Name: Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Naucz się ręcznej metody blot and plunge do zamrażania próbek biologicznych na potrzeby kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek. Ta technika jest opłacalna i niezawodna dla badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Herzik za krytyczne myślenie i dostarczenie opinii na temat tego manuskryptu i treści wideo. M.A.H.Jr. jest wspierany przez NIH R35 GM138206 oraz jako stypendysta Searle. H.P.M.N jest wspierany przez Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Chcielibyśmy również podziękować Billowi Andersonowi, Charlesowi Bowmanowi i dr Gabrielowi Landerowi z Instytutu Badawczego Scripps za pomoc w zaprojektowaniu, montażu i przetestowaniu ręcznego tłoka pokazanego na filmie.

Nie mamy nic do ujawnienia.

Witryfikacja próbek biologicznych do obrazowania za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek (cryoEM) pozostaje niezwykle ważnym krokiem w skutecznym określeniu struktury. Opisana w niniejszym protokole ręczna metoda blot and plunge stanowi opłacalną, niezawodną i solidną metodę szybkiego zamrażania próbek biologicznych w cienkich warstwach lodu szklistego do obrazowania krioEM. Korzystając z metod opisanych w manuskrypcie, naukowcy będą w stanie zmontować i obsługiwać ręczny tłok, przygotować k...

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa jednocząsteczkowa (cryoEM) to potężna technika strukturalna, która może być używana do rozwiązywania struktur dynamicznych próbek biologicznych do rozdzielczości bliskiej atomowi1,2,3,4. Rzeczywiście, ostatnie postępy w technologiach bezpośrednich detektorów elektronów4,5,6,7,8,9,10, ulepszenia źródeł elektronów4,11,12,13,14, oraz stabilność soczewek elektromagnetycznych15, w połączeniu z ciągłym rozwojem akwizycji danych16,17 i pakiety oprogramowania do analizy18,19, umożliwiły naukowcom rutynowe określanie struktur dobrze zachowujących się próbek z rozdzielczością 3 A lub lepszą4,11,13,14,20,21,22,23. Pomimo tych ulepszonych możliwości obrazowania i przetwarzania danych, przygotowanie siatki krioEM pozostaje największą przeszkodą w pomyślnym określeniu struktury w wysokiej rozdzielczości i często służy jako znaczne wąskie gardło w przepływie pracy EM24,25,26,27.
CryoEM polega na obrazowaniu próbek biologicznych w roztworach wodnych, które są zamrażane w celu utworzenia cienkiej warstwy "szklistego" lodu - proces znany jako witryfikacja - który zachowuje natywny stan biochemiczny. Witryfikacja próbek biologicznych do krioEM sięga ponad 40 lat wstecz28,29,30 a wiele technik i urządzeń, które zostały opracowane dla tego procesu, opiera się na pierwotnie szczegółowej metodzie blot and plunge31,32,33,34,35, przy czym niewielką objętość próbki (np. 1–5 μl) nakłada się na specjalistyczną siatkę elektromagnetyczną przed usunięciem nadmiaru roztworu za pomocą fizycznej interakcji siatki z bibułą. Czas tego procesu jest zwykle określany empirycznie dla każdej próbki, ponieważ krytycznym składnikiem zamrażania próbek jest grubość szklistej warstwy lodu - jeśli lód jest zbyt gruby, jakość obrazowania pogarsza się dramatycznie z powodu zwiększonego rozpraszania wiązki elektronów, podczas gdy lód, który jest zbyt cienki, może ograniczać orientację białek i/lub wykluczać cząstki ze środka otworów foliowych siatki<klasa sup="xref">36. To poleganie na idealnej grubości lodu dla krioEM pojedynczych cząstek doprowadziło do powstania szerokiej gamy technik i urządzeń, które mogą zamrażać próbki, w tym robotyki37,38, microfluidics42 oraz urządzenia ultradźwiękowe lub natryskowe27,39,40,41,42,43,44. W ostatnich latach niektóre z najpopularniejszych urządzeń do przygotowywania próbek opierają się na wykorzystaniu robotyki do automatycznego zamrażania próbek przy użyciu techniki blot and plunge 45. Chociaż urządzenia te są zaprojektowane tak, aby w sposób powtarzalny wytwarzać odpowiednią grubość lodu do obrazowania, często pozostają one zbyt drogie dla poszczególnych laboratoriów do zakupu i obsługi i zwykle znajdują się w obiektach krioEM po stawkach godzinowych za użytkowanie. W ostatnich latach pierwotna technika ręcznego blot and plunge powróciła do coraz częstszego użytku3,47,48,49,50,51,52. Rzeczywiście, ręcznie obsługiwane urządzenie do blottingu i zanurzania może osiągnąć wysokiej jakości siatki cryoEM za ułamek kosztów zrobotyzowanych odpowiedników. Co więcej, ręczne blotting oferuje również użytkownikom większą kontrolę nad blottingiem, ponieważ badacze mogą dostosować rodzaj blottingu (tj. back-blotting siatki, front-blotting siatki itp.) oraz czas blottingu w oparciu o każdą pojedynczą próbkę i pytania badawcze.
W tym artykule szczegółowo opisujemy, jak skutecznie zamrażać próbki biologiczne za pomocą tradycyjnego ręcznego urządzenia do witryfikacji metodą blot and plunge w połączeniu z specjalnie zaprojektowaną platformą Dewara53. Podano najlepsze praktyki, w tym przygotowanie kriogenu, obsługę siatki, nakładanie próbek i blotting, a także typowe pułapki i zalecenia dotyczące pokonywania tych przeszkód. Omówiono porady dotyczące zwiększania odtwarzalności grubości lodu między preparatami siatkowymi oraz modyfikowania blottingu próbki w zależności od typu próbki biologicznej. Biorąc pod uwagę niskie koszty związane z zakupem i eksploatacją ręcznego tłoka opisanego w tym manuskrypcie, laboratoria na całym świecie mogą przygotować próbki biologiczne do krioEM w opłacalny i powtarzalny sposób.

<table><tbody><tr><td>4-szczelinowy schowek siatkowy</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Płaska metalowa końcówka dozująca o grubości 14 Amazon</td><td></td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm kwadratowa szklana szkiełko nakrywkowe</td><td>Sigma</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>60 mm szklana szalka Petriego do przechowywania siatek</td><td>Fisher</td><td>08-747A Szklana</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm do przechowywania papieru Whatman</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego 150 mm do przechowywania papieru Whatman</td><td>Fisher</td><td>08-747F</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 250 ml</td><td>Fisher</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski styropian dewar</td><td>Spear Lab</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>Mosiężne naczynie etanowe</td><td>Lasco</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zaciskowa</td><td>Ted Pella</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne chusteczki do zadań</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Dwustopniowy regulator z zaworem sterującym</td><td>Airgas</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa kratki Dewer</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma etanu</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na etan</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>etan (50%) : propan (50%) w zbiorniku wysokociśnieniowym</td></tr><tr><td>Zbiornik etanu</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>etan (100%)</td></tr><tr><td>Elastyczna lampa robocza ramienia</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Siatki (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżacz</td><td>Target</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>Higrometr</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>Fartuch</td><td>laboratoryjny UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot dewar</td><td>Worthington</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice z ciekłym azotem</td><td>Fisher</td><td>19-059-925</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny stojak na tłok (stojak + pedał nożny)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mark 5 (platforma wgłębna)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>Pipeta VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-029</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>E0030124286</tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>ibis scientific</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>Lampa pierścieniowa</td><td>Amazon</td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>Okulary ochronne</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Amazon</td><td>Fiskars 01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>Śrubokręt</td><td>Ironside</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Fisher</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta do skrzynki transferowej</td><td>Amazon</td><td>LTS-3</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Tygon</td><td>Fisher</td><td>14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Obrazowanie próbek biologicznych za pomocą elektronów w celu określenia struktury w wysokiej rozdzielczości za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczej cząstki (cryoEM) wymaga cienkiej warstwy szklistego lodu zawierającego interesujące biomolekuły. Pomimo licznych postępów technologicznych w ostatnich latach, które sprawiły, że krioEM pojedynczych cząstek wysunął się na czoło biologii strukturalnej, metody, za pomocą których próbki są witryfikowane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości, często pozostają krokiem ograniczającym szybkość. Chociaż liczne niedawne wysiłki dostarczyły środków do pokonania przeszkód często napotykanych podczas witryfikacji próbek, w tym opracowania nowatorskich nośników próbek i innowacyjnego oprzyrządowania do witryfikacji, tradycyjny ręcznie obsługiwany tłok pozostaje podstawą w społeczności krioEM ze względu na niski koszt zakupu i łatwość obsługi. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody użycia standardowego, ręcznie obsługiwanego urządzenia typu gilotyny do witryfikacji próbek biologicznych w celu obrazowania w wysokiej rozdzielczości za pomocą krioEM-u z pojedynczymi cząstkami. Ponadto opisano również często spotykane problemy i zalecenia dotyczące rozwiązywania problemów, gdy standardowy preparat nie daje odpowiedniej próbki.

Prawidłowe wykonanie opisanego tutaj protokołu blot-and-plunge pozwoli na uzyskanie cienkiej, jednorodnej warstwy lodu witryfikowanego, wolnej od lodu heksagonalnego, zanieczyszczeń oraz dużych gradientów lodu nieprzydatnego do analizy, co można zaobserwować pod mikroskopem elektronowym (Rycina 3). Niestabilny kontakt papieru odsączającego z powierzchnią siatki, zbyt wczesne usunięcie papieru lub jego przesuwanie podczas kontaktu z siatką mogą obniżyć jakość lodu witryfikowanego i prowadzić ...

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Opisana tutaj ręczna metoda zagłębiania jest opłacalną i niezawodną metodą przygotowania próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W tym filmie pokażemy, jak ustawić ręczny tłok, przygotować kriogen oraz wykonać ręczne osuszanie i zanurzanie siatek EM. Przygotuj środowisko ręcznego zanurzania.Zabieg ten należy wykonywać w chłodni utrzymywanej w temperaturze 40 stopni Celsjusza i wilgotności powyżej 95%Zalecamy stosowanie materiałów pokazanych tutaj i zgodnie z opisem w protokole online do ręcznego osuszania i zanurzania. Przygotuj kriogen Dewara i ręczny tłok. Aby zmontować kriogen Dewar, najpierw zainstaluj podstawę platformy na dole niebieskiego styropianu Dewara, upewniając się, że jest płaska i wypoziomowana.Następnie umieść uchwyt naczynia na etan na podstawie platformy i włóż mosiężne naczynie na etan. Na koniec umieść platformę magazynowania wirującej siatki. Następnie zlokalizuj zanurzający się Dewara do podstawy tłoka ręcznego.Wyśrodkuj naczynie z etanem poniżej ramienia zanurzającego się i przymocuj zanurzającego się Dewara do podstawy. Aby ustawić ręczną wysokość zanurzania, najpierw przymocuj świeżą taśmę do podstawy ramienia zanurzającego. Następnie przymocuj pęsetę zaciskową, bezpiecznie owijając taśmę wokół ramienia wgłębnego i podstawy pęsety.Upewnij się, że pęseta jest mocno przymocowana, lekko ją stukając. Przytrzymaj ramię zanurzające i powoli opuść pęsetę do mosiężnego naczynia z etanem, naciskając pedał nożny. Dostosuj położenie zanurzającego się Dewara tak, aby pęseta znajdowała się na środku mosiężnego naczynia z etanem.Końcówki pęsety nie powinny stykać się z rozmiarem ani dnem mosiężnego naczynia na etan, aby uniknąć uszkodzenia pęsety i ręcznego tłoka. Po ustawieniu pozycji zresetuj ręczne ramię wgłębne. Przygotuj kriogen.Przygotowanie kriogenu powinno odbywać się w dobrze wentylowanym pomieszczeniu i przez cały czas należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Na początek ubogi ciekły azot bezpośrednio do zanurzającego się Dewara, zatrzymując się, gdy poziom ciekłego azotu osiągnie górną część mosiężnego naczynia etanowego. System powinien być wystarczająco zimny, aby kontynuować działanie po tym, jak ciekły azot przestanie gwałtownie bulgotać.Zajmie to około pięciu minut. Etan występuje w postaci sprężonego gazu i musi być skondensowany. Aby ustawić przepływ gazu dla optymalnej kondensacji etanu, włóż końcówkę przewodu gazowego etanu do zlewki z wodą o grubości 250 mil i obserwuj bulgotanie.Przepływ gazu powinien wytwarzać stały strumień pęcherzyków, który nie narusza gwałtownie powierzchni wody. Aby rozpocząć kondensację etanu, umieść końcówkę przewodu gazowego etanu na dnie mosiężnego naczynia na etan. Powoli wymieszaj metalową końcówkę i rozpocznij upłynnianie etanu.Gdy tylko etan zacznie się ochładzać, wyda słyszalny dźwięk. Napełnij mosiężne naczynie etan do trzech czwartych ciekłym etanem. Uzupełnij zanurzającego się Dewara ciekłym azotem, upewniając się, że dotyka on mosiężnego naczynia etanu, ale nie rozlewa się do niego.Dodanie ciekłego azotu jest niezbędne do równomiernego zamrażania etanu. Umieść piankową pokrywkę na niebieskim zanurzonym Dewarze i pozwól, aby etan całkowicie zastygł. Uruchom ponownie przepływ etanu i ostrożnie umieść końcówkę przewodu gazowego w stałym etanie.Ważne jest, aby umieścić końcówkę pionowo w naczyniu i dozować etan na dnie. Powoli mieszaj metalową końcówkę, aby stopić etan i doprowadzić poziom ciekłego etanu do górnej części naczynia. Zamknij pokrywę na około jedną minutę i pozwól etanowi zestalić się wokół krawędzi mosiężnego naczynia, aż będą widoczne dwa do trzech milimetrów stałego etanu.Etan znajduje się obecnie w temperaturze idealnej do zamrażania próbek biologicznych. Ostrożnie przymocuj zanurzający się Dewara do podstawy tłoka ręcznego. Przymocuj parę pęsety zaciskowej, bezpiecznie owijając taśmę wokół ramienia wgłębnego i podstawy pęsety.Przytrzymaj ramię wgłębne i powoli opuść pęsetę do ciekłego etanu, naciskając pedał nożny. Dostosuj położenie zanurzającego się Dewara tak, aby pęseta znajdowała się w środku ciekłego etanu, unikając kontaktu ze stałym pierścieniem etanowym. Przygotuj materiały i akcesoria do zanurzania.Przygotuj bibułę, przecinając każdą okrągłą bibułę filtracyjną na paski o szerokości około jednego centymetra. Unikaj dotykania środka bibuły i wyrzuć mniejsze końcówki. Ważne jest, aby upewnić się, że paski bibuły są suche, czyste i wolne od zanieczyszczeń.Przed zanurzeniem umieść pudełka siatkowe w zanurzonym Dewarze w odpowiednich szczelinach. Upewnij się, że siatka zakrywa nasze swobodne obracanie się. Przygotuj próbki CryoEM przez zamrażanie wgłębne.Ze względu na różnorodność siatek i preparatów siatek, należy postępować zgodnie z zalecanymi protokołami uczynienia kratek hydrofilowymi. Aby prawidłowo obchodzić się z kratkami, użyj czystej, suchej pęsety zaciskowej, aby podnieść hydrofilowe kratki na pierścieniu zewnętrznym. Przesuń plastikowy zacisk, aby zabezpieczyć siatkę i delikatnie postukaj pęsetą, aby upewnić się, że siatka jest prawidłowo zaciśnięta.Nałóż trzy mikrolitry próbki na przód siatki trzymanej w pęsetę zaciskową. Mocno przymocuj pęsetę do ręcznego ramienia wgłębnego, owijając taśmę wokół podstawy pęsety. Próbka jest teraz gotowa do osuszenia i zanurzenia w stanie zamrożenia.Trzymaj każdy koniec czystego paska bibuły między palcami wskazującymi i kciukami. Oprzyj dłonie na krawędzi zanurzającego się Dewara, aby ustalić stabilną pozycję. Bibuła powinna znajdować się około jednego centymetra od powierzchni siatki.Zegnij bibułę, aż środek zetknie się z siatką. Ważne jest, aby bibuła była równoległa do powierzchni siatki, aby umożliwić równomierny kontakt i zapobiec uszkodzeniu siatki. Kiedy ruchomy front cieczy przestanie się rozprzestrzeniać, zacznij liczyć.Osusz siatkę na pięć sekund. Rozsuń palce, odcedzając bibułę i szybko usuwając ją z powierzchni siatki. Jednocześnie naciśnij pedał nożny, aby zwolnić ręczne ramię wgłębne, zanurzając pęsetę przytrzymującą siatkę w ciekłym etanie.Trzymając świeżo zamrożoną siatkę w ciekłym etanie, ostrożnie odłącz pęsetę od ręcznego ramienia zanurzającego. Ostrożnie odkręć pęsetę, aby siatka była zdejmowana. Przenieś siatkę do zbiornika ciekłego azotu poniżej mosiężnego naczynia na etan jednym szybkim ruchem od etanu do ciekłego azotu.Umieść siatkę w polu siatki. Reprezentatywne wyniki. Na podstawie tego filmu naukowcy powinni być w stanie przygotować siatki CryoEM, takie jak ta, z wieloma kwadratami zawierającymi cienkie warstwy lodu szklistego do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.Stężenie próbki i czas osuszania można regulować w celu optymalizacji gęstości cząstek. W tym miejscu zademonstrujemy pełny przebieg procesu zamrażania próbek CryoEM przy użyciu metody blot i plunge. Użyj czystej pęsety zaciskowej, aby podnieść świeżą siatkę i zabezpieczyć siatkę na miejscu.Nałóż trzy mikrolitry próbki na hydrofilową stronę siatki i przymocuj pęsetę do ręcznego ramienia zanurzającego, owijając taśmę wokół rączki pęsety. Ustaw bibułę równolegle do powierzchni siatki i delikatnie zegnij bibułę w kierunku siatki, aby rozpocząć bibułę. Po upływie żądanego czasu odsuń bibułę ruchem trzaskowym od powierzchni siatki, jednocześnie naciskając pedał nożny, aby zwolnić ramię wgłębne, zanurzając siatkę w ciekłym etanie.Ostrożnie odwiń taśmę z okolic pęsety i ręcznego ramienia wgłębnego. Jednym szybkim ruchem szybko przenieś siatkę ze zbiornika etanu do zbiornika ciekłego azotu. Umieść siatkę w pudełku do przechowywania siatki i zawiń pęsetę w chusteczkę Kim do wyschnięcia; powtórzyć.

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Tutaj pokazujemy, jak używać urządzenia do zamrażania kanapek do szybkiego zamrażania próbek biologicznych, w tym bakterii, drożdży, hodowanych komórek, izolowanych komórek, tkanek zwierzęcych i ludzkich oraz wirusów. Pokazujemy również, jak przygotować próbki do ultracienkiego cięcia po szybkim zamrożeniu.

Szybkie zamrażanie za pomocą urządzenia do zamrażania kanapkowego w celu dobrego ultrastrukturalnego zachowania próbek biologicznych w mikroskopii elektronowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Technika peel-blot to metoda przygotowania siatki cryo-EM, która pozwala na rozdzielanie wielowarstwowych i skoncentrowanych próbek biologicznych na pojedyncze warstwy w celu zmniejszenia grubości, zwiększenia koncentracji próbki i ułatwienia przetwarzania obrazu.

Technika peel-blot: metoda przygotowania próbek cryo-EM w celu oddzielenia pojedynczych warstw od wielowarstwowych lub skoncentrowanych próbek biologicznych

Tutaj opisujemy protokół stosowania pojedynczej monowarstwy grafenu na siatkach mikroskopii elektronowej i jak przygotować je do użycia w określaniu struktury krioEM.

Wytwarzanie jednowarstwowych siatek pokrytych grafenem do mikroskopii krioelektronowej

Naucz się ręcznej metody blot and plunge do zamrażania próbek biologicznych na potrzeby kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek. Ta technika jest opłacalna i niezawodna dla badaczy.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Przeglądaj więcej filmów