Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Zbudowaliśmy jednorodny test oparty na kulkach, aby zbadać interakcje chaperon-cochaperon. Za pomocą tej techniki badamy małe cząsteczki hamujące interakcje między Hsp90 a FKDP51 lub FKBP52 i identyfikujemy silne i selektywne inhibitory. Ta wysokowydajna technika przesiewowa jest solidna i niezawodna.

Rezultaty można uzyskać w ciągu jednej godziny, a wymaga to jedynie niewielkich ilości granulek, białka i związków. Interakcja Hsp90 z tymi kochaperonami była związana z zaburzeniami u ludzi, takimi jak choroba Alzheimera, rak, choroba autoimmunologiczna. Technika ta daje możliwość badań przesiewowych inhibitorów chaperon-kochaperon o dużym znaczeniu medycznym.

Oto podstawowa zasada tego testu. Kiedy interakcja między peptydem końcowym Hsp90C a domeną TPR kochaperonów zbliża do siebie kulki donorowe i akceptorowe, generowany jest wysoce wzmocniony sygnał. Po dodaniu inhibitorów oddziaływań kulki donorowe i akceptorowe nie mogą zbliżyć się do siebie i nie jest wytwarzany żaden wykrywalny sygnał.

Rozpocznij od rozcieńczenia peptydu Hsp90 w PBS w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Rozcieńczyć niesprzężone koraliki akceptorowe w PBS i przenieść kulki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować rozcieńczone kulki do mycia, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.

Do koniugacji ustaw koraliki akceptorowe w peptydach w stosunku 10 do 1. Do kulek paletydowych w rozcieńczonym peptydzie PBS, Tween 20 i roztworze cyjanowodorku sodu, i inkubować z mieszaniem od końca do końca na wytrząsarce obrotowej. Aby zablokować nieprzereagowane miejsca, dodaj 20 mikrolitrów jednego molowego roztworu chlorowodorku Tris o pH 8,0 do kulek i wygasz reakcję przez inkubację przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć kulki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze roztworu chlorowodorku Tris. Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić kulki w stężeniu jednego miligrama na mililitr w buforze do przechowywania i przechowywać sprzężony roztwór kulek akceptorowych w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Dodaj kulki donorowe glutationu w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS. Dodać GSTFKBP51 do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubować reakcję przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Wykonać seryjne rozcieńczenia badanego związku w DMSO.

Dodać 0,25 mikrolitra rozcieńczeń badanego związku i potroić w rogu każdego dołka płytki 384-dołkowej. W celu kontroli ujemnej dodaj 0,25 mikrolitra DMSO, a w celu kontroli pozytywnej dodaj 0,25 mikrolitra peptydu Hsp90 C-Terminal w studzienkach. Do każdej studzienki dodać 22,5 mikrolitra roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST.

Dokładnie potrząśnij płytką rękami i inkubuj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozcieńczyć kulki akceptora dołączonym peptydem Hsp90C-Terminal do stężenia 100 mikrogramów na mililitr w 0,5-krotności PBS. Dodaj 2,25 mikrolitra rozcieńczonych koralików akceptorowych do każdej studzienki.

Wstrząsnąć i inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut, jak pokazano. Włącz czytnik płytek, zmierz sygnał tabliczki i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Utwórz tabelę danych X-Y W oknie powitalnym wybierz liczbę X, Y i wprowadź trzy wartości replikacji w kolumnach obok siebie.

Zaimportuj wartości stężeń do kolumny X, a wartości sygnału do kolumny Y. Kliknij przycisk analizuj, wybierz pozycję Przekształć stężenie X, a następnie wybierz pozycję Przekształć w logarytmy. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Regresja nieliniowa w obszarze Analiza X-Y.

Otwórz opcję hamowania odpowiedzi na dawkę i wybierz równanie nachylenia logarytmu i zmiennej odpowiedzi. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki zawierające wartość IC50 i wykresy. Test ten został wykorzystany do badań przesiewowych małych cząsteczek, hamując interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52.

Wynik Z powyżej 0,8 i stosunek sygnału do tła wynoszący 13,35 świadczą o solidności i niezawodności badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Oceniono wpływ badanego związku D10 o małej masie cząsteczkowej na hamowanie oddziaływań chaperon-kochaperon i obliczono wartości IC50, gdzie D10 wykazywał hamowanie zależne od dawki. Wartość IC50 dla oddziaływań GSTFKBP51 Hsp90 wynosiła 65 nanomolowych.

Podczas gdy w przypadku interakcji Hsp90 GSTFKBP52 całkowite zahamowanie nie zostało osiągnięte przy najwyższym stężeniu związku, co wskazuje, że można osiągnąć selektywne hamowanie interakcji białko-białko z małymi cząsteczkami. Krytycznym krokiem jest kolejność dodawania. Najpierw tworzymy kompleks między małą cząsteczką a jej celem TPR.

W przeciwnym razie wymagana jest dłuższa inkubacja i wyższe stężenia związków. Możemy użyć tej techniki do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek zakłócających interakcję między Hsp90 i FKB51 lub Hsp90 i FKB52. Można go również rozszerzyć na dowolną interakcję między Hsp90, Hsp70 i motywem TPR zawierającym selektywne inhibitory przesiewowe kochaperonu.