Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro
7 marca 2022
Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.
Komórki dendrytyczne (DC) są kluczowymi komórkami odpornościowymi łączącymi wrodzony i nabyty układ odpornościowy. Chociaż DC są heterogeniczne, ta metoda pomaga nam zrozumieć, które geny, w tym czynniki transkrypcyjne, mogą regulować rozwój DC. Technika ta zapewnia prosty i szybki sposób identyfikacji genu, który kontroluje rozwój DC od ich przodka in vitro.
Na początek utrzymuj unieśmiertelnione hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe lub iHSPC w kompletnym pożywce RPMI 1640, uzupełnionej 100 nanogramami na mililitr liganda FLT3 i jednym mikromolowym beta estradiolem. W przypadku transdukcji lentiwirusowej należy umieścić iHSPC na 12-dołkowych płytkach o gęstości od jednego razy 10 do piątej komórki na dołek i jeden mililitr kompletnej pożywki zawierającej ligand FLT3, beta estradiol i polibren. Następnie dodaj lentiwirusa przenoszącego RNA krótkiej spinki do włosów w każdym dołku przy wielokrotności infekcji 100.
Następnie obracaj płytkę w temperaturze 1100 razy g i 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, a następnie inkubuj zainfekowane komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń polibren, zbierając komórki do 15-mililitrowych probówek w wirowaniu, po zastąpieniu pożywki świeżą kompletną pożywką zawierającą ligand FLT3 i beta estradiol. Po dodatkowych 24 godzinach dodaj sześć mikrogramów na mililitr puromycyny do pożywki, aby wybrać zakażone komórki.
Wymieniaj pożywkę selekcyjną co trzy dni i utrzymuj komórki przez co najmniej tydzień, aby stabilnie rozszerzyć transdukowane iHSPC. Generuj i utrzymuj stabilne knockdown iHSPC dla LacZ, Tcf4 i Id2 w kompletnym pożywce uzupełnionej ligandem FLT3 i beta estradiolem. Aby zainicjować różnicowanie in vitro, należy zebrać niezróżnicowane iHSPC do 15-mililitrowych probówek i zagnieździć komórki przez odwirowanie.
Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami PBS. Po drugim myciu ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce zawierającej tylko lig FLT3, a następnie zasiej je z gęstością dwa razy 10 do piątej sprzedaży na mililitr do 12-dołkowej płytki. Po trzech dniach dodać jeden mililitr świeżej, kompletnej pożywki zawierającej ligand FLT3.
Po dodatkowych dwóch dniach przystąp do analizy zróżnicowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. W przypadku analizy cytometrii przepływowej należy pipetować komórki w górę i w dół dwa do trzech razy w płytce, a następnie zebrać komórki do probówek o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówki i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem komórek w 50 mikrolitrach buforu faksowego.
Następnie dodaj 50 mikrolitrów supernatantu anty-CD16 by 32 hybridoma i inkubuj przez pięć do 10 minut na lodzie. Następnie dodaj przeciwciała sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym bezpośrednio do komórek i inkubuj przez 15 minut na lodzie w ciemności. Po inkubacji przemyć komórki jednym mililitrem buforu faksowego i odwirować próbkę.
Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w 100 mikrolitrach buforu faksu i przeanalizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Po krótkim, spinkowym RNA knockdown LacZ, Tcf4 i Id2 w iHSPCS, potwierdzenie skuteczności knockdown za pomocą RTQ-PCR wykazało, że ekspresja iHSPC knockdown Tcf4 i Tcf4 była zmniejszona w porównaniu z tą w iHSPC knockdown LacZ. Podobne wyniki zaobserwowano dla ekspresji Id2 w iHSPC z knockdownem Id2.
Po wyhodowaniu iHSPC knockdown LacZ przez pięć dni, częstotliwość komórek CD11c dodatnich, które reprezentują populację komórek dendrytycznych, wynosiła około 95%Jednak strącenie Tcf4 lub Id2 nieznacznie zmniejszyło wytwarzanie komórek dendrytycznych CD11c-dodatnich. Dalsza analiza komórek dendrytycznych CD11c-dodatnich pochodzących z iHSPC knockdown LacZ wykazała, że 70% z nich to konwencjonalne komórki dendrytyczne, a 22% to plazmocytoidalne komórki dendrytyczne. Knockdown iHSPC Tcf4 wygenerowały znacznie niższy odsetek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych niż kontroluje knockdown LacZ.
W przeciwieństwie do tego, iHSPC z knockdownem Id2 generowały znacznie niższy odsetek konwencjonalnych komórek dendrytycznych niż kontrole knockdown LacZ, ale wyższy odsetek plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych. Infekcje spinowe zwiększają skuteczność transdukcji shRNA przenoszącego lentiwirusa do iHSPC. Technika ta odnosi się do roli czynników transkrypcyjnych i ułatwia badanie innych genów w transdukcji sygnalizacji cytokin lub metabolizmie, które mogą być zaangażowane w rozwój DC.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przesiewowy w celu identyfikacji czynników transkrypcyjnych wpływających na rozwój komórek dendrytycznych (DC) poprzez transdukcję lentiwirusem shRNA. Metoda ta umożliwia stworzenie stabilnych linii komórkowych z wyciszeniem genów (knockdown) do różnicowania komórek DC in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Regulacja transkrypcyjna
Wstęp
- Komórki dendrytyczne są kluczowe dla powiązania odporności wrodzonej i nabytej.
- Zrozumienie rozwoju komórek dendrytycznych może dostarczyć wiedzy na temat odpowiedzi immunologicznych.
- Niniejsze badanie koncentruje się na identyfikacji genów regulujących różnicowanie komórek dendrytycznych.
- Metoda wykorzystuje unieśmiertelnione hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do przesiewania czynników transkrypcyjnych w rozwoju komórek DC.
- Stworzenie stabilnych linii komórkowych z wyciszeniem genów (knockdown) do badań funkcjonalnych.
- Ułatwienie różnicowania komórek DC in vitro z komórek progenitorowych.
Zastosowane metody
- Utrzymywanie iHSPCs w pełnej pożywce RPMI 1640.
- Suplementacja ligandem FLT3 oraz beta-estradiollem.
- Transdukcja lentiwirusem iHSPCs z wykorzystaniem shRNA.
- Zastosowanie polybrene w celu zwiększenia wydajności transdukcji.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie stabilnych linii komórkowych z wyciszeniem ekspresji genów (knockdown).
- Identyfikacja czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych.
- Wykazanie możliwości różnicowania in vitro.
- Wgląd w regulację genetyczną rozwoju komórek odpornościowych.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę badania rozwoju komórek DC.
- Może być on wykorzystany do identyfikacji kluczowych genów regulacyjnych w immunologii.
- Podejście to może przyczynić się do lepszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia systematyczne badanie funkcji czynników transkrypcyjnych w procesie determinacji linii komórek dendrytycznych, wspierając walidację celów w programach badawczych skoncentrowanych na immunologii. Poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z wynikiem fenotypowym w powtarzalnym systemie in vitro, pozwala ona na mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w przypadku wczesnych hipotez dotyczących celów terapeutycznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną przy ustalaniu priorytetów dla celów immunomodulujących przed podjęciem zasobożernych działań w celu identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę czynników transkrypcyjnych jako potencjalnych celów terapeutycznych w rozwoju komórek dendrytycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalną platformę do przesiewowego wyciszania genów z wykorzystaniem dostarczania shRNA za pomocą lentiwirusów w unieśmiertelnionych progenitorach krwiotwórczych.
- Wartość prognostyczna: Łączy modulację celu z uzyskaniem konkretnych subpopulacji komórek dendrytycznych, co wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na podstawie danych o kierunkowości różnicowania linii komórkowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników cytometrii przepływowej dla komórek CD11c-dodatnich oraz rozkładu podtypów (cDC vs pDC) po wyciszeniu czynnika transkrypcyjnego.
- Wartość operacyjna: Ustanawia zestandaryzowany test różnicowania z określonymi warunkami cytokinowymi (ligand FLT3, beta-estradiol) i selekcją za pomocą puromycyny.
- Gotowość testu: Pozwala na wytworzenie stabilnych linii komórkowych z wyciszonym genem, odpowiednich do wielokrotnego wykorzystania w przesiewaniu związków lub badaniach nad modulacją szlaków sygnałowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Modeluje wczesną specyfikację komórek dendrytycznych z komórek progenitorowych, dostarczając informacji na temat strategii biomarkerowych powiązanych z sieciami czynników transkrypcyjnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia rolę Id2 w promowaniu losu konwencjonalnych komórek dendrytycznych oraz Tcf4 we wspieraniu rozwoju plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych.
- Zgodność przedkliniczna: Wspiera ocenę celów wpływających na różnicowanie komórek odpornościowych, istotnych dla programów dotyczących adiuwantów szczepionkowych lub autoimmunizacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących celu przed opracowaniem testu służącego do identyfikacji związków wiodących, przy czym uzyskane dane wspierają wybór kandydata przedklinicznego w zakresie immunomodulacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizę mechanistyczną regulatorów transkrypcyjnych sterujących determinacją linii komórek dendrytycznych z progenitorów hematopoetycznych.
- Opracowywanie testów: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych, ilościowych wyników immunofluorescencji i cytometrii przepływowej do monitorowania wydajności różnicowania oraz rozkładu subpopulacji.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników (procent CD11c+, cDC, pDC), które umożliwiają porównania między warunkami knockdownu i wspierają statystyczną ocenę wpływu celu.
- Badania translacyjne: Łączy różnicowanie wczesnych progenitorów z późniejszą funkcją odpornościową, co jest istotne dla modelowania odpowiedzi w warunkach infekcji lub tolerancji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania dodatkowych genów w sygnalizacji cytokin, metabolizmie lub sieciach transkrypcyjnych wpływających na rozwój komórek dendrytycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez powiązanie wyciszenia czynnika transkrypcyjnego z mierzalnymi zmianami w generowaniu subpopulacji komórek dendrytycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację protokołów różnicowania i odczytu pomiędzy laboratoriami dzięki zdefiniowanym warunkom pożywek i markerom selekcyjnym.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne przy wyborze celów immunomodulacyjnych, dostarczając wczesnych dowodów funkcjonalnych na efekty specyficzne dla danej linii komórkowej.
- Wpływ na portfolio: Pozwala na priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich wpływ na decyzje dotyczące losu komórek dendrytycznych, co wspiera efektywną alokację zasobów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu transdukcji lentiwirusowej, hodowli komórek krwiotwórczych oraz cytometrii przepływowej.
- Metoda zależy od dostępu do bibliotek lentiwirusowych shRNA, selekcji puromycyną oraz pożywek uzupełnionych cytokinami (ligand FLT3, beta-estradiol).
- Konieczna jest standaryzacja wydajności transdukcji (np. poprzez spin-infekcję) oraz czasu selekcji w celu uzyskania stabilnego wyciszenia genów (knockdown).
- Wymagana jest optymalizacja czasu różnicowania oraz paneli przeciwciał w celu dokładnej identyfikacji podtypów komórek dendrytycznych za pomocą cytometrii.
- Metoda ogranicza się do modelowania in vitro; wyniki wymagają walidacji w pierwotnych systemach ludzkich lub mysich w celu potwierdzenia znaczenia translacyjnego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
