Name: Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genu bezkomórkowej przy użyciu szczepu Escherichia coli. Protokół ten umożliwia szybkie uzyskanie wysokiej jakości lizatów w standardowym laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Zachary'emu Sunowi i Richardowi Murrayowi (California Institute of Technology) za uprzejme dostarczenie plazmidu P_araBAD-gamS, oraz Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) za uprzejme dostarczenie wirówki chłodzącej o dużej prędkości. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health oraz z programu ARO MURI i były częściowo wspierane przez Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japonia.

1. Przygotuj nośniki i.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę 2xYTPG.
	<ol>
		<li>Wymieszaj 62 g proszku 2xYT, 5,99 g fosforanu potasu jednozasadowego, 13,93 g dwuzasadowego fosforanu potasu i wody dejonizowanej do 2 l.</li>
		<li>Autoklaw w cyklu ciekłym z czasem naświetlania 30 min14.</li>
		<li>Do 400 ml pożywki 2xYTP z 1.1.2 dodać 7,2 g D-glukozy (dekstrozy) i mieszać aż do rozpuszczenia.</li>
		<li>Sterylizacja filtracyjna przez filtr 0,2 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj bufor S30A.
	<ol>
		<li>Wymieszaj Tris-HCl (pH 7,7, stężenie końcowe 50 mM), glutaminian potasu (60 mM końcowy) i glutaminian magnezu (14 mM końcowy).</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,7 za pomocą 10 M KOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór 1 (patrz Tabela 1).
	<ol>
		<li>Zawiesić kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) w 2 ml wody.</li>
		<li>Dostosuj pH do 8,0 za pomocą KOH.</li>
		<li>Dodać wszystkie pozostałe składniki z tabeli 1.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 7,6 za pomocą 10 M KOH. Filtruj - sterylizuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 2,5 x roztwór premiksu (patrz Tabela 2).
	<ol>
		<li>Wymieszać wszystkie składniki z tabeli 2.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,5 za pomocą KOH.</li>
		<li>Podwielokrotność porcji i zamrażać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: W reakcji 20 μl zużywa się 8,9 μl premiksu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotuj komórki.
<ol>
	<li>Umieścić komórki autolizatu na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml ampicyliny za pomocą pętli zaszczepiającej i rosnąć w temperaturze 37 °C (patrz uwaga 1).</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety wybrać pojedynczą kolonię do kultury starterowej z LB/ampicyliną i hodować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Zaszczepić 400 ml pożywki 2xYTPG zawierającej 50 μg/ml ampicyliny 400 μl kultury starterowej i rosnąć w temperaturze 37 °C w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, wstrząsając z prędkością 300 obr./min.</li>
	<li>Okresowo mierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru w celu odczytu kuwety optycznej o długości ścieżki 1 cm. Gdy OD600 przekroczy 1, rozpocznij rozcieńczanie kultury 5-krotnie przed pomiarami, aby upewnić się, że pomiary pozostają w zakresie liniowym typowego spektrofotometru laboratoryjnego. Kontynuuj hodowlę komórek, aż 5-krotnie rozcieńczona kultura osiągnie OD600 0,3 (co odpowiada ODkultury 600 1,5).</li>
</ol>
3. Przygotuj lizat.
<ol>
	<li>Przygotować bufor S30A uzupełniony 2 mM ditiotreitolem (DTT). Zmieszać 3 ml buforu S30A z 6 μl roztworu podstawowego DTT w ciągu 1 M. Umieścić na lodzie do użycia w kroku 3.7.</li>
	<li>Zebrać komórki, odwirowując w temperaturze 1800 × g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlać supernatant przez wylanie go i użycie pipety do usunięcia pozostałego płynu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 45 ml zimnego (4-10 °C) bufora S30A za pomocą mieszalnika wirowego.</li>
	<li>Zważyć pustą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml, przenieść do niej komórki i powtórzyć kroki 3.2-3.3, aby umyć komórki.</li>
	<li>Zważyć granulkę, odejmując wagę pustej probówki o pojemności 50 ml. Upewnij się, że ostrożnie zasysasz pozostały supernatant, aby zapewnić dokładny pomiar masy osadu. 
	UWAGA: Typowy plon to ~1,3 g osadu komórkowego z 400 ml kultury produkcyjnej.</li>
	<li>Dodać 2 objętości zimnego buforu S30A uzupełnionego 2 mM ditiotreitolem, tj. 2 ml buforu na każdy 1 g osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki przez energiczne mieszanie wirowe.</li>
	<li>Zamroź komórki. Umieść probówkę o pojemności 50 ml zawierającą komórki w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C, aż granulki zostaną dokładnie zamrożone. 
	UWAGA: Krok zamrażania jest dobrym punktem zatrzymania na cały dzień.</li>
	<li>Rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować energicznie przez 2-3 min.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut z wytrząsaniem przy 300 obr./min.</li>
	<li>Oczyścić próbkę z ciężkich resztek komórkowych przez odwirowanie w przezroczystych probówkach wirówkowych o stężeniu 30 000 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeśli wirówka o wydajności 30 000 x g nie jest dostępna, wiruj przez 45 minut przy 21 000 × g i zachowaj dodatkową ostrożność w kroku 3.13, ponieważ osad będzie mniej zwarty.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki za pomocą pipety, unikając w jak największym stopniu naruszenia osadu. Jeżeli przenoszony supernatant jest zanieczyszczony materiałem z osadu, należy powtórzyć poprzedni krok.</li>
	<li>Przenieść supernatant do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i ponownie odwirować przy 21 000 × g (lub maksymalnej prędkości wirówki stołowej) przez 5 minut.</li>
	<li>Oczyszczony autolizat podzielić na żądane objętości, ostrożnie unikając resztek osadu, i zamrozić w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć. 
	UWAGA: Pojedyncza reakcja o pojemności 20 μl wykorzystuje 8 μl autolizatu.</li>
</ol>
4. Ekspresja genów bezkomórkowa
UWAGA: Autolizat jest teraz gotowy do dowolnego pożądanego końcowego użycia. Poniżej znajduje się przykładowy standardowy protokół ekspresji genów bez komórek.
<ol>
	<li>Aby uzyskać reakcję o objętości 20 μl, wymieszaj z lodem 8 μl autolizatu i 8,9 μl premiksu. Patrz UWAGA na końcu sekcji protokołu dotyczącej optymalizacji stężeń glutaminianu magnezu i PEG 8000.</li>
	<li>Dodać DNA (np. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 do końcowego stężenia 8 nM), wszelkie inne odczynniki i wodę do 20 μl.</li>
	<li>Umieścić reakcję w 384-dołkowej mikropłytce i zmierzyć przebieg czasu fluorescencji i/lub punkty końcowe za pomocą czytnika płytek. W przypadku białka zielonej fluorescencji (GFP) należy użyć długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 520 nm.</li>
</ol>
5. Modyfikacje protokołu
UWAGA: Następujące modyfikacje protokołu umożliwiają mu obsługę innych aplikacji.
<ol>
	<li>Bezkomórkowa ekspresja genów przy użyciu liniowych matryc DNA
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki opisane w sekcji 4, uzupełniając reakcję oczyszczonym białkiem GamS o wielkości 2,2 μM (wyrażonym i oczyszczonym zgodnie z opisem12) przed dodaniem liniowego DNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezkomórkowa ekspresja genów z udziałem degradacji białek
	<ol>
		<li>W kroku 2.1 użyj komórek autolizatu zawierających plazmid pACYC-FLAG-dN6-His (patrz tabela materiałów). We wszystkich podłożach wzrostowych należy dodatkowo dodać 34 μg/ml chloramfenikolu.</li>
		<li>W kroku 2.3 włącz 40 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do pożywki wzrostowej w celu wywołania ekspresji plazmidu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.2-3.4 (mycie) jeszcze dwa razy (w sumie trzy płukania), aby zapewnić całkowite usunięcie chloramfenikolu, który jest inhibitorem translacji. W przypadku pierwszych dwóch płukań (etap 3.4) należy zastąpić bufor S30A solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (pH 7.4).</li>
		<li>W kroku 4.2 uzupełnij dodatkowym 3 mM ATP (dodanym z roztworu podstawowego 100 mM ATP w wodzie, pH 7,2) i 4,5 mM glutaminianu magnezu (używając 1 M roztworu podstawowego w wodzie) (stężenia końcowe) w celu skompensowania wysokiego zużycia ATP przez ClpXP, a także chelatacji magnezu przez dodatkowe ATP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bezkomórkowa ekspresja genów przy użyciu odczytów opartych na LacZ (w tym kolorymetrycznych)
	<ol>
		<li>W kroku 2.1 użyj komórek autolizaty, które nie wykazują natywnej ekspresji LacZ (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie przygotuj lizat bezpośrednio z liofilizowanych komórek.
	<ol>
		<li>Wykonaj wszystkie kroki od 1.1 do 3.7.</li>
		<li>Zmieszać 8 μl zawiesiny komórek z 8,9 μl premiksu.</li>
		<li>Dodaj plazmidowe DNA (w razie potrzeby), inne niestandardowe odczynniki i wodę, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl.</li>
		<li>Przenieść reakcję na 384-dołkową mikropłytkę i wysuszyć ją. 
		UWAGA: Próbki liofilizowane mogą być przechowywane do tygodnia, a nawet dłużej.</li>
		<li>Aby rozpocząć reakcję, należy ją ponownie nawodnić 18 μl wody dejonizowanej uzupełnionej dowolnym pożądanym DNA lub innymi odczynnikami.</li>
		<li>Śledź dynamikę fluorescencji w czytniku płytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA 1: Komórki autolizatu są zaprojektowane do lizy w cyklu zamrażania i rozmrażania, dlatego szczególnie ważne jest stosowanie krioprotektantu podczas wytwarzania zamrożonych zapasów. Zamroziliśmy zapasy w glicerolu 24% wt/vol i przechowywaliśmy je w temperaturze -80 °C.
UWAGA 2: Jony magnezu i PEG 8000 mają kluczowe znaczenie dla wydajności lizatu. Bazowy premiks 2,5x, na podstawie wcześniej opublikowanych danych, zawiera 6 mM glutaminianu magnezu i 4,8% wag./obj. PEG 8000, które w końcowej reakcji osiągają odpowiednio 2,4 mM i 1,9%. Autolizat przygotowany zgodnie z tym protokołem zazwyczaj działa najlepiej z dodatkowymi 5 mM Mg-glutaminianu i 1,5% PEG 8000 w końcowej reakcji. Można to jednak zoptymalizować w zakresie dodatkowych 0-10 mM Mg glutaminianu i dodatkowych 0-3% PEG 8000 (w porównaniu z premiksem bazowym). Aby przygotować premiks z zalecanymi dodatkowymi 5 mM Mg-glutaminianu i 1,5% PEG 8000 (stężenia końcowe), należy wymieszać 380 μL premiksu z 4,75 μl glutaminianu magnezu w 1 M i 36,1 μL PEG 8000 przy 40% masy/objętości.

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
<li>Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+age+of+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The emerging age of cell-free synthetic biology.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).</li>
<li>Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+without+boundaries%3A+cell-free+protein+synthesis+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research.</a> International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).</li>
<li>He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+in+proteomics+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology.</a> New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+prototyping+genetic+networks+with+cell-free+transcription-translation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions.</a> Methods. 86, 60-72 (2015).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+circuit+performance+characterization+and+resource+usage+in+a+cell-free+%22breadboard%22%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard".</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).</li>
<li>Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+reduce+variability+in+E.+coli-based+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cell+on+a+chip+integrated+with+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%222019+IEEE+32nd+International+Conference+on+Micro+Electro+Mechanical+Systems+%28MEMS%29%22%5BJournal%5D)">Artificial cell on a chip integrated with protein degradation.</a> 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).</li>
<li>Garibaldi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+autoclave+protocols+for+successful+decontamination+of+category+A+medical+waste+generated+from+care+of+patients+with+serious+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).</li>
<li>Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
</ol>

J.H. jest współzałożycielem firmy GenCirq Inc, która koncentruje się na terapiach przeciwnowotworowych. Zasiada w Radzie Dyrektorów i posiada udziały w GenCirq.

Opisany tutaj protokół daje wysoce aktywny lizat bakteryjny do ekspresji genów bez komórek. Kluczem jest wykorzystanie komórek przenoszących plazmid pAD-LyseR, który wyraża endolizynę faga lambda cytozolowo. Komórki te są wzmacniane do lizy po przepuszczalności błony wewnętrznej, umożliwiając endolizynie dostęp do ściany komórkowej, co metoda osiąga poprzez prosty cykl zamrażania i rozmrażania. Ponieważ komórki skutecznie się poddają, produkt ten określa się mianem autolizatu. Po lizie komórek jedynymi pozostałymi etapam...

Ekspresja genów w lizatach bezkomórkowych ma kilka zalet w porównaniu z używaniem żywych komórek1,2,3,4. Lizaty mogą być łatwo modyfikowane biochemicznie i stosowane w warunkach, które mogą być szkodliwe lub niemożliwe do osiągnięcia w żywych komórkach. Obwody ekspresji genów nie muszą zmagać się ani konkurować z procesami biologicznymi gospodarza, a testowanie nowych obwodów genetycznych jest tak proste, jak dodanie DNA. Z tych powodów ekspresja genów bez komórek znalazła różne zastosowania, od biosensors5,6 do szybkiego prototypowania obwodów syntetycznych genów7,8 do tworzenia sztucznych komórek9. Większość ekspresji genów bezkomórkowych wykorzystuje lizaty komórkowe, które zostały wysoko przetworzone, zazwyczaj wymagając długich i złożonych protokołów, specjalistycznego sprzętu i/lub wrażliwych kroków, które mogą prowadzić do znacznych różnic między użytkownikami i partiami10,11.
Ten artykuł opisuje prostą, efektywną metodę produkcji lizatu bez komórek, która wymaga minimalnego przetwarzania i specjalistycznej wiedzy (Rysunek 1A)12. Metoda opiera się na komórkach E. coli, które są zaprojektowane do lizy po prostym cyklu zamrażania i rozmrażania. Komórki wyrażają endolizynę z faga lambda, która degraduje ścianę komórkową. W miarę wzrostu komórek ta endolizyna pozostaje w cytoplazmie, oddzielona od ściany komórkowej. Jednak prosty cykl zamrażania i rozmrażania przerywa błonę cytoplazmatyczną, uwalniając endolizynę do peryplazmy, gdzie degraduje ścianę komórkową, powodując szybką lizę komórek. Protokół można wykonać po zaledwie kilku godzinach praktycznej pracy i wymaga jedynie zamrażarki, wirówki o pojemności 30 000 × g (dla optymalnych wyników; można używać niższych prędkości z większą ostrożnością, aby nie naruszyć peletu), mieszalnika wirowego i prostego roztworu buforowego. Funkcjonalny lizat może być nawet wytwarzany przez liofilizację komórek i ich ponowne nawodnienie in situ. Jednak ta metoda wytwarza lizaty o niższej aktywności, prawdopodobnie ze względu na pozostałe resztki komórek.
Lizaty są bardzo aktywne w ekspresji genów bez komórek i mogą być wzmacniane na różne sposoby, w zależności od końcowego zastosowania. Szybkość syntezy białek można dodatkowo zwiększyć poprzez zagęszczenie lizatu za pomocą standardowych koncentratorów spinowych. Liniowe DNA można chronić przed degradacją poprzez dodanie oczyszczonego białka GamS. Degradacja białka, niezbędna dla bardziej złożonej dynamiki obwodów, takich jak oscylacja, może być osiągnięta przez koekspresję heksameru ClpX w szczepionce wytwarzającej autolizat class13. Wreszcie, odczyty wizualne oparte na LacZ są możliwe dzięki użyciu szczepu autolizatu pozbawionego lacZ. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta wytwarza wysoce aktywny lizat bezkomórkowy, który nadaje się do szerokiego zakresu zastosowań.

<table><tbody><tr><td>2xYT media</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>lub odpowiednik</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8877</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15, 3 kDa odcięcie</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>opcjonalnie, może być używany do zagęszczania lizatu, należy dobrać pojemność koncentratora odpowiednią do objętości, która ma być zagęszczona</td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>lub karbenicylina, bardziej stabilny wariant</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>D-glukoza (dekstroza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) przenoszący pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold (DE3) i Delta; lacZ zawierające pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>glutaminian</td> <td>magnezuSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>glutaminian potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>wodorotlenek potasu (KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>do regulacji pH</td></tr><tr><td>dwuzasadowego fosforanu potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85558</td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>mieszanina tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td>lub równoważna</td></tr><tr><td>UTP</td><td>United States Biosciences</td><td>23160</td><td>lub równoważna</td></tr></tbody></table>

szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

Ekspresja genów bez komórek oferuje moc biologii bez komplikacji żywego organizmu. Chociaż istnieje wiele takich systemów ekspresji genów, większość z nich jest dość droga w zakupie i/lub wymaga specjalnego sprzętu i precyzyjnie dopracowanej wiedzy, aby skutecznie produkować. Protokół ten opisuje metodę wytwarzania lizatu bezkomórkowego bakterii, który obsługuje wysoki poziom ekspresji genów, przy użyciu wyłącznie standardowego sprzętu laboratoryjnego i wymaga minimalnego przetwarzania. W metodzie wykorzystuje się szczep Escherichia coli wytwarzający endolizynę, która nie wpływa na wzrost, ale która skutecznie lizuje zebrane osady komórkowe po prostym cyklu zamrażania i rozmrażania. Jedynym wymaganym dalszym przetwarzaniem jest krótka inkubacja, po której następuje wirowanie w celu oczyszczenia autolizatu z resztek komórkowych. Dynamiczne obwody genowe można osiągnąć poprzez heterologiczną ekspresję proteazy ClpX w komórkach przed pobraniem. Szczep E. coli pozbawiony genu lacZ może być wykorzystany do zastosowań biosensorycznych o wysokiej czułości, bez komórek przy użyciu odczytu kolorymetrycznego lub fluorescencyjnego. Cały protokół wymaga zaledwie 8-9 godzin, przy zaledwie 1-2 godzinach pracy praktycznej od zaszczepienia do zakończenia. Zmniejszając koszty i czas uzyskiwania lizatu bezkomórkowego, metoda ta powinna zwiększyć przystępność cenową bezkomórkowej ekspresji genów do różnych zastosowań.

Reprezentatywne wyniki można zaobserwować, wykorzystując autolizat do ekspresji GFP z plazmidu o konstytutywnej ekspresji, w tym przypadku pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, oraz rejestrując przebieg czasowy fluorescencji GFP w czytniku płytek (Rysunek 1B). Seria rozcieńczeń DNA plazmidowego wykazała silną ekspresję nawet przy stężeniu DNA 1 nM. W porównaniu z komercyjnie dostępnym lizatem, autolizat może zapewnić większą całkowitą wydajność i osiągnąć wyższą maksymalną szybkość produkcji, ob...

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

Korzystając z tego protokołu, wysokiej jakości lizaty komórek bakteryjnych mogą być wytwarzane przy użyciu tylko powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego, dzięki czemu ekspresja genów bez komórek jest łatwo dostępna dla większości badaczy. Połączenie programowej autolizy komórkowej z cyklem liofilizacji i rozmrażania lub liofilizacji suszenia pozwala na stworzenie praktycznego, pracochłonnego i opłacalnego podejścia do szybkiej produkcji lizatów bakteryjnych w celu bezkomórkowej ekspresji genów. Zacznij od użycia pętli inokulacyjnej, aby rozprowadzić komórki szczepu E. coli do autolizy na płytkach agarowych LB zawierających 50 mikrogramów na mililitr ampicyliny, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia, za pomocą końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej i dodaj ją do probówki hodowlanej zawierającej pożywkę LB z ampicyliną. Uprawiaj tę kulturę starterową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia dodać 400 mikrolitrów kultury starterowej do jednolitrowej kolby Erlenmeyera zawierającej 400 mililitrów pożywki 2xYTPG uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 300 obr./min. Za pomocą spektrofotometru i kuwety optycznej o długości ścieżki jednego centymetra okresowo mierz gęstość optyczną kultury na głębokości 600 nanometrów. Gdy gęstość optyczna przekroczy jeden, rozpocznij pięciokrotne rozcieńczanie kultury przed pomiarami, aby upewnić się, że pomiary pozostają w zakresie liniowym typowego spektrofotometru laboratoryjnego.Gdy gęstość optyczna pięciokrotnie rozcieńczonej kultury osiągnie 0,3, wyjmij kolbę z inkubatora i przystąp do przygotowania lizatu. Aby przygotować lizat, należy zebrać komórki przez odwirowanie przy 1 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odlej supernatant i usuń pozostały płyn za pomocą pipety.Dodaj 45 mililitrów zimnego buforu S30A do osadu i ponownie zawieś osad przez wirowanie. Następnie zważ pustą 50-mililitrową probówkę wirówkową przed przeniesieniem komórek do probówki. Ponownie odwirować komórki i wyrzucić supernatant.Odessać pozostały supernatant za pomocą pipety. Ponownie zważyć probówkę i odjąć wagę pustej probówki od wyświetlanej wagi, aby uzyskać wagę granulki. Na każdy miligram osadu komórkowego dodać dwa mikrolitry zimnego buforu S30A uzupełnionego dwoma milimolowymi ditiotreitolami.Następnie ponownie zawieś komórki przez energiczne wirowanie. Następnie zamroź komórki, umieszczając je w zamrażarce o temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza, aż granulka zostanie dokładnie zamrożona, a następnie rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej i energicznie wirować przez dwie do trzech minut. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut, wytrząsając przy 300 obr./min, a następnie oczyścić próbkę z ciężkich resztek komórkowych przez odwirowanie w przezroczystych probówkach wirówkowych o stężeniu 30 000 x g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu. Jeżeli przeniesiony supernatant jest zanieczyszczony materiałem z osadu, należy powtórzyć wirowanie. Przenieść supernatant do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.I odwirować jeszcze raz przy 21 000 x g lub maksymalnej prędkości wirówki stołowej przez pięć minut. Podziel oczyszczony autolizat na żądane objętości i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Aby uzyskać bezkomórkową ekspresję genów za pomocą autolizatu, wymieszaj osiem mikrolitrów autolizatu i 8,9 mikrolitrów wstępnej mieszanki na lodzie.Dodać DNA do końcowego stężenia ośmiu nanomoli, wszelkie inne niezbędne odczynniki i wodę, aby uzyskać końcową objętość 20 mikrolitrów. Dodaj reakcję do 384-dołkowej mikropłytki i użyj czytnika płytek, aby zmierzyć przebieg czasu fluorescencji i punkty końcowe. Ekspresja GFP przy użyciu autolizatu z serią rozcieńczeń DNA osocza powoduje silną ekspresję nawet przy jednym nanomolowym DNA.Porównując ekspresję GFP między dostępnym na rynku lyzatem a autolizatem, autolizat wytwarzał porównywalne poziomy GFP. Zmienność między partiami lizatu wyprodukowanego w dwóch różnych laboratoriach przez różnych badaczy była około dwukrotna. Trzy najbardziej krytyczne zmienne to stosunek osadu komórkowego do bufora, przenoszenie supernatantu wolnego od zanieczyszczeń oraz zastosowanie optymalnego stężenia PEG i magnezu w końcowej reakcji.Po przygotowaniu ekstraktu można zastosować duży arsenał istniejących protokołów opracowanych dla bezkomórkowych systemów ekspresji E. coli, takich jak degradacja za pośrednictwem ClpXP lub wykrywanie kworum za pośrednictwem AHL.

rapid-affordable-uncomplicated-production-bacterial-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Źródło: Wiegand, D. J., et al. Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Ten film demonstruje zastosowanie bakteryjnego, bezkomórkowego systemu ekspresji białek opartego na surowym lizacie Vibrio natriegens do przeprowadzenia sprzężonej transkrypcji i translacji in vitro. Skupia się na przygotowaniu głównej mieszanki z niezbędnymi składnikami i stopniowej syntezie funkcjonalnych białek z matrycy DNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu ekstraktu z surowych komórek bakteryjnych

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Bezkomórkowe systemy ekspresji są potężnymi i opłacalnymi narzędziami do wysokoprzepustowej syntezy i badań przesiewowych ważnych białek. W tym miejscu opisujemy przygotowanie bezkomórkowego systemu ekspresji białek przy użyciu natriegenów Vibrio do szybkiej produkcji białek przy użyciu plazmidowego DNA, liniowego DNA i matrycy mRNA.

Ekspresja białek bezkomórkowych przy użyciu szybko rosnącej bakterii Vibrio natriegens

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Prezentujemy szybką i opłacalną metodę produkcji rekombinowanego, bezkomórkowego systemu TX-TL PURE przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego.

System OnePot PURE bezkomórkowy

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Leishmania Translational Extract (LTE) to eukariotyczny system ekspresji białek bez komórek, pochodzący od jednokomórkowego pasożyta, Leishmania tarentolae. Ten zoptymalizowany protokół sprawia, że produkcja LTE jest prosta i opłacalna. Nadaje się do różnych zastosowań skoncentrowanych na wielorównoległej ekspresji i badaniu złożonych białek eukariotycznych i ich interakcji.

Produkcja i optymalizacja LTE, bezkomórkowego systemu ekspresji białek pochodzących z Leishmania tarentolae do produkcji białek rekombinowanych

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

Poznaj prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genu bezkomórkowej przy użyciu szczepu Escherichia coli. Protokół ten umożliwia szybkie uzyskanie wysokiej jakości lizatów w standardowym laboratorium.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Przeglądaj więcej filmów