1.07 jest czerwonym białkiem fluorescencyjnym z domeną wiążącą kalmodulinę, która zwiększa fluorescencję podczas wiązania z wewnątrzkomórkowym calcium10,11. Protokół ten określa etapy połączonego obrazowania wapnia perycytów otaczających i pomiarów przepływu krwi za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych, w tym procedury wstrzykiwania barwników fluorescencyjnych do żył ogonowych, akwizycję obrazu mikroskopowego u znieczulonych myszy oraz analizę danych za pomocą platform programistycznych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Techniki te są przydatne w rozwiązywaniu problemów dotyczących fizjologii komórek szkieletowych, ale można je dostosować do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki w mózgu lub innym układzie narządów.
10-miesięczna samica myszy Acta2-RCaMP1.07 została użyta do eksperymentu przedstawionego w tym artykule. Mysz przeszła operację przewlekłego okna czaszkowego i głowy po implantacji dwa miesiące wcześniej. Szczegóły dotyczące protokołu chirurgicznego zostały omówione w poprzednich badaniach12,13 a podobne procedury zostały przeprowadzone w innych wcześniej opublikowanych protokołach14,15. Naczynia krwionośne są znakowane zielonym fluoresceiną-dekstranem (70 000 MW, roztwór anionowy, 2,5% w/v) wstrzykiwanym dożylnie. Barwnik ten jest opłacalny i łatwo dostępny ze źródeł komercyjnych, ale ma szersze spektrum emisji, które może pokrywać się z emisją RCaMP i przebijać podczas akwizycji obrazu mikroskopowego. Kroki do rozmieszania widmowego są opisane w sekcji 4 poniżej, aby obejść ten zakaz, ale można również zastosować inne zielone barwniki o węższych widmach emisyjnych, takie jak te oparte na EGFP.

<table><tbody><tr><td>Acta2-RCaMP1.07</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>28345</td><td>W protokole wideo użytym modelem zwierzęcym jest samica myszy w wieku 10 miesięcy, 1 dzień.</td></tr><tr><td>Pakiet aplikatorów (zwykłych)</td><td>Bisco</td><td>X-80250P</td><td></td></tr><tr><td>BioFormats dla MATLAB</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Określany w tym protokole jako "pakiety do przetwarzania obrazu".&nbsp; Dostępne w: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr> <tr><td>CHIPS MATLAB toolbox</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Zdefiniowane w tym protokole jako "algorytmy przetwarzania obrazu". Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: rozszerzalny zestaw narzędzi do komórkowej i hemodynamicznej analizy obrazu dwufotonowego. Neuroinformatyka. 2018; 16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Dostępne w: https://github.com/EIN-lab/CHIPS</td></tr><tr><td>Clear Ultrasound Gel, HealthCare</td><td>Plus</td><td>UGC250</td><td></td>Dextran o średniej lepkości</tr><tr><td>, fluoresceina, 70 000 MW, anionowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70 000 MW, neutralny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lube Plus</td><td>Optixcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FIDŻI</td><td>Obraz J</td><td>NA</td><td>Określany w tym protokole jako "oprogramowanie procesora obrazu".&nbsp; Dostępne w: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GCaMP6sfl/fl</td><td>Platforma</td> mocująca słupki do kierowania Jackson Laboratory <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>University of Zurich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Narketan 100 mg/mL)</td><td>Vetoquinol</td><td>440893</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020b</td><td></td><td>NA</td><td>Określany w tym protokole jako "platforma programistyczna". Dostępne w: https://www.mathworks.com/downloads/</td></tr> <tr><td>Igła 0,3 mm x 25 mm</td><td>Obiektyw BD PrecisionGlide</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>XLUMPLFLN20XW</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td></tr> <tr><td>PDGFR&beta;-CreERT2</td><td>Rurka polietylenowa Jackson Laboratory</td><td>30201</td><td></td></tr><tr><td>, PE10 ID 28mm (0.11") OD 61mm (.024&rdquo;)</td><td>BD Intramedic</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Widok prerii</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna Bruker</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Ultima Mikroskop wielofotonowy in vitro</td><td>Mikroskopia fluorescencyjna Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html Podgrzewacz pod zbiornikiem</td><td>Reptitherm UH</td><td>E169064</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Rompun 20 mg/ml)</td><td>Bayer HealthCare</td><td>2169592</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Ostatnie postępy w biologii białek i genetyce myszy umożliwiły pomiar wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia w komórkach mózgowych in vivo i skorelowanie ich z lokalną hemodynamiką. Protokół ten wykorzystuje transgeniczne myszy, które zostały przygotowane z przewlekłym oknem czaszkowym i wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik wapnia, RCaMP1.07, pod promotorem aktyny α mięśni gładkich, aby specyficznie znakować komórki ścienne, takie jak komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i perycyty otaczające. Przedstawiono kroki, jak przygotować cewnik do żyły ogonowej do dożylnego wstrzyknięcia barwników fluorescencyjnych w celu śledzenia przepływu krwi, a także jak mierzyć hemodynamikę wapnia w perycytach mózgu i miejscowych naczyń krwionośnych (średnica, prędkość czerwonych krwinek itp.) za pomocą dwóch mikroskopii fotonowych in vivo przez okno czaszkowe u myszy znieczulonych ketaminą/ksylazyną. Na koniec przedstawiono szczegółowe informacje na temat analizy fluktuacji wapnia i filmów przepływu krwi za pomocą algorytmów przetwarzania obrazu opracowanych przez Barretta i in. 2018, z naciskiem na to, w jaki sposób procesy te można dostosować do innych danych obrazowania komórkowego.

Fluroscyna-dekstran posiada szerokie widmo emisji, które może przenikać do kanału czerwonego, wpływając na detekcję RCaMP w perycytach otaczających (Ryc. 2A). Rozdzielenie spektralne (spectral unmixing) po akwizycji danych w programie komputerowym redukuje przenikanie fluoresceiny (Ryc. 2B, dół), co poprawia detekcję sygnału wapniowego w kolejnych etapach analizy.
Analiza wapnia z wykorzystaniem algorytmów przetwarzania obrazu zastosowanych w niniejszym protokole umożliwia zastosowanie kilku różnych podejść do identyfikacji ROI oraz wewnątrzkomórkowych fluktuacji wapnia (tzn. sygnałów wapniowych). Ręczny wybór struktur komórkowych pozwala na wykrycie fluktuacji wapnia w tych obszarach (Rycina 3A), w tym różnych rodzajów szczytów sygnału, takich jak szczyty pojedyncze i wielokrotne, po przefiltrowaniu znormalizowanych śladów wapniowych filtrem dolnoprzepustowym i pasmowo-przepustowym (Rycina 3B). Dodatkowo ROI są identyfikowane poprzez grupowanie aktywnych pikseli, w których intensywność fluorescencji zmienia się w czasie, przy użyciu algorytmów przetwarzania obrazu opracowanych przez Ellefsen i wsp. 201416 oraz Barrett i wsp. 201817 (Rycina 4). Metodę tę można zastosować do dowolnego dynamicznego sygnału komórkowego poprzez dostosowanie parametrów czasu, progu oraz parametrów przestrzennych tak, aby objęły one oczekiwaną wielkość i kształt sygnału. Obniżenie progu identyfikacji sygnału pozwala na znalezienie większej liczby obszarów zainteresowania (Rycina 4B).
Wyraźne i przejrzyste kymografy hemodynamiczne mogą być analizowane w celu pomiaru średnicy oraz prędkości RBC w naczyniach krwionośnych w pobliżu otaczających je perycytów (Rycina 5A, B). Średnicę oblicza się na podstawie pełnej szerokości połówkowej maksimum fluorescencji (Rycina 5C). Prędkość RBC szacuje się na podstawie smug powstałych z nieoznakowanych RBC, gdzie kąt jest wprowadzany do transformaty Radona w celu obliczenia prędkości, strumienia (komórki/s) oraz gęstości liniowej (komórki/mm; Rycina 5D). Kymografy słabej jakości, w których występuje nasycenie fluorescencji, niski stosunek sygnału do szumu lub przemieszczenie pola obrazowania (Rycina 6A), generują niewiarygodne wykresy z punktami błędów (czerwone krzyżyki) w miejscach, gdzie dane nie mogą zostać określone (Rycina 6B, C). Jakość pozyskanych danych jest kluczowa dla uzyskania poprawnego wyniku, a przestrzeganie kroków opisanych w niniejszym protokole zapewnia dobre rezultaty.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg" /> 
Rysunek 1. Podsumowanie protokołu.Protokół przedstawia kroki służące do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Protokół podzielony jest na 4 etapy. 1) Przygotowanie procedury: konfiguracja sprzętu i przygotowanie cewnika; 2) Iniekcja do żyły ogonowej; 3) Pozyskiwanie danych za pomocą mikroskopii dwufotonowej; 4) Analiza danych z wykorzystaniem algorytmów przetwarzania obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg" /> 
Rycina 2Odmieszanie spektralne fluoroforów. A) Reprezentatywny obraz średni perycyta otaczającego naczynie krwionośne z ekspresją RCaMP oraz naczynia krwionośnego znakowanego dekstranem z fluoresceiną, uzyskany z akwizycji serii T. Pasek skali= 10 &#181;mB) Góra: Przy analizie poszczególnych kanałów widoczne jest przenikanie sygnału z kanału 2 do kanału 1 (po lewej). Dół: Po odsplątaniu spektralnym (spectral unmixing) przenikanie sygnału uległo zmniejszeniu, a sygnał z RCaMP jest bardziej wyraźny w strukturze perycyta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg" /> 
Rysunek 3Ręcznie wybrane obszary zainteresowania (ROI) i zoptymalizowane przebiegi stężeń wapnia. A) Wyznaczone w użytym oprogramowaniu do przetwarzania obrazów obszary zainteresowania (kształty tęczowe) mogą służyć do identyfikacji przebiegów sygnału wapnia. B) Piki sygnałów z znormalizowanych przebiegów są identyfikowane poprzez filtrowanie danych filtrem dolnoprzepustowym i pasmowym. Próg sygnału zdefiniowano jako 3-krotność odchylenia standardowego okresu bazowego (pierwsze 30 klatek), a każdy pik powyżej tego progu uznano za sygnał (dolny przebieg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg" /> 
Rysunek 4. Zautomatyzowane, oparte na aktywności ROI do analizy wapnia. Te same dane przeanalizowano przy progu wynoszącym 7-krotność odchylenia standardowego linii bazowej (A) oraz 3-krotność odchylenia standardowego linii bazowej (B). Obniżenie progu identyfikacji aktywnych pikseli pozwala na wykrycie większej liczby ROI (B) oraz szczytów sygnału (wykres kołowy) w obrębie perycytów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg" /> 
Rycina 5Pomiary hemodynamiczne kymograficzne. A) Przykład skanu liniowego przez naczynie. B) Przykład wyraźnych kymografów dla średnicy (lewo) i prędkości (prawo). Czarne smugi w prawym pasie fluorescencji odpowiadają erytrocytom. C) Analiza średnicy z wyraźnymi fluktuacjami wazomotorycznymi. D) Analiza prędkości z wykresami, gdzie oś Y = strumień erytrocytów (komórki/s), gęstość liniowa (komórki/mm), prędkość (mm/s), kąt smugi (stopnie), stosunek sygnału do szumu (jednostki umowne, a.u.), a oś X = czas (s). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg" /> 
Rysunek 6. Przedstawienie pomiarów hemodynamicznych o niskiej jakości. A) Przykłady niskiej jakości kymografów z nasyceniem fluorescencji, słabym stosunkiem sygnału do szumu lub przesunięciem pola obrazowania podczas akwizycji. B i C) Wykresy danych dotyczących średnicy i prędkości, analogiczne do Rysunku 7, zawierające punkty błędne (czerwone kropki) wynikające z niskiej jakości kymografów. (obraz E, oś Y=średnica (µm), oś X=czas (sec); obraz F, oś Y=strumień RBC (cells/s), gęstość linii (cells/mm), prędkość (mm/s), kąt smugi (degree), stosunek sygnału do szumu (a.u.), oś X=czas (sec). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Naczynia krwionośne mózgu to złożona sieć przenikających się tętnic, naczyń włosowatych i żyłek wstępujących. Naczynia te są otoczone komórkami ściennymi, takimi jak perycyty otaczające powłokę, które wyrażają aktynę alfa mięśni gładkich i znajdują się w pierwszych czterech gałęziach od przenikających tętnic. Używamy transgenicznych myszy Acta2-RCaMP 1.07 do wizualizacji stanów przejściowych wapnia w tych komórkach poprzez ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia RCaMP.Wapń odgrywa dużą rolę w kurczeniu się tych komórek i kontroli przepływu krwi. Perycyty kapilarne znajdują się dalej w sieci naczyniowej i mogą być znakowane w innych modelach transgenicznych. Skupiamy się jednak na otoczce perycytów tą metodą.Naszym myszom wszczepiono chirurgicznie przewlekłe okno czaszkowe, które umożliwia dostęp do układu naczyniowego mózgu w celu obrazowania. W tym miejscu przedstawiamy niezbędne etapy przygotowania i wstrzyknięcie żyły ogonowej, a następnie dwie metody obrazowania fotonowego i analityczne potrzebne do uzyskania danych dotyczących wapnia w perycytach i informacji o przepływie krwi u znieczulonych zwierząt. Do wstrzyknięcia cewnika do żyły ogonowej wymagane są następujące elementy: strzykawki insulinowe, 15-centymetrowy kawałek rurki PE10, igły o rozmiarze 30, gaza, sól fizjologiczna, kleszcze, zielony barwnik dekstranowy fluoresceiny, szczypce i nożyczki.Mamy również igłę ze znieczuleniem ketaminowym ksylazyną, którą wstrzykniemy przed obrazowaniem, ponieważ jest lepsza niż izofluran do pomiarów przepływu krwi. Za pomocą szczypiec oderwij igłę o rozmiarze 30 od piasty. Ostrożnie włożyć igłę w koniec rurki PE10 przymocowanej do strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną.To jest cewnik do wstrzykiwań. Znieczulij mysz izofluranem i nałóż żel I-Lube. Umieść pole rękawic z ciepłą wodą na ogonie, aby rozszerzyć żyłę boczną.Po oczyszczeniu ogona etanolem włóż igłę do żyły i delikatnie wstrzyknij sól fizjologiczną przez cewnik, aby upewnić się, że igła jest prawidłowo umieszczona. Zamień strzykawkę na cewniku na strzykawkę wypełnioną barwnikiem dekstranu fluoresceinowego. Powoli wstrzyknij barwnik, aby upewnić się, że do probówki nie dostały się pęcherzyki.Zastrzykać strzykawkę z dekstranem strzykawką z solą fizjologiczną i przepłukać rurkę, aż w probówce nie pozostanie barwnik. Usunąć igłę i docisnąć gazą. Wstrzyknąć znieczulenie ketaminą ksylazyną do obrazowania.Trzymając główkę myszy zamocowaną na poduszce grzewczej, wyczyść okno czaszki za pomocą aplikatorów dentystycznych. Nałóż żel ultradźwiękowy na okienko i ustaw ostrość przez obiektyw mikroskopu dwufotonowego. Do obrazowania dwóch fotonów używamy mikroskopu z dostrajanym laserem tytanowo-szafirowym do fluorescencji, wzbudzenia i fotopowielaczy do wykrywania emisji.W oprogramowaniu mikroskopu ustaw długość fali na 990 nanometrów, aby wzbudzić zarówno RCaMP, jak i dekstran fluoresceinowy. Następnie ustaw moc lasera, regulując napięcie ogniwa pockel i czułość detektora PMT. Skanowanie na żywo z tymi parametrami i wyższą rozdzielczością można zobaczyć dodatnie komórki muralu RCaMP i fluorescencyjnie znakowane osocze krwi.Zaleca się uzyskanie stosu głębokości w celu prawidłowego zlokalizowania perycytów w sieci naczyniowej. Po skupieniu się na górnej części tkanki w pobliżu naczyń PO, ustaw to jako punkt zerowy i górę stosu serii Zed, a następnie skup się w dół tkanki na żądanej głębokości i ustaw to jako spód stosu. Moc lasera musi być dostosowana tak, aby rosła, gdy mikroskop przesuwa się głębiej przez stos.Otwierając serię Zed w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, połącz dwa kanały jako kolorowe obrazy i przeskanuj stos w poszukiwaniu interesujących perycytów i naczyń krwionośnych. Wybierz interesujące obszary, które zawierają perycyty i zapisz pozycje, aby pomóc w ponownym zlokalizowaniu tych miejsc w przyszłych sesjach obrazowania. Aby zebrać i przesunąć zdarzenie wapnia w perycytach, zwiększ szybkość akwizycji do ponad 10 klatek na sekundę.Ustaw czas trwania obrazowania na 60 sekund i zaktualizuj ścieżkę zapisu, podając unikalną nazwę pliku. Powiększ optycznie naczynie, aby uwzględnić niższą rozdzielczość i uzyskać bliższy widok na perycyt. Zdobądź serię T.Aby zmierzyć średnicę naczynia krwionośnego i prędkość czerwonych krwinek, wybierz skanowanie liniowe, aby rozpocząć jednowymiarowe skanowanie za pomocą mikroskopu. Najpierw ustaw czas trwania skanowania w milisekundach. Następnie narysuj linię, która przecina interesujące nas naczynie i porusza się równolegle wzdłuż naczynia.Spowoduje to wygenerowanie kimografu średnicy naczynia po lewej stronie i smug czerwonych krwinek poruszających się po naczyniu po prawej. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać pełną listę programów i pakietów używanych w tym protokole. Najpierw ręcznie wybierz interesujące Cię obszary w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu.Załaduj plik serii T, weź średnią ze stosu i utwórz kolorowy obraz. Wybierz narzędzie wielokąta i obrysuj widoczne struktury otaczające perycyty, takie jak soma i wyrostki. Nadaj każdemu interesującemu regionowi unikalną nazwę i zapisz je jako folder zip, który można później załadować w oprogramowaniu do programowania.Otwórz oprogramowanie do programowania i upewnij się, że foldery pakietów przetwarzania obrazu znajdują się w ścieżce. Zaimportuj serię wapnia T do oprogramowania do programowania i zdefiniuj, co znajduje się na każdym kanale. W tym przypadku jest to sygnał komórkowy na kanale pierwszym i osocze krwi na kanale drugim.Wykreśl dane w formie filmu w oprogramowaniu do programowania, aby ułatwić wizualizację. W celu usunięcia zielonych fluorescencyjnych z dekstranu fluoresceinowego, który przenika do czerwonego kanału RCaMP, należy rozmieszać kanały w pakiecie do przetwarzania obrazu. Najpierw wybierz region, który zawiera tylko fluorofor 1, w tym przypadku RCaMP.Po drugie, wybierz region, który zawiera tylko fluorofor 2, fluoresceinę w osoczu. Na koniec wybierz obszar tła, który nie ma ani fluoroforu. W ten sposób generowana jest matryca wkładu spektralnego, która jest stosowana do każdego piksela w każdym kanale.Znacząco poprawia lokalizację sygnału RCaMP, co poprawi wykrywanie zdarzeń wapniowych w tych strukturach. Istnieje wiele sposobów analizowania danych obrazowania wapnia w pakietach do przetwarzania obrazu. Najpierw uruchom analizę sygnalizacji komórkowej na niezmieszanym filmie wapnia i załaduj interesujące regiony z folderu zip, które zostały wcześniej ręcznie wybrane z perycytów.Ustaw współczynnik skali na jeden, ponieważ nie trzeba zmieniać rozmiaru regionów. Po przetworzeniu wygeneruj wykresy każdego ROY i znormalizowane ślady wapnia w różnych kolorach. Jeśli kod nie wykrywa większości zdarzeń wapnia w poszczególnych śladach, zmodyfikuj wbudowane parametry w polu optymalizacji, takie jak zmniejszenie progu dla danych filtrowanych krótkoprzepustowo do trzykrotności odchylenia standardowego okresu linii bazowej, który jest pierwszymi 30 ramkami serii T.W celu wykrycia i sklasyfikowania sygnałów, znormalizowany ślad wapnia jest filtrowany długoprzepustowo i pasmowoprzepustowo, co pomaga wygładzić dane dotyczące amplitudy i oszacowań, ale także określić, czy sygnały są pojedynczymi pikami, wieloma pikami czy płaskowyżami. Wydrukuj dane jako plik CSV do dalszej analizy statystycznej. Przeprowadź analizę sygnalizacji komórkowej po raz drugi na niezmieszanym filmie wapnia i wybierz automatyczną identyfikację obszaru zainteresowania na podstawie aktywności i zmiany fluorescencji w trzech wymiarach: X, Y i czasie.Wykreśl wyniki procesu, aby wyświetlić zidentyfikowane obszary zainteresowania w różnych kolorach. Jeśli algorytm nie wykryje ROY, które są wyraźnie widoczne gołym okiem na filmie, zmodyfikuj wbudowane parametry, takie jak zwiększenie filtra Gaussa, który wygładza dane w czasie i zmniejszenie progu znajdowania ROY do trzykrotności odchylenia standardowego linii bazowej. Narysuj ROY jako film w celu dalszej wizualizacji.Wydrukuj dane jako plik CSV do dalszej analizy statystycznej. Zaimportuj plik danych kimografu ze skanowaniem liniowym do oprogramowania do programowania i zdefiniuj, co znajduje się na każdym kanale. Uruchom funkcję analizy średnicy w skanowaniu linii, co spowoduje otwarcie okna wyboru obszaru odpowiadającego średnicy w kimografie.Narysuj ramkę poza granicami fluorescencyjnych kimografu, która odpowiada średnicy naczynia. Przetwarzaj tę klasę danych, aby zmierzyć pełną szerokość przy połowie maksimów dla średnicy naczynia i wygenerować wykres. Następnie uruchom analizę prędkości w analizie transformacji i narysuj ramkę wewnątrz obramowania fluorescencyjnych kimografu.Przetwarzaj tę klasę danych w celu obliczenia prędkości, strumienia i gęstości liniowej czerwonych krwinek. Wydrukuj wyniki przepływu krwi jako plik CSV do dalszej analizy. Ręczne wybieranie struktur komórkowych pozwala na wykrycie wahań wapnia w tych regionach, w tym różnych typów pików sygnału, takich jak pojedyncze piki i wiele pików, po tym, jak znormalizowane ślady wapnia zostaną przefiltrowane dolnoprzepustowo i pasmowoprzepustowe.Dodatkowo, obszary zainteresowania są identyfikowane poprzez grupowanie aktywnych pikseli, w których intensywność fluorescencji zmienia się w czasie, za pomocą algorytmów przetwarzania obrazu. Można to zastosować do dowolnego dynamicznego sygnału komórkowego, dostosowując czas, próg i parametry przestrzenne tak, aby obejmowały oczekiwany rozmiar i kształt sygnału. Zmniejszenie progu identyfikacji sygnału powoduje znalezienie większej liczby obszarów zainteresowania.Czyste, hemodynamiczne kimografy są analizowane w celu zmierzenia średnicy i prędkości czerwonych krwinek w naczyniach krwionośnych w pobliżu otaczających perycytów. Średnicę oblicza się od pełnej szerokości przy połowie maksimum świetlówek. Prędkość czerwonych krwinek jest przybliżona na podstawie smug utworzonych z nieoznakowanych czerwonych krwinek, gdzie kąt jest wprowadzany do przemiany radonu w celu obliczenia prędkości.Kimografy niskiej jakości, w których występuje nasycenie fluorescencyjne, słaby stosunek sygnału do szumu lub ruch pola obrazowania, tworzą niewiarygodne wykresy z punktami błędów, oznaczonymi jako czerwone krzyżyki, w których nie można określić danych. Jakość uzyskanych danych ma kluczowe znaczenie dla dobrego wyniku, a postępowanie zgodnie z krokami opisanymi w tym protokole zapewnia dobre wyniki. W tym filmie przedstawiamy procedurę połączonego obrazowania wapnia perycytów otaczających mózg i pomiarów przepływu krwi za pomocą dwóch mikroskopów fotonowych.Techniki te są przydatne w rozwiązywaniu problemów dotyczących fizjologii i lokalizacji komórek ściennych w sieci naczyniowej mózgu, ale można je dostosować do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki w mózgu lub innym układzie narządów.

brain-pericyte-calcium-hemodynamic-imaging-transgenic-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

Perycyty kapilarne mózgu odgrywają kluczową rolę w regulacji właściwości bariery krew-mózg i przepływu krwi. Protokół ten opisuje, w jaki sposób perycyty naczyń włosowatych mózgu mogą być izolowane, hodowane, charakteryzowane w odniesieniu do typu komórki i stosowane do badań wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej za pomocą sond fluorescencyjnych.

Posiew perycytów naczyń włosowatych mózgu do cytozolowych pomiarów wapnia i badań obrazowych wapnia

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania wapnia w perycytach otaczających naczynia mózgu u myszy transgenicznych Acta2-RCaMP 1.07 in vivo. Technika dwufotonowa pozwala badać dynamikę sygnałów wapniowych i regulację przepływu krwi.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

Przeglądaj więcej filmów