Name: Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj optymalizowaną metodę przygotowania próbek i normalizacji danych dla wielkoskalowych studiów GWAS metabolomicznych. Protokół ten minimalizuje wariacje techniczne i poprawia dokładność analizy związków metabolicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.B. jest wspierany przez IMPRS-PMPG 'Pierwotny metabolizm i wzrost roślin'. A.R.F. i S.A. dziękują za wsparcie finansowe unijnego programu badań naukowych i innowacji Horyzont 2020, projektu PlantaSYST (SGA-CSA nr 739582 w ramach FPA nr 664620) oraz projektu INCREASE (GA 862862).

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Zarówno GC-MS, jak i LC-MS są szeroko stosowanymi narzędziami do profilowania złożonych mieszanin różnych klas metabolitów. Obsługa dużych zbiorów danych za pomocą tych narzędzi jest z natury związana ze zmiennością niebiologiczną, np. zmiennością analityczną, która zakłóca i zniekształca interpretację wyników. Protokół ten przedstawia solidny i wysokowydajny potok ekstrakcji do kompleksowego profilowania metabolicznego w celu wyeliminowania zmienności pochodzenia niebiologicznego i przeprowadzenia badań "omicznych" na dużą skalę. Objętości i stężenia użyte w tym protokole zostały dostosowane do gatunków roślin strączkowych w różnych tkankach. Parametry te można jednak nieznacznie zmodyfikować i wykorzystać do dużych próbek metabolicznych innych gatunków roślin.
Poprzednioopisane ekstrakcje na bazie MTBE można wykorzystać do analizy derywatyzowanych metabolitów, metabolitów półpolarnych i lipidów. Można to rozszerzyć na ekstrakcje białek i hormonów roślinnych39, które były poza zakresem tego protokołu. Inne protokoły ekstrakcji opierają się na mieszaninach dichlorometanu: etanol40,41. Spośród tych protokołów ekstrakcji, protokół ekstrakcji MTBE:metanol stanowi korzystną i mniej niebezpieczną alternatywę dla istniejących protokołów ekstrakcji na bazie chloroformu42 i nie prowadzi do powstania osadu białkowego jako interfazy między fazą polarną i lipidową. Ponadto metody MTBE zostały już wykorzystane w kilku badaniach dla różnych próbek biologicznych 43,44,45.
W protokole omówiono kilka kluczowych kroków, które mogą prowadzić do potencjalnej zmienności podczas obsługi dużej liczby próbek, np. podczas zbioru12,13, ekstrakcji14, a także randomizacji46. Ponadto istnieją dodatkowe kwestie, które nie zostały omówione w tym protokole, a które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić wysokiej jakości dane metabolomiczne, np. efekt matrycy i supresja jonów14.
Moc metod normalizacji opartych na kontroli jakości z natury zależy od liczby próbek kontroli jakości w każdej partii. Jak wspomniano wcześniej, chociaż zwiększenie liczby zwiększyłoby moc, zmienność wewnątrzpartiowa kontroli jakości jest stosunkowo marginalna w porównaniu ze zmiennością międzypartiową w tych systemach analitycznych, jak pokazano na rysunku 3. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją inne metody normalizacji oparte na kontroli jakości, takie jak usuwanie błędów systemowych przy użyciu lasu losowego (SERRF), które, jak wykazano, przewyższają większość innych metod normalizacji, takich jak stosunek partii, normalizacja przy użyciu optymalnego wyboru wielu standardów wewnętrznych (NOMIS) i normalizacja ilorazu probabilistycznego (PQN)47. Jednak SERRF opiera się na wielu próbkach kontroli jakości w każdej partii, np. co dziesiąta próbka, co nie jest możliwe w przypadku obsługi dużej liczby próbek. Główną zaletą normalizacji opartej na kontroli jakości w porównaniu z innymi metodami opartymi na danych lub wewnętrznych standardach jest to, że zachowuje ona podstawową zmienność biologiczną, jednocześnie dostosowując się do niepożądanej zmienności technicznej28. Czytelnicy mogą zapoznać się z niniejszym przeglądem na temat postępowania z wariantem28.
Jednym z głównych problemów w GWAS jest odsetek wyników fałszywie dodatnich, które powstają głównie z powodu powiązania stron przyczynowych i nieprzyczynowych48,49. Po drugie, konserwatywne podejścia do korekty statystycznej, np. Bonferroni i FDR, korygują liczbę niezależnych testów, która nie jest równa liczbie oznaczonych SNP w GWAS ze względu na powiązanie między bliższymi SNP50,51 Dlatego rzeczywista liczba niezależnych testów jest często niższa. Innym sposobem na obniżenie konserwatywnego progu statystycznego byłoby zmniejszenie liczby testowanych SNP używanych do GWAS w oparciu o rozpad sprzężeń w zdefiniowanych regionach genomu52. Zintegrowana z GWAS, wysokoprzepustowa platforma metabolomiczna opisana w tym protokole ma szeroki zakres zastosowań. W szczególności przyczyni się to do poprawy hodowli roślin uprawnych poprzez zmianę składu metabolitów/lipidów na poziomie pożądanym przemysłowo i żywieniowo. Ogólnie rzecz biorąc, metabolomika dostarczyła dogłębnego wglądu w architekturę genetyczną wielu metabolitów i dywersyfikację metaboliczną, która miała miejsce podczas udomowienia roślin w ciągu ostatnich dziesięcioleci, co wskazuje na ogromny potencjał hodowli związanej z metabolomiką53. Podejścia biologii molekularnej do dalszej walidacji QTL obejmują generowanie zmutowanych linii CRISPR/Cas954, linii insercyjnych T-DNA55, stabilnych i/lub przejściowych linii nadekspresji56, VIGS, podejścia metabolomiczne ex vivo 57 obok konwencjonalnego podejścia w generowaniu populacji krzyżowych F2, a także walidacji krzyżowej w różnych populacjach.
Dokonując niezbędnej korekty dla zmian analitycznych, jak opisano powyżej, oprócz GWAS można wykonać kilka zintegrowanych podejść, takich jak analiza korelacji metabolit-metabolit, analiza korelacji metabolit-lipid, analiza korelacji z danymi fenomicznymi w celu rzucenia światła na bardziej złożone cechy i/lub analiza koekspresji w celu dalszego rozwikłania podstaw systemów biologicznych58.

Podejścia "omiczne" na dużą skalę umożliwiły analizę złożonych systemów biologicznych1,2,3 oraz dalsze zrozumienie związku między genotypami a wynikającymi z nich fenotypami4. Metabolomika z wykorzystaniem ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UHPLC-MS) i GC-MS umożliwiła wykrycie wielu cech metabolitów, z których tylko niektóre są w pewnym stopniu opisane, co skutkuje wysokim odsetkiem nieznanych metabolitów. Złożone interakcje można badać, łącząc metabolomikę na dużą skalę z podstawową zmiennością genotypową zróżnicowanej populacji5. Jednak obsługa dużych zestawów próbek jest z natury związana z różnicami analitycznymi, co zniekształca ocenę wariancji metabolicznej dla dalszych procesów. W szczególności główne problemy prowadzące do różnic analitycznych opierają się na wydajności maszyny i instrumentalnym dryfie w czasie6. Integracja zmienności między partiami jest trudna, a szczególnie problematyczna w przypadku analizy ustrukturyzowanych populacji roślin na dużą skalę. Zaproponowano wiele procedur normalizacji w celu skorygowania różnic niebiologicznych, np. użycie wewnętrznych, zewnętrznych i znakowanych izotopami wzorców wewnętrznych w celu skorygowania błędów analitycznych, z których każdy jest z natury związany ze znanymi problemami i pułapkami7,8,9,10.
Oprócz zmienności analitycznej, wybór protokołów ekstrakcji zazwyczaj różni się w zależności od metody analitycznej. Docelowo pożądane jest obniżenie kosztów materiałowych i robocizny oraz konieczności wykorzystania kilku podwielokrotności tej samej próbki do różnych procesów analitycznych poprzez zastosowanie metod ekstrakcji opartych na separacji faz. Metody te zostały po raz pierwszy wprowadzone przy użyciu chloroformu: rozpuszczalników metanol/woda do frakcjonowania związków polarnych i hydrofobowych11.
Ten protokół opisuje szybki potok o wysokiej przepustowości dla platformy multi-omicznej do profilowania zarówno metabolitów polarnych, jak i lipidów w gatunkach roślin strączkowych. Ponadto pokazano, w jaki sposób te zestawy danych można odpowiednio skorygować pod kątem zmienności analitycznej i znormalizować przed integracją informacji genotypowych w celu wykrycia loci cech ilościowych metabolitów (QTL) za pomocą GWAS.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki i wzorce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (17:0 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850360P</td><td>Wzorzec wewnętrzny lipidów</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supleco</td><td>67-66-3</td><td>Rozpuszczalnik FAME</td></tr><tr><td>Isovitexin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38953-85-4</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów</td></tr><tr><td>Kwas lignocerynowy Metylester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2442-49-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Metanol (MeOH)</td><td>Biosolve Chemikalia</td><td>13684102</td><td>klasy ULC-MS</td></tr><tr><td>Metoksyamina-chlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>593-56-6</td><td>Derywiatyzacja metabolitów</td></tr><tr><td>Laurynian metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>111-82-0</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Mirystynian metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>124-10-7</td><td>sława</td></tr><tr><td>Palmitynian metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112-39-0</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Stearynian metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>112-61-8</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Eter metylowo-tert-butylowy (MTBE)</td><td>Biosolve Chemicals</td><td>13890602</td><td>klasy HPLC</td></tr><tr><td>Metylo-kapat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>110-42-9</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Metylokaprylat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>111-11-5</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Methyldocosanoat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>929-77-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Metylo-pelargonian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1120-28-1</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Metyloheksakozanonian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5802-82-4</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Metylo-oktakozanian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55682-92-3</td><td>FAME</td></tr><tr><td>Pelarnian metylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1731-84-6</td><td>FAME</td></tr><tr><td>N-metylo-N-( trimetylosililo)trifluoracetamid (MSTFA)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>24589-78-4</td><td>Derywiatyzacja metabolitów</td></tr><tr><td>Pirydyna</td><td>Supleco</td><td>110-86-1</td><td>Derywiatyzacja metabolitów</td></tr><tr><td>Ribitol</td><td>Supleco</td><td>22566-17-2</td><td>Wzorzec wewnętrzny dla metabolitów derywatyzowanych</td></tr><tr><td>Ester metylowy kwasu triakontanowego</td><td>TCI Chemicals</td><td>629-83-4</td><td>Woda</td></tr> <tr><td></td><td>FAMEBiosolve Chemicals</td><td>23214102</td><td>Klasa ULC-MS</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>3120086</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>3120094</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius Corporation</td><td>14 557 572</td><td></td></tr><tr><td>DB-35ms, 30 m, 0,25 mm, 0,25 &mikro; </td><td>m Aglient</td><td>123-3832</td><td>Analiza derywatyzowanych metabolitów</td></tr><tr><td>System GC-MS</td><td>Leco Pegasus HT TOF-MS (LECO Corporation)</td><td></td><td>Analiza derywatyzowanych metabolitów</td></tr><tr><td>Kule szlifierskie, stal nierdzewna</td><td>OPS DIAGNOSTICS</td><td>GBSS 196-2500-10</td><td></td></tr><tr><td>MS system</td><td>Exactive, Orbitrap-type, MS (Exactive, Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td>Analiza lipidów</td></tr><tr><td>MS system</td><td>Q Intensywne skupienie (Q Eksaktywne&handel; Focus Hybrid Quadrupol-Orbitrap&handel; Massenspektrometer, Thermo Fisher Scientific)</td><td></td><td>Analiza metabolitów</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf, model 5427R</td><td>22620701</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna C8 z hybrydą etylową z odwróconą fazą (RP) z mostkiem (BEH) (100 mm & razy 2,1 mm zawierające 1,7 &mu; m średnica cząstek)</td><td>Wody</td><td>186002878</td><td>Analiza lipidów</td></tr><tr><td>RP Krzemionka o wysokiej wytrzymałości (HSS) Kolumna T3 (100 mm i razy 2,1 mm zawierające 1,8 &mu; m średnica cząstki)</td><td>Wody</td><td>186003539</td><td>Analiza metabolitów</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Eppendorf Thermomixer 5436</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>USC 300 TH</td><td>142-0084</td><td></td></tr><tr><td>Młyn mieszający do mielenia tkanek</td><td>Retsch, Młyn miksujący MM 300</td><td>20.746.0001</td><td></td></tr><tr><td>System UPLC</td><td>Wody System Acquity UPLC (Wody)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próżnia koncentrator</td><td>Prędkość skanowania Maxi Vac Alpha Parowniki</td><td>7.008.500.002</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>Vortex-Genie 2, model G560</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetAlign</td><td></td><td></td><td>Przetwarzanie chromatogramów</td></tr><tr><td>MzMine</td><td></td><td></td><td>Przetwarzanie chromatogramów</td></tr><tr><td>Pakiet R "data.table" </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiet R "fujiplot"</td><td></td><td></td><td>mapa plejotropiczna</td></tr><tr><td>Pakiet R "genetyka"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pakiet R "Ime4"</td><td></td><td></td><td>Obliczenia BLUPs</td></tr>, <tr><td>pakiet R "LDmapa ciepła"</td><td></td><td></td><td>LD wykresy</td></tr><tr><td>R pakiet "MASA"</td><td></td><td></td> <td>transformacja</td></tr><tr><td>Pakiet R "rMVP"GWAS</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>R wersja 4.0.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RefinerMS</td><td></td><td></td><td>Przetwarzanie chromatogramów</td></tr><tr><td>RefinerMS Genedata</td><td>Expressionist</td><td></td><td>Przetwarzanie chromatogramów</td></tr><tr><td>Tassel 5</td><td></td><td></td><td>Filtrowanie genotypów</td></tr><tr><td>Xcalibur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td>Przetwarzanie chromatogramów</td></tr></tbody></table>

large-scale multi-omimic genome-wide association studies (mo-gwas): wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Large-Scale Multi-Omics Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Guidelines for Sample Preparation and Normalization

Zarówno chromatografia gazowa-spektrometria mas (GC-MS), jak i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS) są szeroko stosowanymi metodami metabolomicznymi do wykrywania i ilościowego określania setek tysięcy cech metabolitów. Jednak zastosowanie tych technik do dużej liczby próbek podlega bardziej złożonym interakcjom, szczególnie w przypadku badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS). Protokół ten opisuje zoptymalizowany przepływ pracy metabolicznej, który łączy wydajne i szybkie przygotowanie próbek z analizą dużej liczby próbek dla gatunków roślin strączkowych. Ta nieznacznie zmodyfikowana metoda ekstrakcji została początkowo opracowana do analizy tkanek roślinnych i zwierzęcych i opiera się na ekstrakcji w eterze metylowo-tert-butylowym: rozpuszczalniku metanolowym, aby umożliwić wychwytywanie metabolitów polarnych i lipidowych. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku dotyczący redukcji zmian analitycznych, które są niezbędne do wysokoprzepustowej oceny wariancji metabolicznej w GWAS.

Pomocne eksperymenty GWAS w metabolomice powinny rozpocząć się od właściwego projektu doświadczalnego, po którym następują pobieranie próbek, ekstrakcja, akwizycja danych oraz ich przetwarzanie, co przedstawiono na Rysunku 1. W niniejszym protokole zastosowano metodę MTBE15 do ekstrakcji i analizy setek metabolitów należących do kilku klas związków. Chromatografia w dużym stopniu zależy od właściwości zastosowanej kolumny, a także od mieszanin buforów elucyjnych. Rysunek 2 przedstawia chromatogramy próbek QC, wskazując wzorzec elucji niektórych głównych klas lipidów w tym systemie analitycznym. Zastosowane gradienty dla każdej platformy podano w Tabeli 1. Dużą wagę przywiązano do radzenia sobie z błędami systematycznymi w eksperymentach na dużą skalę. Przeprowadzanie szerokozakresowej metabolomiki jest nieodłącznie związane z błędami systematycznymi. W ramach demonstracji przeanalizowano dane lipidomiczne dla kilku gatunków fasoli zwyczajnej. Tabela uzupełniająca 1 zawiera wyekstrahowane surowe dane lipidomiczne uzyskane po przetwarzaniu chromatogramów przy użyciu oprogramowania wskazanego w Tabeli materiałów. Przestrzeganie tego protokołu pozwoliło uniknąć głównych problemów związanych z przetwarzaniem danych omicznych, zwłaszcza przy dużych zestawach próbek. Procedura normalizacji pozwala na dokładną korekcję błędów analitycznych z poszczególnych serii, co zademonstrowano na Rysunku 3. Chociaż zwiększenie liczby próbek QC zwiększyłoby skuteczność normalizacji, nie zawsze jest to możliwe ze względu na ograniczenia kosztowe i czasowe. W przypadku wysokoprzepustowych badań GWAS w metabolomice z nietargetowanymi cechami metabolicznymi kluczowe jest odpowiednie przedstawienie większej liczby asocjacji cecha-marker. Do wyróżnienia regionów genomowych, z którymi powiązanych jest kilka cech, można wykorzystać mapę plejotropową38 łączącą wyniki z wielu badań GWAS (Rysunek 4).
<img alt="Przebieg analizy metabolomicznej, lipidomika: LC-MS, QC, PCA, normalizacja, QTL; schemat, analiza danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Schemat GWAS oparty na metabolomice u roślin. W lewym panelu przedstawiono kilka etapów, począwszy od projektu eksperymentalnego aż po detekcję QTL. W prawym panelu znajduje się kilka rycin uzupełniających poszczególne etapy opisane w lewym panelu. Zaczynając od prawego górnego rogu, (1) przedstawiono sugerowaną kolejność próbek do analizy LC-MS, (2) wykresy wyników PCA przed i po normalizacji, obejmujące reprezentatywny rozkład cech przed i po przetwarzaniu, gdzie kolor czerwony oznacza intensywności próbek QC, oraz (3) wykres Manhattan z istotnymi asocjacjami, dla których wygenerowano rozkłady LD i haplotypów. Skróty: GWAS = badania asocjacyjne całego genomu; QTL = loci cech ilościowych; PCA = analiza głównych składowych; QC = kontrola jakości; LD = nierównowaga sprzężeń; MS = spektrometria mas; LC-MS = chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas; GC-MS = chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas; LOESS = lokalne regresyjne wygładzanie; MLM/MLMM = mieszany model liniowy/wielomiejscowy mieszany model liniowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig01large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres chromatograficzny, czas retencji, rozdział lipidów, zmienność intensywności piku, wynik analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przetwarzanie chromatogramu. Dwa chromatogramy QC (piku bazowego; danych lipidowych) z różnych partii wykazują zmienność międzypartiową dla określonych klas lipidów w połączonych próbkach QC. Cztery główne klasy lipidów są zaznaczone wraz z ich odpowiednimi oknami elucji w wewnętrznym systemie LC-MS. Chromatogramy zostały wyeksportowane z programu MzMine21. Skróty: QC = kontrola jakości; LC-MS = chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza lipidów, PCA z normalizacją batch loess, dane klastrów, wykresy przedstawiające wariacje próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Korekcja błędu systematycznego. Analiza głównych składowych (PCA) uzyskanych danych lipidomicznych przed (lewa strona, dane surowe) i po korekcji błędów systematycznych (prawa strona, batch loess). Dolne panele ilustrują rozkład cechy (Cluster_00005) w próbkach (n=650) i partiach (n=10) przed (lewa strona) i po (prawa strona) korekcji wariacji analitycznej. Skróty: PCA = analiza głównych składowych; QC = kontrola jakości; LOESS = lokalnie estymowane wygładzanie wykresu rozrzutu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kolisty wykres drzewa filogenetycznego, wizualizujący zależności genetyczne między gatunkami z danymi zakodowanymi kolorami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62732/62732fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Mapa pleiotropowa ilustrująca połączone wyniki GWAS. Mapa pleiotropowa wyróżnia regiony w całym genomie, które są powiązane z kilkoma cechami. Liczby na zewnętrznych pierścieniach wskazują odpowiednie chromosomy. Każdy okrąg reprezentuje poszczególną cechę wraz z jej istotnie powiązanymi SNP. Kolory reprezentują różne klasy związków (szary = klasa związków 1; zielony = klasa związków 2; fioletowy = klasa związków 3; żółty = klasa związków 4). W przypadku powiązań między klasami związków w tym samym regionie genomicznym wyróżniono geny. Wewnętrzny szary okrąg pokazuje sumę wszystkich istotnych SNP powiązanych z konkretną pozycją genomiczną. Powiązania przedstawione na tym rysunku zostały wygenerowane sztucznie wyłącznie w celach ilustracyjnych. Skróty: GWAS = badania asocjacyjne w całym genomie; SNPs = polimorfizmy pojedynczego nukleotydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/62732fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Ustawienia UHPLC-MS dla lipidów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas [min]</td>
			<td>Eluent A do B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informacje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 - 1.00</td>
			<td>45% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 1% 1M NH4OH4-Octan, 0,1% kwas octowy w wodzie (klasy UHPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00 - 4.00</td>
			<td>lg 45% - 25% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 1% 1M NH4OH4-Octan, 0,1% kwasu octowego w acetonitrylu/2-propanolu 7:3 (klasy UHPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.00 - 12.00</td>
			<td>lg 25% - 11% A</td>
			<td colspan="3">Szybkość przepływu: 400 µL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12.00 - 15.00</td>
			<td>lg 11% - 0% A</td>
			<td colspan="3">Objętość wtrysku: 2 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.00 - 19.50</td>
			<td>cw 0% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.50-19.51</td>
			<td>0% - 45% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.51-24.00</td>
			<td>eq 45%</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Ustawienia UHPLC-MS/MS dla metabolitów polarnych i półpolarnych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas [min]</td>
			<td>Eluent A i B [%]*</td>
			<td colspan="3">Informacje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 - 1.00</td>
			<td>99% A</td>
			<td colspan="3">Eluent A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (stopnia czystości UHPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00 - 11.00</td>
			<td>lg 99% -60% A</td>
			<td colspan="3">Eluent B: 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (klasy UHPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11.00 - 13.00</td>
			<td>lg 60% - 30% A</td>
			<td colspan="3">Przepływ: 400 µL/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.00 - 15.00</td>
			<td>lg 30% - 1% A</td>
			<td colspan="3">Objętość iniekcji: 3 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15.00 - 16.00</td>
			<td>cw 1% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16.00 - 17.00</td>
			<td>lg 1% - 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17.00 - 20.00</td>
			<td>eq 99% A</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Ustawienia GC-MS dla metabolitów poddanych pochodnowaniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas [min]</td>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td colspan="3">Informacje</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 - 2.00</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="3">Gaz nośny: Hel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00 - 18.66</td>
			<td>lg 80 - 330</td>
			<td colspan="3">Szybkość przepływu: 2 ml/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18.66 - 24.66</td>
			<td>cw 330</td>
			<td colspan="3">Gradient temperatury: 15 °C/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24.66</td>
			<td>szybkie chłodzenie</td>
			<td colspan="3">Objętość iniekcji: 1 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Ustawienia gradientu dla każdej z platform analitycznych7. Skróty: lg = gradient liniowy; cw = płukanie kolumny; eq = równoważenie; UHPLC-MS = ultra-wysoko wydajna chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas; UHPLC-MS/MS = ultra-wysoko wydajna chromatografia cieczowa sprzężona z tandemową spektrometrią mas; GC-MS = chromatografia gazowa sprzężona z spektrometrią mas. * = wartość procentowa odpowiada eluentowi A; pozostała wartość procentowa odpowiada eluentowi B.
Tabela uzupełniająca 1: Surowe dane lipidomiczne. Przedstawia intensywności pików dla każdego z wykrytych klastrów w każdej próbce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62732/Supplementary%20Table%201%20.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

W tym protokole prezentujemy zoptymalizowany przepływ pracy, który łączy w sobie efektywne i szybkie przygotowanie wielu próbek. Ponadto udostępniamy przewodnik krok po kroku, jak zmniejszyć odchylenia analityczne w celu wysokoprzepustowej oceny metabolicznych badań GWAS.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Both gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) are widely used metabolomics approaches to detect ...

Badanie większej populacji wiąże się z odmianą sterowaną przez maszynę, która z kolei jest rzeczywistą zmiennością wynikającą z naturalnej różnorodności. W tym miejscu demonstrujemy metodę zmniejszania zmienności technicznej dla dalszej analizy integracji. Do zalet tej techniki należy ekstrakcja oparta na separacji czołowej, zapewniająca analizę różnych metabolitów na odpowiedniej platformie analitycznej, przy jednoczesnym usunięciu błędu systemowego i zachowaniu wariancji biologicznej.Po uzyskaniu informacji genotypowych i fenotypowych metoda ta może być zastosowana do dowolnej zróżnicowanej populacji naturalnej w dowolnym królestwie życia. Aby rozpocząć, weź 20-mililitrowe probówki do zbioru, dodaj dwa pięciomilimetrowe i dwa metalowe koraliki o średnicy ośmiu milimetrów do homogenizacji i oznacz probówki. Następnie napełnij dewara ciekłym azotem, natychmiast po pokrojeniu zbierz świeże próbki tkanek liści i korzeni w ciekłym azocie przez błyskawiczne zamrażanie.Zebrane próbki biologiczne przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki. Wstępnie schłodzić uchwyty probówek w ciekłym azocie. Następnie miel tkanki z częstotliwością 25 Hz przez jedną minutę, aby uzyskać jednorodny proszek.Powtórz zamrażanie i mielenie, jeśli tkanka nie jest jednorodnie zmielona. Odważyć 50 miligramów świeżego materiału roślinnego we wstępnie schłodzonych, dwumilimetrowych, dwumilimetrowych probówkach wirówkowych z bezpiecznym zamkiem, zapewniając, że materiał roślinny pozostanie zamrożony podczas procesu ważenia. Dodać jeden mililitr wstępnie schłodzonej mieszaniny ekstrakcyjnej o objętości od 1 do 50 miligramów próbki i krótko wymieszać probówkę przed pozostawieniem na lodzie.Inkubować próbki na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dokonywać sonikacji w chłodzonej lodem kąpieli sonicyjnej przez 10 minut. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj do próbek 500 mikrolitrów mieszaniny ekstrakcyjnej i wymieszaj ekstrakty przez krótkie wirowanie, a następnie odwiruj mieszaninę przy 11 200 razy G przez 5 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś 500 mikrolitrów oddzielonej górnej fazy zawierającej lipidy do wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z bezpiecznym zamkiem, usuń resztę górnej fazy.W oddzielnych, 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych z bezpiecznym zamkiem przenosi się 150 mikrolitrów dolnej fazy półpolarnej cztery GCMS i 300 mikrolitrów fazy półpolarnej czwartej analizy MS U-H-P-L-C. Użyj koncentratora próżniowego do odparowania rozpuszczalnika, aby zagęścić wszystkie wyekstrahowane frakcje bez ogrzewania i przechowuj wysuszone frakcje w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować próbkę do ultra wysokiej wydajności, chromatografia cieczowa, spektrometria mas lub H-P-L-C MS ponownie zawiesić wysuszone frakcje półpolarne w 180 mikrolitrach mieszaniny metanolu i wody.Następnie sonikować fazę półpolarną przez 2 minuty, a następnie odwirować przy 11 200 razy G przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieść 90 mikrolitrów supernatantu do szklanej fiolki i wstrzyknąć dwa mikrolitry ekstraktów do wlanej próbki LCMS. Przeprowadzić frakcjonowanie metabolitów na kolumnie C18 z odwróconą fazą utrzymywaną w temperaturze 40 stopni Celsjusza i przepływie 400 mikrolitrów na minutę ze stopniowymi zmianami ścieków A i B, uzyskać widma masowe próbki testowej próby ślepej i próbki kontroli jakości w trybie jonizacji ujemnej o zakresie masowym 102 1500 stosunek masy do ładunku.W przypadku próbek metabolitów półpolarnych należy przeprowadzić zbiorczą próbkę kontroli jakości w tandemowej spektrometrii mas zależnej od danych w trybach jonizacji ujemnej i dodatniej. Do adnotacji należy wykorzystać uzyskane widma masy. Wykonaj normalizację zbioru danych, sprawdzając rozkład wzorca wewnętrznego.Znormalizuj dane, korygując sygnał jednego lub wielu wzorców wewnętrznych. Następnie należy skorygować natężenia pików uzyskane z chromatogramu na dokładną masę próbki. Aby skorygować dryft intensywności w seriach wielostronicowych, należy wykonać metody korekcji oparte na kontroli jakości, takie jak lokalnie szacowane wygładzanie wykresu rozrzutu przy użyciu R. Przed wykonaniem badań asocjacyjnych całego genomu lub GWAS, przefiltruj dane genotypowe pod kątem częstości występowania alleli mniejszych mniejszych niż 5% i współczynnika braków większego niż 10% za pomocą frędzla.Pozwoli to uniknąć stronniczości niskiej częstotliwości. Aby wyeliminować odchylenie wynikające z czynników środowiskowych, użyj pakietu R LME cztery i oblicz najlepsze liniowe, bezstronne przewidywania lub błędy dla każdej znormalizowanej cechy w powtórzeniach eksperymentalnych. Użyj blopów każdej cechy indywidualnie, aby wykonać GWAS z pakietem rMVP w R. Dane lipidomiczne dla kilku popularnych gatunków fasoli są pokazane na podstawie surowych chromatogramów pików podstawowych dwóch próbek QC z różnych partii.Zaobserwowano różnice w intensywności sygnału dla niektórych klas lipidów. Błąd systemowy był bardziej widoczny, gdy analiza głównych składowych została przeprowadzona na surowych danych. Procedura normalizacji, w tym lokalnie oszacowane wygładzenie wykresu rozrzutu, doprowadziła do grupowania próbek QC.Podczas analizy poszczególnych klastrów błędy sterowane maszynowo w partii siódmej i ósmej stały się jasne przed normalizacją, która została skorygowana. Do GWAS wykorzystano postznormalizowane i przekształcone indywidualne klastry metabolomiczne, uzyskując kilka powiązań markerów cech. W analizie reprezentatywnej różne klasy związków są wyróżnione różnymi kolorami, podczas gdy markery związane z wieloma klasami związków są oznaczone najbliższym genem.Normalizacja i transformacja danych to jeden z najważniejszych kroków. Upewnij się, że została wykonana odpowiednia korekta w celu skorygowania błędu systemowego i zapewnienia normalności w dystrybucji. Dokonując korekty dla zmienności analitycznej, można zastosować kilka podejść do integracji, takich jak analiza korelacji metabolicznej i integracja z danymi fenomicznymi, aby rzucić światło na złożone cechy.

large-scale-multi-omics-genome-wide-association-studies-mo-gwas

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano protokół, który wykorzystuje testy Infinium firmy Illumina do przeprowadzania genotypowania na dużą skalę. Testy te mogą niezawodnie genotypować miliony SNP w setkach pojedynczych próbek DNA w ciągu trzech dni. Po wygenerowaniu genotypy te można wykorzystać do sprawdzenia powiązań z wieloma różnymi chorobami lub fenotypami.

Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Uruchamiając narzędzie do badania asocjacji ścieżek (PAST), czy to za pomocą aplikacji Shiny, czy przez konsolę R, badacze mogą uzyskać głębsze zrozumienie biologicznego znaczenia wyników badania asocjacyjnego całego genomu (GWAS), badając zaangażowane szlaki metaboliczne.

Narzędzie do badania asocjacji szlaków do analiz GWAS informacji o szlakach metabolicznych

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Sukces transkryptomiki i multiomiki pojedynczej komórki/pojedynczego jądra w dużej mierze zależy od jakości komórek/jąder. Dlatego izolowanie komórek/jąder od tkanek i ich oczyszczanie musi być wysoce ustandaryzowane. Protokół ten opisuje przygotowanie jąder z mózgu i szpiku kostnego do dalszego testu multiomu pojedynczego jądra.

Wysokiej jakości preparatyka jąder mózgu i szpiku kostnego do oznaczania wieloomów pojedynczych jąder

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Poznaj optymalizowaną metodę przygotowania próbek i normalizacji danych dla wielkoskalowych studiów GWAS metabolomicznych. Protokół ten minimalizuje wariacje techniczne i poprawia dokładność analizy związków metabolicznych.

Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Przeglądaj więcej filmów