Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek
July 21st, 2021
Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.
Zbudowaliśmy jednorodny test oparty na kulkach, aby zbadać interakcje chaperon-cochaperon. Za pomocą tej techniki badamy małe cząsteczki hamujące interakcje między Hsp90 a FKDP51 lub FKBP52 i identyfikujemy silne i selektywne inhibitory. Ta wysokowydajna technika przesiewowa jest solidna i niezawodna.
Rezultaty można uzyskać w ciągu jednej godziny, a wymaga to jedynie niewielkich ilości granulek, białka i związków. Interakcja Hsp90 z tymi kochaperonami była związana z zaburzeniami u ludzi, takimi jak choroba Alzheimera, rak, choroba autoimmunologiczna. Technika ta daje możliwość badań przesiewowych inhibitorów chaperon-kochaperon o dużym znaczeniu medycznym.
Oto podstawowa zasada tego testu. Kiedy interakcja między peptydem końcowym Hsp90C a domeną TPR kochaperonów zbliża do siebie kulki donorowe i akceptorowe, generowany jest wysoce wzmocniony sygnał. Po dodaniu inhibitorów oddziaływań kulki donorowe i akceptorowe nie mogą zbliżyć się do siebie i nie jest wytwarzany żaden wykrywalny sygnał.
Rozpocznij od rozcieńczenia peptydu Hsp90 w PBS w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Rozcieńczyć niesprzężone koraliki akceptorowe w PBS i przenieść kulki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować rozcieńczone kulki do mycia, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.
Do koniugacji ustaw koraliki akceptorowe w peptydach w stosunku 10 do 1. Do kulek paletydowych w rozcieńczonym peptydzie PBS, Tween 20 i roztworze cyjanowodorku sodu, i inkubować z mieszaniem od końca do końca na wytrząsarce obrotowej. Aby zablokować nieprzereagowane miejsca, dodaj 20 mikrolitrów jednego molowego roztworu chlorowodorku Tris o pH 8,0 do kulek i wygasz reakcję przez inkubację przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Pod koniec inkubacji przemyć kulki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze roztworu chlorowodorku Tris. Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić kulki w stężeniu jednego miligrama na mililitr w buforze do przechowywania i przechowywać sprzężony roztwór kulek akceptorowych w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.
Dodaj kulki donorowe glutationu w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS. Dodać GSTFKBP51 do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubować reakcję przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Wykonać seryjne rozcieńczenia badanego związku w DMSO.
Dodać 0,25 mikrolitra rozcieńczeń badanego związku i potroić w rogu każdego dołka płytki 384-dołkowej. W celu kontroli ujemnej dodaj 0,25 mikrolitra DMSO, a w celu kontroli pozytywnej dodaj 0,25 mikrolitra peptydu Hsp90 C-Terminal w studzienkach. Do każdej studzienki dodać 22,5 mikrolitra roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST.
Dokładnie potrząśnij płytką rękami i inkubuj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozcieńczyć kulki akceptora dołączonym peptydem Hsp90C-Terminal do stężenia 100 mikrogramów na mililitr w 0,5-krotności PBS. Dodaj 2,25 mikrolitra rozcieńczonych koralików akceptorowych do każdej studzienki.
Wstrząsnąć i inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut, jak pokazano. Włącz czytnik płytek, zmierz sygnał tabliczki i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Utwórz tabelę danych X-Y W oknie powitalnym wybierz liczbę X, Y i wprowadź trzy wartości replikacji w kolumnach obok siebie.
Zaimportuj wartości stężeń do kolumny X, a wartości sygnału do kolumny Y. Kliknij przycisk analizuj, wybierz pozycję Przekształć stężenie X, a następnie wybierz pozycję Przekształć w logarytmy. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Regresja nieliniowa w obszarze Analiza X-Y.
Otwórz opcję hamowania odpowiedzi na dawkę i wybierz równanie nachylenia logarytmu i zmiennej odpowiedzi. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki zawierające wartość IC50 i wykresy. Test ten został wykorzystany do badań przesiewowych małych cząsteczek, hamując interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52.
Wynik Z powyżej 0,8 i stosunek sygnału do tła wynoszący 13,35 świadczą o solidności i niezawodności badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Oceniono wpływ badanego związku D10 o małej masie cząsteczkowej na hamowanie oddziaływań chaperon-kochaperon i obliczono wartości IC50, gdzie D10 wykazywał hamowanie zależne od dawki. Wartość IC50 dla oddziaływań GSTFKBP51 Hsp90 wynosiła 65 nanomolowych.
Podczas gdy w przypadku interakcji Hsp90 GSTFKBP52 całkowite zahamowanie nie zostało osiągnięte przy najwyższym stężeniu związku, co wskazuje, że można osiągnąć selektywne hamowanie interakcji białko-białko z małymi cząsteczkami. Krytycznym krokiem jest kolejność dodawania. Najpierw tworzymy kompleks między małą cząsteczką a jej celem TPR.
W przeciwnym razie wymagana jest dłuższa inkubacja i wyższe stężenia związków. Możemy użyć tej techniki do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek zakłócających interakcję między Hsp90 i FKB51 lub Hsp90 i FKB52. Można go również rozszerzyć na dowolną interakcję między Hsp90, Hsp70 i motywem TPR zawierającym selektywne inhibitory przesiewowe kochaperonu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje jednorodny test oparty na koralikach do badania interakcji szafonowo-kochaferonowych, szczególnie między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52. Technika ta umożliwia wysokowydajne przesiewowe badanie małych cząsteczek w celu zidentyfikowania silnych inhibitorów tych interakcji, które mają znaczenie dla różnych chorób u ludzi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Farmakologia
Tło
- Hsp90 to białko szafonowe zaangażowane w fałdowanie innych białek.
- FKBP51 i FKBP52 to kochaferony, które wchodzą w interakcje z Hsp90.
- Zburzenie tych interakcji może mieć implikacje terapeutyczne.
- Interakcje te są zaangażowane w choroby takie jak Alzheimera, rak i choroby autoimmunologiczne.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego testu do przesiewowego badania inhibitorów interakcji Hsp90-kochaferonów.
- Identyfikacja małych cząsteczek, które selektywnie zakłócają interakcje Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52.
- Zapewnienie metody wysokowydajnego przesiewu przy minimalnych wymaganiach próbek.
Zastosowane metody
- Jednorodny test oparty na koralikach z wykorzystaniem kulek donorowych połączonych z glutationem.
- Kochaferony z motywem TPR związane z GST i kulki akceptorowe z peptydami pochodzącymi od Hsp90.
- Wysokowydajne przesiewowe badanie małych cząsteczek.
- Szybkie wyniki osiągalne w ciągu jednej godziny.
Główne wyniki
- Identyfikacja silnych i selektywnych inhibitorów interakcji Hsp90-FKBP51.
- Wykazanie solidności i niezawodności testu.
- Potencjał do przesiewowego badania związków o dużym znaczeniu medycznym.
- Wyniki wspierają dalsze badania nad zastosowaniami terapeutycznymi.
Konkluzje
- Opracowany test jest skuteczny w badaniu interakcji szafonowo-kochaferonowych.
- Umożliwia identyfikację inhibitorów małych cząsteczek o potencjalnym znaczeniu klinicznym.
- Ta technika może postępować w badaniach nad lekami na choroby związane z interakcjami Hsp90.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Targeting Hsp90-cochaperone interactions enables selective modulation of disease-relevant signaling pathways, offering a precision strategy for therapeutic intervention in oncology, neurodegeneration, and autoimmune disorders. The homogeneous bead-based assay provides a robust, scalable platform for early-stage target validation and lead identification by quantifying protein-protein disruption in a homogeneous environment. This supports mechanistic de-risking and predictive confidence in prioritizing chemical series with selective Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 inhibitory profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Hsp90-FKBP51 and Hsp90-FKBP52 binary interactions to validate target engagement and pathway specificity.
- Operational Value: Requires minimal protein and compound input, supporting early-stage screening with limited material availability.
- Predictive Value: Identifies selective inhibitors (e.g., D10 with 65 nM IC50 for FKBP51) to de-risk off-target effects and improve target hypothesis confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, homogeneous readouts (Z’ > 0.8, S/B = 13.35) suitable for high-throughput screening campaigns.
- Operational Value: Results obtained within one hour, enabling rapid iteration and timely go/no-go decisions in hit-to-lead progression.
- Reproducibility Value: Standardized bead conjugation and blocking steps ensure assay consistency across runs and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports screening for compounds that disrupt Hsp90-cochaperone interactions implicated in Alzheimer’s disease, cancer, and autoimmune disorders.
- Predictive Value: Enables early assessment of target selectivity, aiding in the selection of candidates with favorable mechanistic profiles for preclinical advancement.
- Continuity Value: Assay outputs (IC50, dose response) translate directly into downstream efficacy and safety evaluation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through biochemical confirmation of Hsp90-cochaperone disruption, and enabling lead identification via high-throughput screening of small molecule libraries.
- Discovery Biology: Validates target engagement by measuring disruption of Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions, clarifying mechanism of action.
- Screening: Provides assay readiness with robust Z’ score and signal-to-background ratio, ensuring reliable compound evaluation in 384-well format.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values through nonlinear regression, enabling quantitative comparison of inhibitor potency and selectivity.
- Translational Research: Connects to disease-relevant systems by screening inhibitors of interactions linked to human disorders, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Platform can be extended to other Hsp70/Hsp90-TPR cochaperone interactions, increasing ROI across multiple target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective inhibition of Hsp90-FKBP51 over Hsp90-FKBP52, reducing ambiguity in target modulation.
- Operational Value: Low sample consumption (beads, protein, compounds) and fast time-to-result (<1 hour) increase screening efficiency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions based on target selectivity, improving capital efficiency and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of chemical series with validated target engagement and selectivity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification (GST-tagged TPR domains) and bead-based assay conjugation chemistry.
- Dependent on access to plate reader capable of luminescence detection and compatible with 384-well formats.
- Necessitates standardization of peptide-bead conjugation ratios (10:1) and blocking conditions (1 M Tris, pH 8.0) for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to alternative cochaperones requires re-validation of bead conjugation and interaction kinetics.
- Practical limitation: assay sensitivity may be affected by compound auto-fluorescence or luminescence quenching, requiring orthogonal counterscreening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
