Large-Scale Multi-Omimic Genome-Wide Association Studies (Mo-GWAS): Wytyczne dotyczące przygotowania i normalizacji próbek

Badanie większej populacji wiąże się z odmianą sterowaną przez maszynę, która z kolei jest rzeczywistą zmiennością wynikającą z naturalnej różnorodności. W tym miejscu demonstrujemy metodę zmniejszania zmienności technicznej dla dalszej analizy integracji. Do zalet tej techniki należy ekstrakcja oparta na separacji czołowej, zapewniająca analizę różnych metabolitów na odpowiedniej platformie analitycznej, przy jednoczesnym usunięciu błędu systemowego i zachowaniu wariancji biologicznej.

Po uzyskaniu informacji genotypowych i fenotypowych metoda ta może być zastosowana do dowolnej zróżnicowanej populacji naturalnej w dowolnym królestwie życia. Aby rozpocząć, weź 20-mililitrowe probówki do zbioru, dodaj dwa pięciomilimetrowe i dwa metalowe koraliki o średnicy ośmiu milimetrów do homogenizacji i oznacz probówki. Następnie napełnij dewara ciekłym azotem, natychmiast po pokrojeniu zbierz świeże próbki tkanek liści i korzeni w ciekłym azocie przez błyskawiczne zamrażanie.

Zebrane próbki biologiczne przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki. Wstępnie schłodzić uchwyty probówek w ciekłym azocie. Następnie miel tkanki z częstotliwością 25 Hz przez jedną minutę, aby uzyskać jednorodny proszek.

Powtórz zamrażanie i mielenie, jeśli tkanka nie jest jednorodnie zmielona. Odważyć 50 miligramów świeżego materiału roślinnego we wstępnie schłodzonych, dwumilimetrowych, dwumilimetrowych probówkach wirówkowych z bezpiecznym zamkiem, zapewniając, że materiał roślinny pozostanie zamrożony podczas procesu ważenia. Dodać jeden mililitr wstępnie schłodzonej mieszaniny ekstrakcyjnej o objętości od 1 do 50 miligramów próbki i krótko wymieszać probówkę przed pozostawieniem na lodzie.

Inkubować próbki na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 800 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dokonywać sonikacji w chłodzonej lodem kąpieli sonicyjnej przez 10 minut. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj do próbek 500 mikrolitrów mieszaniny ekstrakcyjnej i wymieszaj ekstrakty przez krótkie wirowanie, a następnie odwiruj mieszaninę przy 11 200 razy G przez 5 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu przenieś 500 mikrolitrów oddzielonej górnej fazy zawierającej lipidy do wstępnie oznakowanej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z bezpiecznym zamkiem, usuń resztę górnej fazy.

W oddzielnych, 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych z bezpiecznym zamkiem przenosi się 150 mikrolitrów dolnej fazy półpolarnej cztery GCMS i 300 mikrolitrów fazy półpolarnej czwartej analizy MS U-H-P-L-C. Użyj koncentratora próżniowego do odparowania rozpuszczalnika, aby zagęścić wszystkie wyekstrahowane frakcje bez ogrzewania i przechowuj wysuszone frakcje w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować próbkę do ultra wysokiej wydajności, chromatografia cieczowa, spektrometria mas lub H-P-L-C MS ponownie zawiesić wysuszone frakcje półpolarne w 180 mikrolitrach mieszaniny metanolu i wody.

Następnie sonikować fazę półpolarną przez 2 minuty, a następnie odwirować przy 11 200 razy G przez jedną minutę. Po odwirowaniu przenieść 90 mikrolitrów supernatantu do szklanej fiolki i wstrzyknąć dwa mikrolitry ekstraktów do wlanej próbki LCMS. Przeprowadzić frakcjonowanie metabolitów na kolumnie C18 z odwróconą fazą utrzymywaną w temperaturze 40 stopni Celsjusza i przepływie 400 mikrolitrów na minutę ze stopniowymi zmianami ścieków A i B, uzyskać widma masowe próbki testowej próby ślepej i próbki kontroli jakości w trybie jonizacji ujemnej o zakresie masowym 102 1500 stosunek masy do ładunku.

W przypadku próbek metabolitów półpolarnych należy przeprowadzić zbiorczą próbkę kontroli jakości w tandemowej spektrometrii mas zależnej od danych w trybach jonizacji ujemnej i dodatniej. Do adnotacji należy wykorzystać uzyskane widma masy. Wykonaj normalizację zbioru danych, sprawdzając rozkład wzorca wewnętrznego.

Znormalizuj dane, korygując sygnał jednego lub wielu wzorców wewnętrznych. Następnie należy skorygować natężenia pików uzyskane z chromatogramu na dokładną masę próbki. Aby skorygować dryft intensywności w seriach wielostronicowych, należy wykonać metody korekcji oparte na kontroli jakości, takie jak lokalnie szacowane wygładzanie wykresu rozrzutu przy użyciu R. Przed wykonaniem badań asocjacyjnych całego genomu lub GWAS, przefiltruj dane genotypowe pod kątem częstości występowania alleli mniejszych mniejszych niż 5% i współczynnika braków większego niż 10% za pomocą frędzla.

Pozwoli to uniknąć stronniczości niskiej częstotliwości. Aby wyeliminować odchylenie wynikające z czynników środowiskowych, użyj pakietu R LME cztery i oblicz najlepsze liniowe, bezstronne przewidywania lub błędy dla każdej znormalizowanej cechy w powtórzeniach eksperymentalnych. Użyj blopów każdej cechy indywidualnie, aby wykonać GWAS z pakietem rMVP w R. Dane lipidomiczne dla kilku popularnych gatunków fasoli są pokazane na podstawie surowych chromatogramów pików podstawowych dwóch próbek QC z różnych partii.

Zaobserwowano różnice w intensywności sygnału dla niektórych klas lipidów. Błąd systemowy był bardziej widoczny, gdy analiza głównych składowych została przeprowadzona na surowych danych. Procedura normalizacji, w tym lokalnie oszacowane wygładzenie wykresu rozrzutu, doprowadziła do grupowania próbek QC.

Podczas analizy poszczególnych klastrów błędy sterowane maszynowo w partii siódmej i ósmej stały się jasne przed normalizacją, która została skorygowana. Do GWAS wykorzystano postznormalizowane i przekształcone indywidualne klastry metabolomiczne, uzyskując kilka powiązań markerów cech. W analizie reprezentatywnej różne klasy związków są wyróżnione różnymi kolorami, podczas gdy markery związane z wieloma klasami związków są oznaczone najbliższym genem.

Normalizacja i transformacja danych to jeden z najważniejszych kroków. Upewnij się, że została wykonana odpowiednia korekta w celu skorygowania błędu systemowego i zapewnienia normalności w dystrybucji. Dokonując korekty dla zmienności analitycznej, można zastosować kilka podejść do integracji, takich jak analiza korelacji metabolicznej i integracja z danymi fenomicznymi, aby rzucić światło na złożone cechy.