Test Shuttle Box jako narzędzie asocjacyjnego uczenia się do oceny poznawczej w badaniach nad uczeniem się i pamięcią przy użyciu dorosłych danio pręgowanego
12 lipca 2021
Uczenie się i pamięć są potężnymi wskaźnikami w badaniu zaburzeń poznawczych wywołanych przez rozwój, chorobę lub środowisko. Większość ocen poznawczych wymaga specjalistycznego sprzętu i dużego zaangażowania czasowego. Jednak test shuttle box jest narzędziem do uczenia się asocjacyjnego, które wykorzystuje konwencjonalne pudełko żelowe do szybkiej i wiarygodnej oceny funkcji poznawczych dorosłych danio pręgowanego.
Test Shuttle Box w sposób powtarzalny śledzi postęp i powrót do zdrowia po upośledzeniu funkcji poznawczych po urazie narzędziem lub innym rodzaju urazu mózgu u danio pręgowanego. Test Shuttle Box pozwala na stosunkowo prosty, szybki i solidny pomiar uczenia się asocjacyjnego zarówno w pamięci krótko-, jak i długotrwałej u danio pręgowanego. Na początek przygotuj Shuttle Box, modyfikując pudełko żelowe o wymiarach 30,5 na 19 na 7,5 centymetra z kawałkiem pleksi akwariowej o wymiarach 5 na 19 centymetrów dodanym z każdej strony pod kątem 45 stopni.
Następnie narysuj linię wyznaczającą połowę punktu zbiornika, aby ocenić, kiedy ryby przekroczyły środek zbiornika. Po dodaniu 800 mililitrów wody systemowej do Shuttle Box, umieść dwie do trzech ryb w zbiorniku zawierającym wodę systemową. Pozostaw zbiornik w ciemnym pomieszczeniu, w którym zostanie przeprowadzony test Shuttle Box.
Następnie w ciemnym pomieszczeniu umieść jedną rybę na środku Shuttle Box. Zabezpiecz pokrywę i podłącz elektrody do źródła zasilania. Ryby należy zaaklimatyzować w ciemności.
Wyłącz wszystkie światła i przyzwyczaj ryby do Shuttle Box na 15 minut. Udaną aklimatyzację można rozważyć, gdy ryba swobodnie eksploruje zbiornik. Po udanej aklimatyzacji ryby, ręcznie zaświec latarką z czerwonym obiektywem o mocy 800 lumenów około dwóch centymetrów od ściany pudełka żelowego po stronie zajmowanej przez rybę.
Nie rozpoczynaj próby, jeśli ryba spoczywa obok platynowego drutu. Skieruj bodziec świetlny bezpośrednio na rybę i ręcznie śledź każdy ruch boczny ryby za pomocą światła, aby zapewnić ciągłą wizualizację bodźca. Kontynuuj dostarczanie bodźca świetlnego, dopóki nie zostanie spełniony jeden z następujących warunków udanej lub nieudanej próby.
Uznaj, że próba zakończyła się sukcesem, jeśli ryba przekroczy połowę wysokości zbiornika w ciągu 15 sekund od ekspozycji na światło. Gdy ryba przekroczy półmetek, natychmiast zatrzymaj bodziec świetlny. Jeśli próba się nie powiedzie, użyj zasilacza do elektroforezy, aby zastosować ujemny bodziec uderzeniowy o napięciu 20 miliwoltów na jeden amper, naprzemiennie włączając dwie sekundy i wyłączając dwie sekundy na 15 sekund z maksymalnie czterema wstrząsami lub do momentu, gdy ryba przekroczy połowę pudełka.
Następnie zakończ zarówno bodziec świetlny, jak i negatywny. Przed okresem treningowym upewnij się, że ryba pomyślnie zaaklimatyzuje się do Shuttle Box, pozostawiając ryby w ciemności na 15 minut. Następnie ręcznie zaświec latarką z czerwonym obiektywem o mocy 800 lumenów około dwóch centymetrów od ściany pudełka żelowego po stronie zajmowanej przez rybę.
Skieruj bodziec świetlny bezpośrednio na rybę i śledź każdy ruch boczny ryby za pomocą światła, aby zapewnić ciągłą wizualizację bodźca. Podczas gdy światło świeci na rybę, jednocześnie zastosuj niekorzystny bodziec uderzeniowy o napięciu 20 miliwoltów na jeden amper, naprzemiennie włączając dwie sekundy i wyłączając dwie sekundy na 15 sekund z maksymalnie czterema wstrząsami lub do momentu, gdy ryba przekroczy połowę pudełka. Gdy to osiągniesz, zakończ lekki i niekorzystny bodziec.
Powtórz dla 25 iteracji. Po zakończeniu pozwól rybie na kolejny okres aklimatyzacji trwający 15 minut w ciemności. Podczas początkowego okresu testowania przeprowadź udaną aklimatyzację w Shuttle Box przez 15 minut, a następnie zastosuj tylko bodziec świetlny przez maksymalnie 15 sekund i zapisz odpowiedzi.
Próbę należy uznać za udaną, jeśli ryba przekroczy połowę punktu wahadłowca w ciągu 15 sekund po uruchomieniu bodźca świetlnego i zatrzyma bodziec świetlny natychmiast, gdy ryba przekroczy punkt połowy. Próbę należy uznać za nieudaną, jeśli ryba nie przekroczy połowy punktu Shuttle Box 15 sekund po uruchomieniu bodźca świetlnego i zatrzyma bodziec świetlny po 15 sekundach. Podczas wstępnych testów nie należy stosować niekorzystnego bodźca po nieudanej próbie.
Wykonaj test pamięci krótkotrwałej natychmiast po początkowym okresie testowania. Wywołaj dramatyczne uszkodzenie mózgu i odczekaj cztery godziny przed badaniem. Następnie zaaklimatyzuj rybę w pudełku wahadłowym przez 15 minut.
Oceń pamięć krótkotrwałą, stosując tylko bodziec świetlny przez okres do 15 sekund i zapisz, czy ryba przekroczy połowę pudełka przed wyłączeniem światła, co zostanie uznane za zaliczoną próbę, lub czy nie przekroczy połowy drogi w ciągu 15 sekund uznawanych za nieudaną próbę. Powtórz powyższy krok 25 razy z 30-sekundowym okresem odpoczynku między każdą próbą i zapisz liczbę udanych i nieudanych prób. Wykonaj test pamięci długotrwałej cztery dni po wstępnym testowaniu.
Wywołaj urazowe uszkodzenie mózgu i odczekaj cztery godziny przed badaniem, a następnie zaaklimatyzuj rybę w pudełku wahadłowym przez 15 minut. Oceń pamięć długotrwałą, stosując tylko bodziec świetlny przez okres do 15 sekund i zapisz, czy ryba przekroczy połowę długości pudełka przed wyłączeniem światła, co zostanie uznane za zaliczoną próbę, lub czy nie przekroczy połowy drogi w ciągu 15 sekund uznawanych za nieudaną próbę. Powtórz powyższe 25 razy z 30-sekundowym okresem odpoczynku między każdą próbą i zapisz liczbę udanych i nieudanych prób.
Instruktażowy przegląd paradygmatów uczenia się i pamięci do oceny poznawczej jest pokazany tutaj. Nieuszkodzona ryba w wieku ośmiu miesięcy, młody dorosły w wieku 18 miesięcy, dorosły w średnim wieku i 24-miesięczny dorosły w podeszłym wieku, wymagała podobnej liczby prób, aby nauczyć się zachowania unikania czerwonego światła. Po wykorzystaniu modelu STBI (Severe Blunt Traumatic Brain Injury Model, STBI), ryby w różnym wieku wymagały podobnej liczby prób, aby opanować test w ciągu jednego do pięciu dni po urazie.
Pierwszego dnia po STBI ryby w każdym wieku wymagały podobnej liczby prób, aby nauczyć się zachowania, która była znacznie większa niż w przypadku nieuszkodzonych grup kontrolnych. Nieuszkodzona ryba szybko opanowała Shuttle Box, osiągając pięć kolejnych pozytywnych prób w około 17 próbach, podczas gdy jeden dzień po łagodnym uszkodzeniu mózgu lub łagodnym TBI, ryby wykazują znaczny wzrost liczby prób nauczenia się zachowania. Deficyt ten zwiększył się po dwóch łagodnych urazach TBI i był jeszcze bardziej zwiększony po trzech łagodnych urazach TBI.
Nieuszkodzone ryby wykazują niewielki wzrost procentowej różnicy w udanych próbach w pamięci natychmiastowej i pamięci opóźnionej w porównaniu z początkowym okresem testowania. Po pojedynczym łagodnym TBI ryby wykazywały znaczne i natychmiastowe deficyty pamięci w porównaniu z rybami nieuszkodzonymi. Tendencja ta utrzymywała się z powtarzającymi się urazami z rosnącymi deficytami zarówno po dwóch łagodnych TBI, jak i trzech łagodnych TBI.
Kluczowe znaczenie ma czas zastosowania niepożądanych bodźców. Sprzężenie niekorzystnych bodźców ze światłem i ich jednoczesne usunięcie utrwala ich skojarzenie i jest kluczowe dla paradygmatu. Test pozwala na szybką ocenę lub złożone uczenie się asocjacyjne, które można wykorzystać do zbadania wpływu rozwoju, starzenia się i środowiska na upośledzenie funkcji poznawczych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Test w skrzynce wahadłowej (Shuttle Box Assay) jest narzędziem oceny poznawczej stosowanym do pomiaru uczenia się asocjacyjnego u dorosłych danio pręgowanych, szczególnie w kontekście zaburzeń poznawczych wywołanych urazami. Metoda ta umożliwia szybką ocenę zarówno pamięci krótkotrwałej, jak i długotrwałej po urazach mózgu, co ułatwia badanie dynamiki uczenia się i pamięci w prostym układzie eksperymentalnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia behawioralna
- Kognitywistyka
Wstęp
- Test Shuttle Box (Shuttle Box Assay) to innowacyjne narzędzie usprawniające ocenę poznawczą u danio pręgowanych.
- Upraszcza on proces ewaluacji w porównaniu z tradycyjnymi metodami wymagającymi specjalistycznego sprzętu.
- Model ten jest szczególnie użyteczny w badaniu efektów poznawczych urazów tępych oraz innych uszkodzeń neurologicznych.
- Test ten bada zarówno zdolności uczenia się, jak i dynamikę powrotu do sprawności po urazie.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody śledzenia regeneracji poznawczej u rybek zebrafish po urazach mózgu.
- Zbadanie, w jaki sposób wiek i uraz wpływają na uczenie się i pamięć oceniane za pomocą testu Shuttle Box Assay.
- Zapewnienie wglądu w mechanizmy uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na bodźce.
Zastosowane metody
- Główną wykorzystaną platformą jest zmodyfikowany pojemnik żelowy zaprojektowany do oceny zachowania rybek zebrafish.
- Podstawowy model biologiczny stanowią dorosłe rybki zebrafish poddane ocenie poznawczej i wyzwaniom po urazie mózgu.
- Metoda obejmuje systematyczne okresy aklimatyzacji, bodźce świetlne oraz łagkie wstrząsy elektryczne w celu oceny pamięci.
- Testowanie obejmuje sekwencyjne próby oceniające zdolności pamięci krótkotrwałej i długotrwałej w różnych odstępach czasu po urazie.
- Trening jest powtarzany w wielu iteracjach, aby uzyskać spójny pomiar efektywności uczenia się.
Główne wyniki
- Test w komorze wahadłowej (Shuttle Box Assay) wykazał istotny związek między stopniem nasilenia urazu mózgu a liczbą prób wymaganych do nauczenia rybek zebrafish zachowań unikowych.
- Zebrafish bez uszkodzeń szybko opanowały zachowanie unikowe, natomiast osobniki z urazami wymagały większej liczby prób.
- Reakcje zaobserwowano w różnych grupach wiekowych, co wskazuje na spójne wzorce uczenia się niezależnie od wieku po wystąpieniu urazu.
- Oceny pamięci długotrwałej i krótkotrwałej ujawniły odmienne profile regeneracji w zależności od czasu przeprowadzenia oceny poznawczej po urazie.
Wnioski
- Niniejsze badanie potwierdza, że test Shuttle Box Assay jest wartościowym narzędziem do badania upośledzenia i regeneracji funkcji poznawczych.
- Zdobyta wiedza przyczynia się do lepszego zrozumienia procesów uczenia się asocjacyjnego u danio pręgowanego, co ma znaczenie dla badań nad urazami mózgu.
- Wyniki wskazują na potencjał danio pręgowanego jako skutecznego modelu do badania mechanizmów regeneracji neuropoznawczej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test Shuttle Box stanowi szybką i powtarzalną metodę oceny uczenia się asocjacyjnego oraz pamięci u rybek danio-ostroskrzelnych, umożliwiając wczesne wykrywanie deficytów poznawczych po urazie czaszkowo-mózgowym. Prostota badania oraz minimalne wymagania sprzętowe wspierają skalowalne przesiewy w neuronauce odkrywczej, ułatwiając walidację celów dla związków neuroprotekcyjnych lub neuroregeneracyjnych. Zdolność tego testu do monitorowania progresji poznawczej i powrotu do zdrowia w różnych grupach wiekowych zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach chorób neurodegeneracyjnych i TBI.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ilościowe określanie deficytów uczenia się i pamięci po urazie mózgu, co wspiera potwierdzenie oddziaływania na cel oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez powtarzalny pomiar upośledzenia funkcji poznawczych i powrotu do sprawności w modelu kręgowca.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację związków niwelujących deficyty uczenia się, co usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) na wczesnym etapie odkrywania leków.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego testowania związków poprzez ustalenie bazowej wydajności uczenia się oraz deficytów wywołanych urazem.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe odczyty (liczba prób do osiągnięcia kryterium), które zwiększają powtarzalność analiz oraz spójność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia gotowość do wysokoprzepustowych badań dzięki krótkim cyklom treningowym i minimalnej liczbie manipulacji, wspierając powtarzalne testy w grupach terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie deficytów poznawczych u dorosłych danio-zebry po TBI, co odzwierciedla fenotypy kliniczne.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie ciągłości translacyjnej od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez monitorowanie natychmiastowej i odroczonej regeneracji pamięci w ciągu wielu dni.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wsparcie procesów decyzyjnych poprzez rozdzielenie efektów wpływających na pamięć natychmiastową i odroczoną, co pozwala na opracowanie strategii interwencyjnych specyficznych dla danego mechanizmu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test Shuttle Box wpisuje się w kontinuum odkryć – od weryfikacji hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację wiodących związków, zapewniając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do punktów końcowych funkcji poznawczych w programach badań nad chorobami neuropsychiatrycznymi i neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar uczenia się asocjacyjnego jako funkcjonalnego wskaźnika integralności obwodów neuronalnych po urazie.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanej aklimatyzacji, parowaniu bodźców i punktacji opartej na próbach, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (udane próby w ciągu 15 sekund), które pozwalają na statystyczne porównanie skuteczności uczenia się w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę pamięci krótko- (4 godziny) i długotrwałej (4 dni), odzwierciedlając dynamikę czasową regeneracji poznawczej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do iteracyjnych testów w różnych genotypach, grupach wiekowych i schematach leczenia, co ogranicza redundantny rozwój modeli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach uczenia się i pamięci.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki stałym parametrom bodźców (natężenie światła, czas trwania wstrząsu, limity prób) oraz zaślepionym kryteriom oceny.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania deficytów poznawczych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach opracowywania leków na OUN.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację związków, które niwelują deficyty uczenia się bez wpływu na pamięć odroczoną, co wskazuje na selektywność mechanizmu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli i obsługi danio przebranych, neuronauki behawioralnej oraz podstaw elektrofizjologii w celu podawania bodźców.
- Metoda zależy od dostępu do ciemni, zasilacza do elektroforezy oraz zestandaryzowanej modyfikacji komory do elektroforezy z przegrodami z pleksiglasu.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów aklimatyzacji, czasu podawania bodźca oraz definicji prób w celu zapewnienia porównywalności danych.
- W przypadku rozszerzenia metody na modele larwalne lub inne gatunki należy uwzględnić kwestie adaptacyjne ze względu na różnice w wielkości, tolerancji wstrząsów i ostrości widzenia.
- Wrażliwość testu na stres i stany motywacyjne, które mogą wpływać na wyniki niezależnie od funkcji poznawczych (zgodnie z wymaganiami aklimatyzacyjnymi w protokole), stanowi ograniczenie metody.
