Name: Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj jednorodny test na bazie kulek do badania interakcji chaperon-cochaperone między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52. Ta technika umożliwia szybkie przesiewanie inhibitorów o znaczeniu klinicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty ze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (2018-02843), Fundacji Mózgu (Fo 2019-0140), Fundacji Chorób Geriatrycznych w Karolinska Institutet, Fundacji Gunvora i Josefa Anérsów, Fundacji Magnusa Bergvalsa, Fundacji Gun i Bertila Stohnesów, Fundacji Tore Nilssonów na badania medyczne, Fundacji Margarethy af Ugglas oraz Fundacji dla Starych Sług.

UWAGA: Przegląd tego protokołu przedstawiono na Rycini 2.
1. Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 oraz GST-FKBP52 (Rysunek 2A)
<ol>
	<li>Plazmidy 
	UWAGA: Pozyskać klony cDNA dla ludzkiego FKBP51 (id klonu: 5723416) oraz dla ludzkiego FKBP52 (id klonu: 7474554) z konsorcjum IMAGE.
	<ol>
		<li>Namnożyć DNA ludzkiego FKBP51 metodą PCR przy użyciu starterów (forward; 5`GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3`, reverse; 5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`) zawierających nadmiarowe sekwencje BamHI i XhoI, a następnie sklonować do wektora pGEX6-1 w miejscach restrykcyjnych BamHI / XhoI.</li>
		<li>Namnożyć DNA ludzkiego FKBP52 metodą PCR przy użyciu starterów (forward; 5`-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3`, reverse; 5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`) zawierających nadmiarowe sekwencje EcoRI i XhoI, a następnie sklonować do wektora pGEX6-2 w miejscach restrykcyjnych EcoRI / XhoI. 
		UWAGA: Skład reakcji PCR i warunki są przedstawione w Tabeli 1 i Tabeli 2.</li>
		<li>Zweryfikować wstawioną sekwencję i przetransformować plazmidy do chemicznie kompetentnych szczepów E. coli zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie białek
	<ol>
		<li>Dodać 25 g bazy pożywki Luria (LB) do 1 L wody destylowanej, aby przygotować roztwór LB. Autoklawować w temperaturze 121 °C przez 15 min. Po ochłodzeniu dodać ampicylinę w stężeniu 50 µg/mL.</li>
		<li>Pobrać kolonię bakterii eksponujących GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 i zmieszać z 500 µL roztworu LB w probówce 1,5 mL. Wymieszać w wirówce typu vortex.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę z punktu „1.2.2” do 1 L roztworu LB w kolbie Erlenmeyera przykrytej folią aluminiową. Inkubować kolbę Erlenmeyera w inkubatorze wytrząsowym przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Indukować ekspresję białka poprzez dodanie 1 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktozydy (IPTG) do kolby Erlenmeyera i kontynuować inkubację przez kolejne 2 h.</li>
		<li>Aby uzyskać osad komórkowy, wirować z prędkością 5 000 x g przez 15 min. Usunąć nadsącz. 
		UWAGA: Osady komórkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Resuspendować osady komórkowe w 40 mL PBS i sonikować 3 x 20 s na lodzie. Dodać 1 mM PMSF, 1 mM EDTA oraz koktajl inhibitorów proteaz (1 tabletka), aby zapobiec proteolizie.</li>
		<li>Wirować zawiesinę przez 30 min z prędkością 50 000 x g w celu usunięcia szczątków komórkowych i nałożyć nadsącz na kolumnę GST-trap 5 mL.</li>
		<li>Po przemyciu kolumny 30 mL PBS, eluować GST-FKBP51 i GST-FKBP52 za pomocą 5 mL 10 mM glutationu w PBS.</li>
		<li>Skoncentrować białka na jednostce wirowania 15 mL 10 000 MWCO. Aby usunąć wolny glutation, przepuścić koncentraty przez kolumnę PD-10 równoważoną 0,5x PBS, a następnie ponownie skoncentrować za pomocą wirówki z filtrem.</li>
		<li>Zebrać frakcje zawierające białko. Zweryfikować białka za pomocą SDS-PAGE i dostosować stężenia białek do 1 mg/mL. 
		UWAGA: Typowa wydajność białka wynosi 2-5 mg/L hodowli. Białko można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sprzęganie peptydu C-końcowego Hsp90 z koralikami akceptorowymi (Rysunek 2B)
<ol>
	<li>Przygotowanie peptydu Hsp90
	<ol>
		<li>Zlecić w serwisie syntezy peptydów syntezę dziesięciu aminokwasowego peptydu NH2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadającego aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90 (UniProt ID: P08238).</li>
		<li>Rozcieńczyć peptyd Hsp90 w PBS do stężenia 1 mg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek akceptorowych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć nie sprzężone kulki akceptorowe w PBS do stężenia 1 mg/mL i przenieść do probówki 1,5 mL.</li>
		<li>Przeprowadzić przemywanie poprzez wirowanie przy 16 000 x g przez 15 min. Ostrożnie usunąć nadsącz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzęganie
	<ol>
		<li>Ustalić stosunek kulek do peptydu na 10:1. Do probówki 1,5 mL zawierającej 1 mg osadu kulek akceptorowych (przygotowanych zgodnie z opisem powyżej) dodać 1 mL PBS (pH 7,4), 0,1 mg rozcieńczonego peptydu, 1,25 µL Tween-20 oraz 10 µL 400 mM roztworu cyjanoborowodoru sodu (NaBH3CN) w wodzie. 
		UWAGA: NaBH3CN jest toksyczny; należy pracować pod wyciągiem i w rękawiczkach. Roztwór NaBH3CN powinien być świeżo przygotowany.</li>
		<li>Inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C z mieszaniem typu end-over-end (10-20 obr./min) na wytrząsarce rotacyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymanie reakcji i przemywanie kulek
	<ol>
		<li>Do reakcji dodać 20 µL 1 M roztworu Tris-HCl (pH 8,0) w celu zablokowania nieprzereagowanych miejsc. Inkubować przez 1 h w 37 °C.</li>
		<li>Wirować przy 16 000 x g (lub z maksymalną prędkością) przez 15 min w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz i resuspender osad kulek w 1 mL roztworu Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).</li>
		<li>Powtórzyć etap przemywania trzy razy.</li>
		<li>Po ostatnim wirowaniu resuspender kulki do stężenia 1 mg/mL w buforze do przechowywania (1 mL 0,5 × PBS z 0,01% azotkiem sodu jako konserwantem). Przechowywać roztwór sprzężonych kulek akceptorowych w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. 
		​UWAGA: Azotek sodu jest toksyczny; należy pracować pod wyciągiem i w rękawiczkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza oddziaływania pomiędzy GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a peptydem C-końcowym Hsp90 oraz hamowanie za pomocą związków o małej masie cząsteczkowej (Rysunek 2C)
<ol>
	<li>Białka z tagiem GST oddziałujące z kulkami donorowymi z glutationem
	<ol>
		<li>Przygotować reakcje na płytkach 384-dołkowych.</li>
		<li>Przygotować roztwór zawierający 10 µg/mL kulek donorowych z glutationem w 0,5x PBS, pH 7,4. 
		UWAGA: Po długim przechowywaniu kulki osiadają i wymagają wymieszania w wortexie.</li>
		<li>Dodać GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 do stężenia końcowego 10 µg/mL.</li>
		<li>Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Na tym etapie białka z tagiem GST będą oddziaływać z glutationem przyłączonym do kulek. Do każdego dołka zostanie użyte 22,5 µL tej mieszaniny. Stężenie partnerów wiążących należy określić empirycznie. Należy miareczkować GST-FKBP51 oraz GST-FKBP52 i wybrać stężenie, które daje najlepszy sygnał.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie związków
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczenia seryjne badanych związków w DMSO. 
		UWAGA: Stosowane stężenia to zazwyczaj 10, 30, 100, 300, 1 000 i 3 000 µM.</li>
		<li>Dodać 0,25 µL DMSO (kontrola negatywna), peptyd C-końcowy Hsp90 (kontrola pozytywna, 30 µM) lub związki w DMSO do narożnika każdego dołka płytki. Dla każdego stężenia związku zastosować powtórzenia trzykrotne.</li>
		<li>Dodać 22,5 µL roztworu zawierającego kulki donorowe z glutationem wraz z białkami z tagiem GST do każdego dołka.</li>
		<li>Delikatnie, lecz dokładnie potrząsnąć płytką ręcznie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min. 
		UWAGA: W tym czasie związki będą oddziaływać z domeną TPR w miejscu wiązania peptydu C-końcowego Hsp90.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie kulek akceptorowych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kulki akceptorowe z przyłączonym peptydem C-końcowym Hsp90 do stężenia 100 µg/mL w 0,5x PBS.</li>
		<li>Dodać 2,25 µL rozcieńczonych kulek akceptorowych do każdego dołka.</li>
		<li>Wymieszać delikatnie, lecz dokładnie. Inkubować w ciemności w temperaturze 25 °C przez 15 min. 
		UWAGA: Na tym etapie kulki donorowe i akceptorowe zostają zbliżone do siebie dzięki oddziaływaniom białko-peptyd. Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 µL. W związku z tym końcowe stężenia związków mieszczą się w zakresie od 0,1 do 30 µM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczyt płytki 
	UWAGA: Odczytać płytkę za pomocą czytnika płytek ustawionego w odpowiednim trybie.
	<ol>
		<li>Włączyć urządzenie i uruchomić oprogramowanie.</li>
		<li>Wybrać odpowiedni protokół.</li>
		<li>Kliknąć Edit plate map i zaznaczyć dołki na płytce wykorzystywane do pomiaru.</li>
		<li>Kliknąć Next, aby kontynuować, a następnie Run, aby uruchomić wybrany protokół.</li>
		<li>Po pomiarze kliknąć Show Results, aby wyświetlić wyniki.</li>
		<li>Wyeksportować dane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Współczynnik Z' i stosunek sygnału do tła (S/B)
	<ol>
		<li>Oblicz współczynnik Z' oraz stosunek S/B dla testu, korzystając z następujących równań: 
		Z'=1-(3σpos+3σneg)/│µpos-µneg│16 
		S/B=µneg/µpos 
		gdzie σ i µ reprezentują odpowiednio odchylenia standardowe i średnie dla kontroli pozytywnej (peptyd C-końcowy Hsp90, 30 µM) i negatywnej (DMSO). Współczynnik Z' &gt; 0,5 gwarantuje, że test jest wystarczająco odporny do przeprowadzenia screeningu. W celu monitorowania czułości testu obliczono również stosunek S/B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa dawka-odpowiedź i IC 50 
	UWAGA: Do dopasowania danych dla inhibitorów PPI Hsp90-kokoaperonów należy wykorzystać analizę regresji nieliniowej za pomocą oprogramowania.
	<ol>
		<li>Utwórz tabelę danych XY w oknie dialogowym Welcome i wybierz X Numbers oraz Y Enter 3 (w przypadku pomiarów w trzech powtórzeniach) replicate values in side-by-side columns.</li>
		<li>Znormalizuj dane sygnału próbek względem grupy kontrolnej negatywnej. Zaimportuj wartości stężeń do kolumny X i wartości sygnału do kolumny Y.</li>
		<li>Kliknij Analyze i wybierz Transform concentration (X) w sekcji Transform | Normalize. Wybierz Transform to Logarithms. 
		UWAGA: Spowoduje to przekształcenie stężenia w skalę logarytmiczną. Jeśli stężenie początkowe wynosi zero, ustaw je na bardzo małą liczbę, która w praktyce jest zerem (np. 0,1 nM), aby nie utracić tych wartości, ponieważ logarytm z zera nie jest zdefiniowany.</li>
		<li>Kliknij Analyze i wybierz Nonlinear regression (curve fit) w sekcji XY analyses, otwórz Dose-Response-Inhibition i wybierz Log(inhibitor) vs. response -- Variable slope.</li>
		<li>Kliknij OK , aby wyświetlić Results (zawierające wartość IC50) oraz Graphs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces ekspresji i oczyszczania GST-FKBP oraz sprzęgania Hsp90; schemat interakcji w teście z użyciem kulek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat protokołu. (A) Ekspresja i oczyszczanie GST-FKBP51 oraz GST-FKBP52. (B) Sprzęganie peptydu C-końcowego Hsp90 z kuleczkami akceptorowymi. (C) Test badający interakcję między GST-FKBP51 lub GST-FKBP52 a peptydem C-końcowym Hsp90. Inhibicja za pomocą związków o małej masie cząsteczkowej. Utworzono za pomocą BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Muchowski, P. J., Wacker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurodegeneration+by+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones.</a> Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).</li>
<li>Eckl, J. M., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+the+Hsp90+chaperone+system%3A+lifting+client+proteins+to+new+heights%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights.</a> International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).</li>
<li>Yuno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+and+biomarker+profiling+of+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors.</a> Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+protein-protein+interactions+of+Hsp90+as+a+novel+approach+for+targeting+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).</li>
<li>Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+GMP-1+a+molecular+chaperone+network+modulator+protecting+mitochondrial+function+and+its+assessment+in+fly+and+mice+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).</li>
<li>Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding+of+tetratricopeptide+repeat+proteins+to+the+C-terminal+12-kDa+domain+of+hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).</li>
<li>Scheufler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+TPR+domain-peptide+complexes%3A+critical+elements+in+the+assembly+of+the+Hsp70-Hsp90+multichaperone+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine.</a> Cell. 101 (2), 199-210 (2000).</li>
<li>Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP51+and+FKBP52+in+signaling+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).</li>
<li>Ullman, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+oxygen+channeling+immunoassay%3A+measurement+of+particle+binding+kinetics+by+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).</li>
<li>Wigle, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+inhibitors+of+low-affinity+epigenetic+peptide-protein+interactions%3A+an+AlphaScreen-based+assay+for+antagonists+of+methyl-lysine+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins.</a> Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).</li>
<li>Guenat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+and+nonradioactive+high-throughput+screening+platform+for+the+characterization+of+kinase+inhibitors+in+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates.</a> Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).</li>
<li>Sabatucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+methodological+approach+for+in+vitro+determination+of+the+role+of+DNA+methylation+on+transcription+factor+binding+using+AlphaScreen%28R%29+analysis%3A+Focus+on+CREB1+binding+at+hBDNF+promoter+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV.</a> Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720(2020).</li>
<li>Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+Optimization+and+Screening+of+RNA-Protein+Interactions+by+AlphaScreen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen.</a> Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competitive+alphascreen+assay+for+detection+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan.</a> Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).</li>
<li>Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf">https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf</a> (2021).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący test do badań przesiewowych małych cząsteczek hamujących interakcje między Hsp90 a ko-opiekunami z motywem TPR, zwłaszcza FKBP51 i FKBP52. Wysoki wynik Z' (>0,8) świadczy o solidności i niezawodności formatu o wysokiej przepustowości. Wyniki można uzyskać w ciągu jednej godziny i wymagane są niewielkie ilości kulek, białka i związków. Co więcej, protokół ten można łatwo rozszerzyć na dowolne interakcje Hsp90/Hsp70 - TPR-motif co-chaperone, które są przedmiotem zainteresowan...

Chaperony molekularne przyczyniają się do homeostazy białek, w tym do ich fałdowania, transportu i degradacji. Regulują one szereg procesów komórkowych i są powiązane z wieloma schorzeniami, takimi jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne1. Białko szoku cieplnego 90 (Hsp90) jest jednym z najważniejszych chaperonów, którego funkcja zależy od zmian konformacyjnych napędzanych przez hydrolizę ATP oraz wiązania białek klientów za pośrednictwem ko-chaperonów2. Pomimo oczywistego potencjału Hsp90 jako celu terapeutycznego, precyzyjne dostrojenie jego funkcji stanowi duże wyzwanie. Istnieje kilka inhibitorów Hsp90 celujących w N-końcowy region wiązania ATP, które zostały ocenione w badaniach klinicznych, jednak żaden z nich nie został zatwierdzony do wprowadzenia do obrotu3. Ze względu na brak dobrze zdefiniowanej kieszeni wiążącej ligand4, celowanie w region C-końcowy Hsp90 odniosło ograniczony sukces4. Ostatnio jako alternatywną strategię badano zaburzanie oddziaływań Hsp90 z ko-chaperonami za pomocą małych cząsteczek5. Celowanie w oddziaływania Hsp90 z ko-chaperonami nie wywołuje ogólnej odpowiedzi komórkowej na stres i stwarza możliwość specyficznej regulacji różnych procesów wewnątrzkomórkowych. Zachowany pentapeptyd MEEVD na C-końcu Hsp90 odpowiada za oddziaływanie z motywem powtórzeń tetratrykopeptydowych (TPR) ko-chaperonów6. Spośród 736 białek zawierających motyw TPR zidentyfikowanych w ludzkiej bazie danych białek, około 20 różnych białek oddziałuje z Hsp90 za pośrednictwem tego peptydu7. Cząsteczki konkurujące o wiązanie z peptydem MEEVD zakłócałyby oddziaływania między Hsp90 a ko-chaperonami zawierającymi domenę TPR. Miejsce wiązania peptydu ma podobną strukturę trzeciorzędową, ale ogólna homologia między różnymi domenami motywu TPR jest stosunkowo niska7, co stwarza okazję do zidentyfikowania cząsteczek zdolnych do specyficznego blokowania oddziaływań między Hsp90 a konkretnymi ko-chaperonami z motywem TPR. Wśród tych ko-chaperonów z motywem TPR, białko wiążące FK506 (FKBP) 51 oraz FKBP52 są regulatorami sygnalizacji receptorów hormonów steroidowych (SHR) i uczestniczą w kilku chorobach zależnych od hormonów steroidowych, w tym w nowotworach, chorobach związanych ze stresem, chorobach metabolicznych i chorobie Alzheimera8. Chociaż FKBP51 i FKBP52 wykazują &gt; 80% podobieństwa sekwencji, ich funkcje różnią się: FKBP52 jest pozytywnym regulatorem aktywności SHR, podczas gdy FKBP51 w większości przypadków jest regulatorem negatywnym8. Zatem identyfikacja cząsteczek specyficznie blokujących oddziaływania między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52 stwarza obiecujący potencjał terapeutyczny w leczeniu związanych z nimi schorzeń.
Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) został opracowany po raz pierwszy w 1994 roku przez Ullmana EF i współpracowników9. Obecnie jest on powszechnie stosowany do wykrywania różnych rodzajów oddziaływań biologicznych, takich jak oddziaływania peptydów10, białek11, DNA12, RNA13 oraz cukrów14. W technice tej wykorzystuje się dwa rodzaje kulek (o średnicy 200 nm): kulki donora oraz kulki akceptora. Biomolekuły są unieruchamiane na tych kulkach, a ich oddziaływania biologiczne doprowadzają kulkę donora i akceptora do bliskiego sąsiedztwa. Przy długości fali 680 nm fotosensybilizator w kulce donora zostaje wzbudzony i przekształca tlen w tlen singletowy. Ze względu na krótki czas życia, tlen singletowy może dyfundować na odległość maksymalnie 200 nm. Jeśli kulka akceptora znajduje się w bliskim sąsiedztwie, jej pochodna tioksenu reaguje z tlenem singletowym, generując chemiluminescencję przy 370 nm. Energia ta następnie aktywuje fluorofory w tej samej kulce akceptora, powodując emisję światła w zakresie 520-620 nm15. Jeśli oddziaływania biologiczne zostaną przerwane, kulka akceptora i kulka donora nie mogą zbliżyć się do siebie, co prowadzi do zaniku tlenu singletowego i uzyskania niskiego sygnału.
W niniejszym pracy opisujemy protokół z wykorzystaniem tej techniki do przesiewania małych cząsteczek hamujących oddziaływania między Hsp90 a kokaperonami TPR, w szczególności FKBP51 i FKBP52. Peptydy o długości 10 aminokwasów, odpowiadające ekstremalnemu C-końcowi Hsp90, są przyłączone do kulek akceptorowych. Oczyszczone kokaperony TPR z etykietą GST oddziałują z kuleczkami donorowymi sprzężonymi z glutationem. Gdy oddziaływanie między peptydami pochodzącymi z Hsp90 a kokaperonami z motywem TPR doprowadzi do zbliżenia kulek, generowany jest sygnał wzmocniony (Rysunek 1A). Jeśli przesiewane małe cząsteczki mogą hamować oddziaływania między Hsp90 a kokaperonami z motywem TPR, sygnał wzmocniony ulegnie zmniejszeniu (Rysunek 1B). Ich IC50 można obliczyć za pomocą pomiaru ilościowego. Protokół ten można rozszerzyć na dowolne interesujące oddziaływania między chaperonem a kokaperonem z motywem TPR i ma on duże znaczenie w opracowywaniu nowych cząsteczek, specyficznie blokujących oddziaływanie między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52.
<img alt="Schemat generowania tlenu singletowego, pokazujący wzbudzenie przy 680 nm i emisję przy 520-620 nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62762/62762fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Podstawowa zasada tego testu. (A) Oczyszczone białko GST-FKBP51 oddziałuje z koralikami donora sprzężonymi z glutationem. Peptydy o długości 10 aminokwasów, odpowiadające skrajnemu C-końcowi Hsp90, są przyłączone do koralików akceptora. Oddziaływanie między peptydami pochodzącymi z Hsp90 a domeną TPR białka FKBP51 zbliża koraliki donora i akceptora do siebie. Przy 680 nm fotosensybilizator w koraliku donora zostaje wzbudzony i przekształca tlen w tlen singletowy. Pochodna tioksenu na koraliku akceptora reaguje z tlenem singletowym, generując chemiluminescencję przy 370 nm. Energia ta następnie aktywuje fluorofory w tym samym koraliku akceptora, powodując emisję światła przy 520-620 nm. (B) Gdy małe cząsteczki hamują oddziaływania między Hsp90 a FKBP51, koraliki donora i akceptora nie mogą zbliżyć się do siebie. Wówczas tlen singletowy o krótkim czasie życia ulega rozpadowi i nie powstaje wykrywalny sygnał. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62762/62762fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Płytki 384-dołkowe</td><td>Perkin Elmer</td><td>6008350</td><td>Objętość testu 25 ml</td></tr><tr><td>Jednostka wirująca Amicon 10.000 MWCO</td><td>Koncentrat białka Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Wytrząsarka bakteryjna Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td></td><td>Culture</td></tr><tr><td>bakterie klony cDNA dla człowieka FKBP51</td><td>Źródło: BioScience</td><td>identyfikator klonu: 5723416</td><td>wektor pCMV-SPORT6</td></tr><tr><td>klony cDNA dla człowieka FKBP52</td><td>Źródło BioScience</td><td>identyfikator klonu: 7474554</td><td>wektor pCMV-SPORT6</td></tr><tr><td>Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C602003</td><td>One Shot BL21 Star (DE3)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>GraphPad Prism</td><td>9.0.0</td><td>Analiza danych i tworzenie liczb</td></tr><tr><td></td><td>Excel</td><td></td><td>Dane analityczne</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Supelco</td><td>1.02952.1000</td><td>Rozcieńczone związki</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Przygotuj roztwór</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Calbiochem</td><td>344504</td><td>Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji</td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma</td><td>G-4251</td><td>Elute Białka znakowane GST</td></tr><tr><td>Koraliki donorowe glutationu</td><td>Perkin Elmer</td><td>6765300</td><td>Koralik dawcy</td></tr><tr><td>Kolumna pułapki GST</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>17528201</td><td>Oczyszczanie białek oznaczonych GST</td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktozyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>Indukuj ekspresję białka</td></tr><tr><td>LB Broth (Miller)</td> <td>Sigma</td><td>L3522</td><td>Pożywka do wzrostu drobnoustrojów</td></tr><tr><td>Instrument do PCR</td><td>BIO-RAD</td><td>S1000 Kolumna Thermal Cycler</td><td>Amplifikacja/PCR</td></tr><tr><td>PD-10</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>17085101</td><td>Wektor wymiany roztworów</td></tr><tr><td>pGEX-6P-1</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>28954648</td><td>Wektor plazmidowy</td></tr><tr><td>pGEX-6P-2</td><td>Cytiva (GE Healthcare)</td><td>28954650</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid Czytnik płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>EnSpire 2300 Odczyt</td><td>tabliczki alfa</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do odczytu płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>EnSpire Manager</td><td>Oprogramowanie do odczytu płytek</td></tr><tr><td>Protokół oprogramowania czytnika płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>Alpha 384-well Niska głośność</td><td>Użyj tego protokołu, aby odczytać płytę</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji</td></tr><tr><td>koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td>Zapobiegaj proteolizie podczas sonikacji</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Jako środek konserwujący</td></tr><tr><td>Sicyjanoborowodorek sodu (NaBH3CN)</td><td>Sigma</td><td>156159</td><td>Aktywuje matrycę do sprzężenia</td></tr><tr><td>Dziesięć peptydów aminokwasowych NH2-EDASRMEEVD-COOH odpowiadających aminokwasom 714-724 ludzkiej izoformy beta Hsp90</td><td>peptyd 2.0 inc</td><td></td><td>Syntetyzuj peptyd C-końcowy Hsp90</td></tr><tr><td>Rotator probówki</td><td>LABINCO</td><td></td><td>Wykonaj mieszanie end-over-end</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td>Zablokuj nieprzereagowane miejsca koralików akceptorowych</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>Zapobiegaj agregacji koralików</td></tr><tr><td>Ultra wirówka Avanti J-20 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Wirówka do uzyskiwania granulek komórek bakteryjnych</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy zaburzacz komórek</td><td>Microson</td><td></td><td>Sonicate komórki w celu uwolnienia białka</td></tr><tr><td>Niesprzężone koraliki akceptorowe</td><td>Perkin Elmer</td><td>6762003</td><td>Akceptor koraliki</td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell i moduł XCell II Blot</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay

Ukierunkowanie na interakcje białko szoku cieplnego 90 (Hsp90)-cochaperon daje możliwość specyficznego regulowania procesów wewnątrzkomórkowych zależnych od Hsp90. Konserwatywny pentapeptyd MEEVD na C-końcu Hsp90 jest odpowiedzialny za interakcję z motywem powtórzeń tetratrikopeptydu (TPR) ko-chaperonów. Białko wiążące FK506 (FKBP) 51 i FKBP52 to dwa podobne ko-białka opiekuńcze z motywem TPR, zaangażowane w choroby hormonozależne steroidowe o różnych funkcjach. W związku z tym identyfikacja cząsteczek specyficznie blokujących interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52 zapewnia obiecujący potencjał terapeutyczny w przypadku kilku chorób u ludzi. W tym miejscu opisujemy protokół amplifikowanego luminescencyjnego testu jednorodnego zbliżeniowego w celu zbadania interakcji między Hsp90 a jego partnerskimi współopiekunami FKBP51 i FKBP52. Po pierwsze, oczyściliśmy białka zawierające motyw TPR FKBP51 i FKBP52 w postaci znakowanej S-transferazą glutationową (GST). Używając kulek donorowych połączonych glutationem z białkami motywu TPR połączonymi z GST oraz kulek akceptorowych sprzężonych z 10-merowym peptydem C-końcowym Hsp90, zbadaliśmy interakcje białko-białko w jednorodnym środowisku. Wykorzystaliśmy ten test do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

W naszym teście współczynnik Z' oraz stosunek S/B wynoszą odpowiednio 0,82 i 13,35 (Rycina 3A), co dowodzi, że opracowany test jest odporny i wiarygodny w badaniach wysokoprzepustowych. Następnie wykorzystaliśmy go do przesiewania związków o małej masie cząsteczkowej. Rycina 3B przedstawia zależne od dawki hamowanie oddziaływań chaperon-kouchaperon przez wybrany mały związek (D10). Krzywe zależności odpowiedzi od dawki dla D10 zostały wygenerowane za pomocą niel...

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Targeting the heat shock protein 90 (Hsp90)-cochaperone interactions provides the possibility to specifically regulate Hsp90-dependent intracellular ...

Zbudowaliśmy jednorodny test oparty na kulkach, aby zbadać interakcje chaperon-cochaperon. Za pomocą tej techniki badamy małe cząsteczki hamujące interakcje między Hsp90 a FKDP51 lub FKBP52 i identyfikujemy silne i selektywne inhibitory. Ta wysokowydajna technika przesiewowa jest solidna i niezawodna.Rezultaty można uzyskać w ciągu jednej godziny, a wymaga to jedynie niewielkich ilości granulek, białka i związków. Interakcja Hsp90 z tymi kochaperonami była związana z zaburzeniami u ludzi, takimi jak choroba Alzheimera, rak, choroba autoimmunologiczna. Technika ta daje możliwość badań przesiewowych inhibitorów chaperon-kochaperon o dużym znaczeniu medycznym.Oto podstawowa zasada tego testu. Kiedy interakcja między peptydem końcowym Hsp90C a domeną TPR kochaperonów zbliża do siebie kulki donorowe i akceptorowe, generowany jest wysoce wzmocniony sygnał. Po dodaniu inhibitorów oddziaływań kulki donorowe i akceptorowe nie mogą zbliżyć się do siebie i nie jest wytwarzany żaden wykrywalny sygnał.Rozpocznij od rozcieńczenia peptydu Hsp90 w PBS w stężeniu jednego miligrama na mililitr. Rozcieńczyć niesprzężone koraliki akceptorowe w PBS i przenieść kulki do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować rozcieńczone kulki do mycia, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.Do koniugacji ustaw koraliki akceptorowe w peptydach w stosunku 10 do 1. Do kulek paletydowych w rozcieńczonym peptydzie PBS, Tween 20 i roztworze cyjanowodorku sodu, i inkubować z mieszaniem od końca do końca na wytrząsarce obrotowej. Aby zablokować nieprzereagowane miejsca, dodaj 20 mikrolitrów jednego molowego roztworu chlorowodorku Tris o pH 8,0 do kulek i wygasz reakcję przez inkubację przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przemyć kulki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze roztworu chlorowodorku Tris. Powtórz pranie jeszcze dwa razy. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić kulki w stężeniu jednego miligrama na mililitr w buforze do przechowywania i przechowywać sprzężony roztwór kulek akceptorowych w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.Dodaj kulki donorowe glutationu w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr w PBS. Dodać GSTFKBP51 do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr i inkubować reakcję przez 10 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Wykonać seryjne rozcieńczenia badanego związku w DMSO.Dodać 0,25 mikrolitra rozcieńczeń badanego związku i potroić w rogu każdego dołka płytki 384-dołkowej. W celu kontroli ujemnej dodaj 0,25 mikrolitra DMSO, a w celu kontroli pozytywnej dodaj 0,25 mikrolitra peptydu Hsp90 C-Terminal w studzienkach. Do każdej studzienki dodać 22,5 mikrolitra roztworu zawierającego kulki donorowe glutationu z białkami oznaczonymi GST.Dokładnie potrząśnij płytką rękami i inkubuj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rozcieńczyć kulki akceptora dołączonym peptydem Hsp90C-Terminal do stężenia 100 mikrogramów na mililitr w 0,5-krotności PBS. Dodaj 2,25 mikrolitra rozcieńczonych koralików akceptorowych do każdej studzienki.Wstrząsnąć i inkubować płytkę w ciemności przez 15 minut, jak pokazano. Włącz czytnik płytek, zmierz sygnał tabliczki i przeanalizuj dane zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Utwórz tabelę danych X-Y W oknie powitalnym wybierz liczbę X, Y i wprowadź trzy wartości replikacji w kolumnach obok siebie.Zaimportuj wartości stężeń do kolumny X, a wartości sygnału do kolumny Y. Kliknij przycisk analizuj, wybierz pozycję Przekształć stężenie X, a następnie wybierz pozycję Przekształć w logarytmy. Kliknij przycisk Analizuj i wybierz opcję Regresja nieliniowa w obszarze Analiza X-Y.Otwórz opcję hamowania odpowiedzi na dawkę i wybierz równanie nachylenia logarytmu i zmiennej odpowiedzi. Kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki zawierające wartość IC50 i wykresy. Test ten został wykorzystany do badań przesiewowych małych cząsteczek, hamując interakcje między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52.Wynik Z powyżej 0,8 i stosunek sygnału do tła wynoszący 13,35 świadczą o solidności i niezawodności badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Oceniono wpływ badanego związku D10 o małej masie cząsteczkowej na hamowanie oddziaływań chaperon-kochaperon i obliczono wartości IC50, gdzie D10 wykazywał hamowanie zależne od dawki. Wartość IC50 dla oddziaływań GSTFKBP51 Hsp90 wynosiła 65 nanomolowych.Podczas gdy w przypadku interakcji Hsp90 GSTFKBP52 całkowite zahamowanie nie zostało osiągnięte przy najwyższym stężeniu związku, co wskazuje, że można osiągnąć selektywne hamowanie interakcji białko-białko z małymi cząsteczkami. Krytycznym krokiem jest kolejność dodawania. Najpierw tworzymy kompleks między małą cząsteczką a jej celem TPR.W przeciwnym razie wymagana jest dłuższa inkubacja i wyższe stężenia związków. Możemy użyć tej techniki do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek zakłócających interakcję między Hsp90 i FKB51 lub Hsp90 i FKB52. Można go również rozszerzyć na dowolną interakcję między Hsp90, Hsp70 i motywem TPR zawierającym selektywne inhibitory przesiewowe kochaperonu.

studies-chaperone-cochaperone-interactions-using-homogenous-bead

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Dahl, J. i in. Wykrywanie pH-zależnej aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB in vitro i in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje test oparty na spektrofotometrze fluorescencyjnym, który pozwala ocenić aktywność chaperonów na białku substratu pod wpływem stresu kwasowego i cieplnego. Opisuje on kroki monitorowania rozwijającego się i agregującego się podłoża poprzez rozpraszanie światła, porównując warunki z i bez chaperone.

Ocena aktywności bakteryjnego chaperonów poprzez termiczne rozwijanie białka modelowego

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Aby zbadać interakcje chaperon-chaperon i chaperon-substrate, przeprowadzamy syntetyczne badania przesiewowe interakcji w Caenorhabditis elegans za pomocą interferencji RNA w połączeniu z łagodnymi mutacjami lub nadmierną ekspresją białek opiekuńczych i monitorujemy dysfunkcję białek specyficznych dla tkanek na poziomie organizmu.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badań przesiewowych pod kątem interakcji opiekuńczych specyficznych dla tkanek

Ten protokół opisuje zestaw metod, które obejmują analityczną chromatografię wykluczającą wielkość do badania oligomeryzacji i stabilności histonów opiekuńczych, test pull-down do rozwikłania interakcji chaperon-histon histon, AUC do analizy stechiometrii kompleksów białkowych oraz test opiekuńczy histonów do funkcjonalnego scharakteryzowania domniemanego chaperonu histonów in vitro.

In vitro Charakterystyka białek opiekuńczych histonów za pomocą testów analitycznych, pull-down i chaperoningowych

Tutaj opisujemy metodę bakteryjnej koekspresji różnie znakowanych białek za pomocą zestawu kompatybilnych wektorów, a następnie konwencjonalne techniki pulldown do badania kompleksów białkowych, które nie mogą się składać in vitro.

Test pulldown w połączeniu z koekspresją w komórkach bakteryjnych jako efektywne czasowo narzędzie do testowania trudnych interakcji białko-białko

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj jednorodny test na bazie kulek do badania interakcji chaperon-cochaperone między Hsp90 a FKBP51 lub FKBP52. Ta technika umożliwia szybkie przesiewanie inhibitorów o znaczeniu klinicznym.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

Przeglądaj więcej filmów