Name: Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę współkultury do kwantyfikacji fagocytozy makrofagów regulowanej przez mezenchymalne komórki macierzyste z użyciem cząsteczek fluorescencyjnych wrażliwych na pH. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów odporności wrodzonej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez mechanizm NSF Major Research Instrument pod numerami grantów 1626093 i 1919583.

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
<li>Luz-Crawford, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+generate+a+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+population+during+the+differentiation+process+of+Th1+and+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).</li>
<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Analiza fagocytozy przy użyciu biocząstek sprzężonych z barwnikiem wrażliwym na pH jest stosunkowo nowym narzędziem, które okazało się korzystne w porównaniu z tradycyjnymi cząstkami znakowanymi fluorescencyjnie 12,19,20. W przypadku tradycyjnych cząstek znakowanych fluorescencyjnie możliwa jest tylko analiza punktu końcowego. Wykrywanie przeprowadza się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i/lub spektrofluorometrii po umyciu ...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to komórki progenitorowe, które dają początek komórkom tkanki łącznej. MSC są obecne w tkankach dorosłych ssaków i mogą być izolowane ze szpiku kostnego1. Ze względu na swoje właściwości immunomodulujące, komórki te są szeroko badane2. Wczesne badania koncentrowały się na regulacji limfocytów T przez MSC3,4,5,6, ale ostatnio ich regulacja komórek makrofagów (MΦ), głównego składnika komórkowego odporności wrodzonej, zyskała zwiększoną uwagę7,8,9,10, 11,12,13,14. Znaczenie interakcji MSC-MΦ w leczeniu chorób zapalnych podkreśla fakt, że wyczerpanie monocytów/makrofagów niweluje terapeutyczne efekty MSC w modelach zwierzęcych8. W tym przypadku nacisk kładziony jest na interakcję kontaktową MSC z MΦ. MSC mają zdolność regulowania fenotypu MΦ poprzez promowanie przejścia od odpowiedzi zapalnej do przeciwzapalnej, co prowadzi do działań naprawczych tkanek8,9,10,11, i wiele zrobiono, aby zademonstrować te mechanizmy regulacyjne. W innych okolicznościach MSC może wspierać lub nasilać reakcję zapalną wywołaną przez MΦ12,13 i zwiększać aktywność fagocytarną MΦ14,15. Brakuje jednak krytycznych danych, które określałyby mechanizmy i warunki, w jakich MSC reguluje aktywność fagocytarną MΦ.
MΦ mają rodziny receptorów, które rozpoznają albo opsonizowane (przeciwciało lub dopełniacz, pokryte dopełniaczem), albo nieopsonizowane patogeny, co prowadzi do fagocytozy16. Aktywacja i aktywność tego ostatniego jest słabiej zbadana17. W niezapalnym środowisku in vitro, MSC wzmacnia fagocytozę MΦ nieopsonizowanych patogenów13. Jednak rozpoznawanie nieopsonizowanych patogenów przez MΦ może być zmniejszone po ekspozycji na środowisko zapalne wytwarzane przez limfocyty podczas adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. IFN-γ, uwalniany przez komórki NK i limfocyty efektorowe, działa hamująco na fagocytozę MΦ cząstek nieopsonizowanych18. Opracowano model kohodowli w celu zbadania mechanizmów regulacji fagocytozy MΦ przez bezpośredni kontakt z MSC. Celem przedstawionego eksperymentu jest ustalenie, czy MSC reguluje fagocytozę MΦ nieopsonizowanych patogenów po tym, jak MΦ zostały wystawione na działanie IFN-γ (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>96-dołkowa mikropłytka polistyrenowa</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0,4% roztwór błękitu trypanowego</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 ml i 50 ml Stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowa komorowa szklana z nieusuwalnymi studzienkami</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (100X)&nbsp; System obrazowania Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7</td> Albumina surowicy bydlęcej <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane, poddane obróbce kultur tkankowych, powierzchnia 75&nbsp; cm2, skośna szyja, z nasadką, filtrowana</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>Mysza linia komórkowa MSC</td></tr><tr><td>DMEM, wysokoglukozowa</td><td></td> płodowa surowica bydlęca <td>ThermoFisher</td> 11965092<td></td></tr>, <tr><td>kwalifikowana, inaktywowana termicznie</td><td>Hemocytometr ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>Mysz M&Phi; Linia komórkowa</td></tr><tr><td>LADMAC Linia komórkowa</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>Komórki LADMAC wydzielają czynnik wzrostu, czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 (CSF-1).</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do obrazowania żywych komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Zielone biocząstki zymosanu Koniugat</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi IFN-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe filtry próżniowe, 250 ml, 0,2 i mikro; m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe, 0,2 mikrometra</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane poddane kulturom tkankowym, 100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; kwantyfikacja i obrazowanie

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) były tradycyjnie badane pod kątem ich właściwości regeneracyjnych, ale ostatnio na pierwszy plan wysunęły się ich cechy immunoregulacyjne. Oddziałują na komórki odpornościowe i regulują ją. Przedmiotem badań jest regulacja aktywności fagocytarnej makrofagów przez MSC. Fagocytoza makrofagów (MΦ) jest ważną częścią wrodzonej odpowiedzi układu odpornościowego na zakażenie, a mechanizmy, za pomocą których MSC moduluje tę odpowiedź, są aktywnie badane. Przedstawiono metodę badania fagocytozy MΦ nieopsonizowanych cząstek zymosanu sprzężonych z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH podczas jednoczesnej hodowli z MSC. Wraz ze wzrostem aktywności fagocytarnej i zamknięciem znakowanych cząstek zymosanu w kwaśnym środowisku fagolizosomu wzrasta intensywność fluorescencji cząsteczki wrażliwej na pH. Przy odpowiednich długościach fal wzbudzenia i emisji aktywność fagocytarną mierzy się za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego, a dane kinetyczne przedstawia się jako zmiany względnych jednostek fluorescencyjnych w okresie 70 minut. Aby wesprzeć te dane ilościowe, zmiana aktywności fagocytarnej jest wizualizowana za pomocą obrazowania dynamicznego. Wyniki uzyskane przy użyciu tej metody pokazują, że w jednoczesnej hodowli MSC zwiększa fagocytozę MΦ nieopsonizowanego zymozanu zarówno nieleczonego, jak i leczonego IFN-γ MΦ. Dane te uzupełniają obecną wiedzę na temat regulacji MSC wrodzonego układu odpornościowego. Metoda ta może być zastosowana w przyszłych badaniach, aby w pełni nakreślić podstawowe mechanizmy komórkowe i molekularne.

Po obliczeniu średniej ± SEM dla każdej grupy we wszystkich punktach czasowych, dane są prezentowane w formie wykresu liniowego z osią Y jako względną intensywnością fluorescencji i osią X jako czasem. Plik uzupełniający 1 zawiera przykład surowych danych z odczytu kinetycznego płytki 96-dołkowej w formacie arkusza kalkulacyjnego.
W tym badaniu, optymalne wyniki przedstawione w Rysunek 3A i Tabela 3 pokazują, że 1) współhodowla z ...

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

Ta metoda kohodowli pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów kontaktu komórek odpowiedzialnych za regulację fagocytozy makrofagów przez mezenchymalne komórki macierzyste, a tym samym rzucić światło na rolę MSC w regulacji odporności wrodzonej. Technika ta może być stosowana w analizach o wysokiej przepustowości. Biocząstki sprzężone z barwnikami wrażliwymi na pH fluoryzują tylko w kwaśnym środowisku fagolizosomów.Dlatego konieczne jest mycie i hartowanie. Metodę tę można również zastosować do różnych modeli kokultur, które obejmują neutrofile i inne fagocyty. Procedurę zademonstruje Ethan Chetkof, student obecnie pracujący w moim laboratorium.Na początek obserwuj zbieg hodowanych mezenchymalnych komórek macierzystych. Po osiągnięciu 70-80% zbieżności odessać pożywkę wzrostową z hodowanych komórek do 100-milimetrowego naczynia i dodać pięć mililitrów PBS. Po zaessaniu PBS dodaj dwa mililitry 0,05% roztworu EDTA trypsyny i inkubuj komórki przez trzy minuty.Po trzech minutach sprawdź oderwanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu. A jeśli komórki nie zostaną odłączone, ponownie inkubuj przez jedną do dwóch minut. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone, dodaj do płytki pięć mililitrów świeżej pożywki wzrostowej.Po przepłukaniu płytki za pomocą mieszaniny pożywki z trypsyną, za pomocą sterylnej pipety serologicznej zebrać komórki do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie rozpuść komórki przez odwirowanie. Po zassaniu supernatantu ponownie zawieś osad komórkowy w 10 mililitrach świeżej pożywki wzrostowej, delikatnie pipetując w górę iw dół.Do liczenia komórek dodać 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 30 mikrolitrów 0,4% roztworu błękitu trypanowego, a następnie dodać 10 mikrolitrów mieszaniny pod szkiełkiem nakrywkowym komory zliczania hemocytometrów. Pod mikroskopem odwróconym lub mikroskopem jasnego pola policz niebarwione żywe komórki za pomocą soczewki obiektywowej 10X i czterech komór o powierzchni jednego milimetra kwadratowego i oblicz liczbę komórek zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Użyj równania C1V1 równa się C2V2, aby określić pożądaną objętość świeżej pożywki i zawiesiny komórkowej wymaganej do przygotowania zawiesiny komórek o końcowym stężeniu od jednego razy 10 do piątego komórki na mililitr.Za pomocą mikropipetera wielokanałowego dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do dołków płytki 96-dołkowej zgodnie z projektem płytki. Za pomocą mikropipety dodać 530 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego szkiełka komorowego zgodnie z konstrukcją płytki i inkubować przez noc. Przygotuj 10 mililitrów pożywki aktywacyjnej zawierającej interferon gamma o stężeniu 250 nanogramów na mililitr do aktywacji komórek makrofagów w jednym 100-milimetrowym naczyniu.Odessać pożywkę wzrostową z kultur komórkowych makrofagów i przepłukać komórki pięcioma mililitrami pożywki aktywacyjnej pozbawionej interferonu gamma. Po zassaniu pożywki płuczącej w naczyniu doświadczalnym dodać 10 mililitrów pożywki aktywacyjnej uzupełnionej interferonem gamma. W naczyniu kontrolnym dodaj 10 mililitrów pożywki aktywacyjnej bez interferonu gamma, a następnie inkubuj komórki przez 16 do 24 godzin.Pod koniec inkubacji, w celu przygotowania kokultur, usuń pożywkę aktywacyjną z komórek makrofagów i dodaj pięć mililitrów świeżej pożywki wzrostowej. Użyj podnośnika komórek, aby delikatnie zeskrobać komórki i zebrać je do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie należy policzyć komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometrii, a następnie przygotować zawiesiny komórek makrofagów kontrolnych i poddanych działaniu substancji w stężeniu od dwóch razy 10 do piątej komórki na mililitr, jak wykazano wcześniej dla mezenchymalnych komórek macierzystych.Delikatnie odessać pożywkę z dołków doświadczalnych zawierających mezenchymalne komórki macierzyste. Za pomocą mikropipety wielokanałowej dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek makrofagów poddanych działaniu substancji i kontrolnych do odpowiednich studzienek doświadczalnych zgodnie z projektem płytki i inkubować przez noc, jak pokazano. Delikatnie zassać pożywkę z czterościennego szkiełka komorowego zawierającego mezenchymalne komórki macierzyste.Za pomocą mikropipety dodaj 530 mikrolitrów zawiesiny komórek makrofagów do odpowiednich studzienek zgodnie z projektem i inkubuj przez noc. Dodać jeden mililitr pożywki do obrazowania żywych komórek do fiolki zawierającej jeden miligram cząstek Zymosanu i zebrać mieszaninę cząstek pożywki do szklanej probówki hodowlanej. Po przepłukaniu fiolki dodatkowym mililitrem roztworu do obrazowania, przenieś przepłukany pożywkę obrazową do szklanej probówki, a następnie dodaj trzy mililitry dodatkowego roztworu do obrazowania, aby uzyskać 0,2 miligrama na mililitr zawiesiny cząstek Zymosanu.Wiruj zawiesinę Zymosanu za pomocą szybkich impulsów przez 30 do 60 sekund, a następnie użyj sonografu sondy, aby sonikować zawiesinę za pomocą 60 szybkich impulsów. Po zaessaniu pożywki przepłukać dołki eksperymentalne i studzienki ślepe odczynniki 100 mikrolitrami roztworu do obrazowania żywych komórek. Następnie odessać roztwór do obrazowania żywych komórek ze studzienek i dodać 100 mikrolitrów zawiesiny Zymosan.Otwórz tacę na płytki czytnika fluorescencyjnego za pomocą interfejsu panelu dotykowego. Ustaw talerz bez pokrywki w tacce z dołkiem A1 w lewym górnym rogu. Zamknij tacę za pomocą panelu dotykowego i kliknij zielony przycisk odczytu w górnym menu.Aby przeprowadzić test fagocytozy, po przepłukaniu pierwszego dołka doświadczalnego 750 mikrolitrami pożywki obrazowej, dodaj 400 mikrolitrów zawiesiny Zymosanu, pozostawiając pozostałe studzienki w pożywce wzrostowej. Następnie umieść szkiełko na inkubowanym stoliku systemu obrazowania. Użyj oprogramowania do obrazowania.Wybierz opcję Brightfield na karcie lokalizacji, a następnie kliknij ikonę okularu. Po założeniu obiektywu 10X użyj okularu i pokrętła ostrości, aby ustawić ostrość na komórkach. Wybierz kartę pozyskiwania.Otwórz menu rozwijane eksperymentu i wybierz zestaw długości fal, który zawiera zestaw filtrów EGFP, aby pomieścić 509 nanometrów wzbudzenia i 533 nanometry długości fali emisji barwnika wrażliwego na pH. Gdy w timerze pozostaną około dwie minuty, kliknij ikonę 20X w menu obiektywu, aby zmienić obiektyw na 20X, a następnie kliknij menu kanałów, wybierz filtry EGFP, a w menu ekspozycji ustaw czas ekspozycji na 400 milisekund, aby wykryć wrażliwy na pH zielony fluorofor, a następnie kliknij na żywo. Po ustawieniu ostrości kliknij stop, aby wyłączyć światło i zaznacz pole obok górnego ustawienia eksperymentalnego poklatkowego.W menu strategii ustawiania ostrości wybierz programowy autofokus i z menu rozwijanego wybierz ustawienia inteligentne i podstawowe, aby skrócić czas ekspozycji na światło podczas działania autofokusa. W menu poklatkowym ustaw żądaną liczbę akwizycji na 30 do 60, czas interwału na jedną minutę, a następnie kliknij przycisk rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję. Badano wpływ interferonu gamma na kokulturę.Reprezentatywne wyniki pokazują, że kohodowla makrofagów z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi zwiększa aktywność fagocytarną makrofagów. Leczenie interferonem gamma zmniejsza aktywność makrofagów. Jednak w obecności mezenchymalnych komórek macierzystych aktywność fagocytarna makrofagów została częściowo uratowana.W tych badaniach kluczowe znaczenie ma optymalna gęstość komórek. A kiedy komórki makrofagów zostały posiane w zbyt niskiej gęstości, zmiany w intensywności fluorescencji nie zostały wykryte. Gdy komórki makrofagów zostały posiane w dużej gęstości, intensywność fluorescencji gwałtownie wzrosła we wszystkich grupach i nie zauważono różnic.Jedną z najważniejszych rzeczy podczas tej procedury jest zapewnienie, że gęstości komórek są zoptymalizowane i utrzymywane na stałym poziomie między eksperymentami.

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Ten film demonstruje test do badania regulacji fagocytozy makrofagów za pomocą mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w kokulturze. Po jednoczesnej hodowli MSC z makrofagami, nieopsonizowane cząstki zymosanu sprzężone z fluoroforem wrażliwym na pH są dodawane w celu fagocytozy przez makrofagi. Wraz ze wzrostem fagocytozy wzrasta intensywność fluorescencji, co pozwala na określenie regulacji aktywności fagocytarnej za pośrednictwem MSC.

Test do badania regulacji fagocytozy makrofagów przez mezenchymalne komórki macierzyste

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Ten protokół opisuje solidne generowanie makrofagów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz metody ich późniejszej charakterystyki. Ekspresja markerów powierzchniowych komórek, ekspresja genów i testy funkcjonalne są wykorzystywane do oceny fenotypu i funkcji tych makrofagów pochodzących z iPSC.

Produkcja i charakterystyka ludzkich makrofagów z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia metodę trawienia całych oczu do pojedynczej zawiesiny komórkowej w celu wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływu w celu identyfikacji specyficznych jednojądrzastych populacji fagocytarnych oczu, w tym monocytów, mikrogleju, makrofagów i komórek dendrytycznych.

Trawienie całych oczu myszy do wieloparametrowej analizy cytometrycznej przepływowej fagocytów jednojądrzastych

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Poznaj metodę współkultury do kwantyfikacji fagocytozy makrofagów regulowanej przez mezenchymalne komórki macierzyste z użyciem cząsteczek fluorescencyjnych wrażliwych na pH. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów odporności wrodzonej.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Przeglądaj więcej filmów