Name: Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj metodę knockdownu genów za pomocą shRNA w komórkach hematopoetycznych do badania rozwoju komórek dendrytycznych. Protokół ten umożliwia identyfikację czynników transkrypcyjnych regulujących różnicowanie DC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne od Dr. Tz-Ling Chen. Dziękujemy National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Tajwan) za dostarczenie lentiwirusa shRNA (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 i MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Postępowanie z lentiwirusami odbywa się zgodnie z przepisami Departamentu Zdrowia i Bezpieczeństwa Środowiska Wydziału Medycznego Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego.
1. Przygotowanie unieśmiertelnionych linii komórek macierzystych i progenitorowych krwiotwórczych (iHSPCs)
<ol>
	<li>Hodować linię komórkową iHSPC w pełnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 100 ng/mL FL oraz 1 µM β-estradiolu.</li>
	<li>Przesiewać komórki w stosunku 1:10 co 3 dni. 
	​UWAGA: Pełną pożywkę RPMI 1640 przygotować poprzez uzupełnienie o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 x 10-5 M β-merkaptoetanol oraz 10 µg/mL gentamycyny. Rekombinowany mysi FL jest również dostępny w sprzedaży.</li>
</ol>
2. Transdukcja lentiwirusowa
<ol>
	<li>Wysiać iHSPCs z gęstością 1 x 105 komórek/dołek w płytkach 12-dołkowych w 1 mL pożywki kompletnej zawierającej 100 ng/mL FL, 1 µM β-estradiol oraz 8 µg/mL polybrene. 
	UWAGA: Stężenie polybrene zależy od typu komórek i zazwyczaj mieści się w zakresie 4-8 µg/mL.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać lentiwirusa niosącego shRNA przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100. 
	UWAGA: Wektorem lentiwirusowym jest pLKO.1-Puro z markerem selekcyjnym puromycyną (Rycina 1). Sekwencje docelowe shRNA skierowanych odpowiednio przeciwko LacZ, Tcf4 oraz Id2 są wymienione w Tabeli materiałów. MOI jest definiowane jako liczba wirionów dodanych na jedną komórkę podczas infekcji. 
	<img alt="Równanie obliczania MOI; analiza miana wirusa, objętości, całkowitej liczby komórek; schemat formuły." src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Wirować płytki z prędkością 1,100 x g przez 90 min w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Infekcję wspomaganą wirowaniem (spin infection) przeprowadza się przy użyciu rotora z koszyczkami wahadłowymi.</li>
	<li>Inkubować płytkę z zainfekowanymi komórkami przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze. 
	UWAGA: Jeśli komórki są wrażliwe na polybrene, należy wymienić pożywkę na pożywkę kompletną bez polybrene po zakończeniu wirowania.</li>
	<li>Wymienić pożywkę na pożywkę kompletną zawierającą 100 ng/mL FL i 1 µM β-estradiol 24 h po infekcji.</li>
	<li>Po kolejnych 24 h dodać do pożywki 6 µg/mL puromycyny w celu wyselekcjonowania zainfekowanych komórek. 
	UWAGA: Ekspresja genów z transdukowanego wektora lentiwirusowego, w tym genu oporności na puromycynę, trwa zazwyczaj 48 h. Należy upewnić się, że stężenie puromycyny jest zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej.</li>
	<li>Wymieniać pożywkę selekcyjną zawierającą 100 ng/mL FL, 1 µM β-estradiol oraz 6 µg/mL puromycyny co 3 dni i hodować komórki przez co najmniej jeden tydzień, aby namnożyć stabilnie transdukowane komórki iHSPC. 
	​UWAGA: Selekcja puromycyną zazwyczaj zaczyna działać po 48 h, a czas trwania selekcji zależy od typu komórek.</li>
</ol>
3. Pomiar wydajności wyciszenia za pomocą odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR)
<ol>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA z 1 x 107 shLacZ, shTcf4, oraz shId2 stabilne wyciszenie genów w komórkach iHSPC przy użyciu komercyjnego odczynnika do ekstrakcji RNA i wytrącanie RNA z warstwy wodnej izopropanolem, a następnie przemywanie osadu RNA 75% etanolem.</li>
	<li>Rozpuścić RNA (~ 5 µg) z 5 µL z wody H2O traktowanej DEPC2i dostosować stężenie do 1 µg/µL.</li>
	<li>Pobrać 1-3 µg RNA, wymieszać z H2O traktowaną DEPC2do uzyskania objętości końcowej wynoszącej 17.4 µL, dodać 1 µL z 1 jednostki/µL DNazę I wolną od RNaz i inkubować przez 20 min w 37 °C. 
	UWAGA: Ten etap służy do trawienia DNA genomowego w próbkach RNA.</li>
	<li>Dodaj 1 µL 20 mM EDTA do próbek RNA, inkubować w 65 °C przez 10 min w celu inaktywacji DNazy I, a następnie bezzwłocznie umieścić próbki RNA w 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 11.6 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 µL starterów oligo(dT) (45 µM), 6 µL z 5x 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. bufor do oddzielania nici, 3 µL dNTP (2 mM), 0.6 µL inhibitora RNazy (50 jednostek/µL) i 1 µL odwróconej transkryptazy (200 j./µL) do próbek RNA i inkubować w 40 °C przez 1 h.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję, podgrzewając do 70 °C przez 10 min, a następnie rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną za pomocą 30 µL wodoru2O.</li>
	<li>Pobierz 2 µL rozcieńczonej mieszaniny reakcyjnej RT jako matrycy DNA i poddać ją amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów przeciwko Tcf4 lub Id2 (patrz Tabela 1 (dla parametrów termocyklera). 
	UWAGA: Sekwencje starterów znajdują się w Tabela materiałów.</li>
</ol>
4. Różnicowanie in vitro stabilnych linii komórkowych iHSPC z wyciszeniem genów
<ol>
	<li>Utrzymać stabilne pojedyncze wyciszenie genów LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) lub Id2 (shId2) w iHSPC w pełnej pożywce zawierającej 100 ng/mL FL i 1 µM β-estradiolu.</li>
	<li>Zebrać niedróżnicowane iHSPC shLacZ, shTcf4 i shId2 do probówki o pojemności 15 mL i odwirować przez 5 min przy 500 x g w celu sformowania osadu komórkowego.</li>
	<li>Odlać supernatant i dodać 10 mL PBS, aby wypłukać komórki. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Resuspendować i wysiać komórki iHSPC w gęstości 2 x 105 komórek/mL do płytki 12-dołkowej w 1 mL pełnej pożywki zawierającej wyłącznie 100 ng/mL FL.</li>
	<li>Po trzech dniach dodać 1 mL świeżej pełnej pożywki zawierającej 100 ng/mL FL.</li>
	<li>Dwa dni później przeanalizować zróżnicowane komórki (iHSPC shLacZ, shTcf4 i shId2) metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Analiza cytometryczna z przepływem komórek zróżnicowanych komórek DC
<ol>
	<li>Przenieść komórki do probówek 1,5 mL, pipetując je 2-3 razy w górę i w dół w płytce, a następnie odwirować przez 5 min przy 500 x g w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Komórki DC różnicowane in vitro będą lekko przywierać do płytek. Ostrożne pipetowanie pomoże w odzyskaniu komórek DC z płytek.</li>
	<li>Odlać supernatant i resuspendować komórki w 50 µL buforu FACS. Następnie dodać 50 µL supernatantu hybrydomy anty-CD16/32 i inkubować przez 5-10 min na lodzie. 
	UWAGA: Przeciwciało blokujące Fc zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał do receptorów Fc wykazujących ekspresję na niektórych komórkach mieloidalnych i limfocytach B; jest ono dostępne komercyjnie u różnych dostawców.</li>
	<li>Dodać przeciwciała sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym (0,04 µg dla każdego przeciwciała) bezpośrednio do komórek i inkubować przez 15 min na lodzie w ciemności. Użyte przeciwciała to APC/cy7 anty-mysi CD11c, FITC anty-mysi CD11b oraz PE anty-mysi B220. 
	UWAGA: Komórki pDC definiuje się jako CD11c+CD11b-B220+, a komórki cDC jako CD11c+CD11b+B220-.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 mL buforu FACS i odwirować przez 5 min przy 500 x g w RT.</li>
	<li>Resuspendować komórki w 100 µL buforu FACS i analizować metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wektory shRNA oparte na lentiwirusach są często wykorzystywane do wyciszania genów poprzez transdukcję wirusa do komórek i umożliwiają stabilną integrację z genomem gospodarza. Należy jednak wziąć pod uwagę różną wydajność transdukcji w różnych typach komórek i podjęto szereg podejść w celu przezwyciężenia tego problemu. 
Polibren jest polimerem polikationowym, który może neutralizować ładunki na błonie komórkowej, zwiększając w ten sposób wiązanie wirionu z komórkami podczas transdukcji<sup c...

DC są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i nabytej1. DC są głównie klasyfikowane w dwóch funkcjonalnie odrębnych populacjach, a mianowicie pDC i cDC. Ponadto cDC składają się z dwóch podzbiorów, a mianowicie cDC typu I i typu II lub cDC1s i cDC2s, odpowiednio2. pDC, wyrażające BST2, Siglec-H i pośrednie poziomy CD11c u myszy3,4, to komórki, które mogą wydzielać duże ilości IFN-I podczas stanu zapalnego i infekcji wirusowej5. Ze względu na ich silną zdolność do wytwarzania IFN-I, podejrzewa się również, że odgrywają kluczową rolę w postępie chorób autoimmunologicznych, w tym tocznia rumieniowatego układowego (SLE)6. cDC1s, zdefiniowane przez powierzchniową ekspresję XCR1, CD8a, CLEC9A i CD103 u myszy7, są wyspecjalizowane w aktywacji i polaryzacji cytotoksycznych limfocytów T CD8 + (CTL) poprzez krzyżową prezentację antygenu, inicjując w ten sposób odporność typu I w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe patogeny i raka8,9. Z drugiej strony, cDC2s, wyrażające CD11b i CD172α (znane również jako Sirpα) zarówno u ludzi, jak i myszy, mogą aktywować limfocyty T CD4 + i promować odpowiedź immunologiczną typu II przeciwko alergenom i pasożytom10, a także modulować odporność typu III po rozpoznaniu bakterii zewnątrzkomórkowych i mikrobioty11,12.
Dywersyfikacja DC jest określana przez grupę TF z hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w BM. E2-2 (kodowane przez Tcf4) jest głównym regulatorem różnicowania i funkcji pDCs13,14. W przeciwieństwie do tego, inhibitor wiązania DNA 2 (ID2) napędza specyfikację cDC i hamuje rozwój pDC poprzez blokowanie aktywności białka E15. Co więcej, rozwój cDC1 wymaga IRF8 i BATF3, podczas gdy różnicowanie cDC2 w dużym stopniu zależy od IRF416. Ostatnie prace badały heterogeniczność pDCs17 i cDC oraz ich regulację transkrypcji18. Ze względu na złożoność sieci DC istnieje niezaspokojona potrzeba ustanowienia platformy do identyfikacji innych TF kontrolujących rozwój i funkcjonalność DC.
Tutaj użyliśmy iHSPC, który został wygenerowany przez ekspresję regulowanej estrogenem translokacji jądrowej Hoxb8 w komórkach BM (zwanych również komórkami Hoxb8-FL)19. iHSPC mogą się namnażać i pozostawać w stadium niezróżnicowanym w obecności β-estradiolu i ligandu Flt3 (FL), podczas gdy zaczynają różnicować się w różne typy DC w obecności FL po odstawieniu β-estradiol19. Opierając się na tej funkcji, możemy strącić interesujące nas geny na etapie progenitorowym, a następnie zbadać wpływ na różnicowanie in vitro pDC i cDC. Dlatego metoda ta jest potężnym narzędziem do odkrywania genów, które regulują rozwój i funkcję DC.

<table><tbody><tr><td><silne>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anty-mysie przeciwciało CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117324</td><td>(klon: N418)</td></tr><tr><td>FITC anty-mysie/ludzkie przeciwciało CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>(klon: M1/70)</td></tr><tr><td>PE anty-mysie/ludzkie B220 Przeciwciało</td><td>Biolegend</td><td>103208</td>(<td>Klon: RA3-6B2)</td></tr><tr><td><silna>Hodowla komórkowa</ mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówka</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średnia</td><td>gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FACS</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Formuła: 1xPBS + 0,5 %FBS + 0,1% NaN3</td></tr> <tr><td>ligand Flt3 (FL)</td><td>domowej roboty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>BIOLINE</td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (identyfikator sekwencji Taregt/klonu)</td><td>Firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>Konsorcjum RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>Konsorcjum RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>Konsorcjum RNAi (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem rna w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Komórki dendrytyczne (DC) są ważnymi komórkami prezentującymi antygen, które łączą wrodzoną i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. DC są niejednorodne i można je podzielić na konwencjonalne DC (cDC) i plazmocytoidalne DC (pDC). cDCs specjalizuje się w prezentowaniu antygenów naiwnym limfocytom T i aktywacji ich. Z drugiej strony, pDC mogą wytwarzać duże ilości interferonów typu I (IFN-I) podczas infekcji wirusowej. Specyfikacja DC występuje we wczesnym stadium komórek progenitorowych DC w szpiku kostnym (BM) i jest definiowana przez sieć czynników transkrypcyjnych (TF). Na przykład cDC o wysokiej ekspresji ID2, podczas gdy pDC o wysokiej ekspresji E2-2. Ponieważ identyfikowanych jest coraz więcej podzbiorów prądów stałych, rośnie zainteresowanie zrozumieniem konkretnych TF kontrolujących rozwój prądu stałego. W tym miejscu ustalamy metodę badań przesiewowych TF krytycznych dla różnicowania DC in vitro poprzez dostarczanie lentiwirusa przenoszącego krótkie RNA spinki do włosów (shRNA) do unieśmiertelnionej linii hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (iHSPC). Po selekcji i różnicowaniu in vitro, potencjał cDC i pDC stabilnych linii komórkowych knockdown jest analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to stanowi platformę do identyfikacji genów potencjalnie decydujących o losie DC od przodków in vitro.

Przedstawiono mapę wektora lentiwirusowego pLKO.1-Puro (Rysunek 1). Po dostarczeniu do iHSPC lentiwirusa wykazującego shRNA przeciwko LacZ (kontroli nietargetującej), Tcf4 oraz Id2, efektywność knockdownu potwierdzona za pomocą RT-qPCR wykazała, że ekspresja Tcf4 była zmniejszona w shTcf4 iHSPC w porównaniu do shLacZ iHSPC (Rysunek 2A). Z kolei zmniejszona ekspresja Id2 została również zaobserwowana ...

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowymi komórkami odpornościowymi łączącymi wrodzony i nabyty układ odpornościowy. Chociaż DC są heterogeniczne, ta metoda pomaga nam zrozumieć, które geny, w tym czynniki transkrypcyjne, mogą regulować rozwój DC. Technika ta zapewnia prosty i szybki sposób identyfikacji genu, który kontroluje rozwój DC od ich przodka in vitro.Na początek utrzymuj unieśmiertelnione hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe lub iHSPC w kompletnym pożywce RPMI 1640, uzupełnionej 100 nanogramami na mililitr liganda FLT3 i jednym mikromolowym beta estradiolem. W przypadku transdukcji lentiwirusowej należy umieścić iHSPC na 12-dołkowych płytkach o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na dołek i jeden mililitr kompletnej pożywki zawierającej ligand FLT3, beta estradiol i polibren. Następnie dodaj lentiwirusa przenoszącego RNA krótkiej spinki do włosów w każdym dołku przy wielokrotności infekcji 100.Następnie obracaj płytkę w temperaturze 1100 razy g i 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, a następnie inkubuj zainfekowane komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń polibren, zbierając komórki do 15-mililitrowych probówek w wirowaniu, po zastąpieniu pożywki świeżą kompletną pożywką zawierającą ligand FLT3 i beta estradiol. Po dodatkowych 24 godzinach dodaj sześć mikrogramów na mililitr puromycyny do pożywki, aby wybrać zakażone komórki.Wymieniaj pożywkę selekcyjną co trzy dni i utrzymuj komórki przez co najmniej tydzień, aby stabilnie rozszerzyć transdukowane iHSPC. Generuj i utrzymuj stabilne knockdown iHSPC dla LacZ, Tcf4 i Id2 w kompletnym pożywce uzupełnionej ligandem FLT3 i beta estradiolem. Aby zainicjować różnicowanie in vitro, należy zebrać niezróżnicowane iHSPC do 15-mililitrowych probówek i zagnieździć komórki przez odwirowanie.Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami PBS. Po drugim myciu ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce zawierającej tylko lig FLT3, a następnie zasiej je z gęstością dwa razy 10 do piątej sprzedaży na mililitr do 12-dołkowej płytki. Po trzech dniach dodać jeden mililitr świeżej, kompletnej pożywki zawierającej ligand FLT3.Po dodatkowych dwóch dniach przystąp do analizy zróżnicowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy pipetować komórki w górę i w dół dwa do trzech razy w płytce, a następnie zebrać komórki do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówki i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w 50 mikrolitrach buforu faksowego.Następnie dodaj 50 mikrolitrów supernatantu anty-CD16 by 32 hybridoma i inkubuj przez pięć do 10 minut na lodzie. Następnie dodaj przeciwciała sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym bezpośrednio do komórek i inkubuj przez 15 minut na lodzie w ciemności. Po inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem buforu faksowego i odwirować próbkę.Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach buforu faksu i przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Po krótkim, spinkowym RNA knockdown LacZ, Tcf4 i Id2 w iHSPCS, potwierdzenie skuteczności knockdown za pomocą RTQ-PCR wykazało, że ekspresja iHSPC knockdown Tcf4 i Tcf4 była zmniejszona w porównaniu z tą w iHSPC knockdown LacZ. Podobne wyniki zaobserwowano dla ekspresji Id2 w iHSPC z knockdownem Id2.Po wyhodowaniu iHSPC knockdown LacZ przez pięć dni, częstotliwość komórek CD11c dodatnich, które reprezentują populację komórek dendrytycznych, wynosiła około 95%Jednak strącenie Tcf4 lub Id2 nieznacznie zmniejszyło wytwarzanie komórek dendrytycznych CD11c-dodatnich. Dalsza analiza komórek dendrytycznych CD11c-dodatnich pochodzących z iHSPC knockdown LacZ wykazała, że 70% z nich to konwencjonalne komórki dendrytyczne, a 22% to plazmocytoidalne komórki dendrytyczne. Knockdown iHSPC Tcf4 wygenerowały znacznie niższy odsetek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych niż kontroluje knockdown LacZ.W przeciwieństwie do tego, iHSPC z knockdownem Id2 generowały znacznie niższy odsetek konwencjonalnych komórek dendrytycznych niż kontrole knockdown LacZ, ale wyższy odsetek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych. Infekcje spinowe zwiększają skuteczność transdukcji shRNA przenoszącego lentiwirusa do iHSPC. Technika ta odnosi się do roli czynników transkrypcyjnych i ułatwia badanie innych genów w transdukcji sygnalizacji cytokin lub metabolizmie, które mogą być zaangażowane w rozwój DC.

study-dendritic-cell-development-short-hairpin-rna-mediated-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

W tym filmie demonstrujemy metodę przeprowadzania transdukcji wektorów lentiwirusowych shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown w unieśmiertelnionych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (iHSPC).

Knockdown genów za pośrednictwem RNA za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów w iHSPC in vitro: system ekspresji shRNA oparty na lentiwirusie dostarczany do iHSPC w celu wyeliminowania określonej ekspresji genów

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Poznaj metodę knockdownu genów za pomocą shRNA w komórkach hematopoetycznych do badania rozwoju komórek dendrytycznych. Protokół ten umożliwia identyfikację czynników transkrypcyjnych regulujących różnicowanie DC.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro (Wideo) | JoVE Journal

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Przeglądaj więcej filmów