Name: Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę znakowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytek krwi w celu monitorowania ich migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, współfinansowane przez EFS Europejski Fundusz Społeczny i Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego EFRR (MS16/00124; CP16/00124); przez PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansowany z podatku od zrównoważonej turystyki na Balearach; Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); w ramach programu podoktorskiego FOLIUM (FOLIUM 17/01) w ramach FUTURMed, finansowanego w 50% z podatku od zrównoważonej turystyki Balearów i w 50% z EFS; oraz przez Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

UWAGA: Eksplantaty chrząstek zostały uzyskane z IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi po etycznym zatwierdzeniu projektu przez CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. Przygotowanie kolumny
<ol>
	<li>Wyrównać kolumny zgodnie z instrukcjami producenta lub w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Zdejmij nasadkę kolumny i wyrównaj kolumnę. Usuń bufor pamięci masowej przez elucję.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 3 razy 2,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Podczas każdego prania poczekaj, aż kolumna wchłonie całą objętość. 
		UWAGA: Nie pozwól, aby kolumna wyschła.</li>
		<li>Przykryj kolumnę nasadką po ostatnim płukaniu i do czasu przygotowania próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oznakowanie EV
UWAGA: Ten protokół oznaczania EV wykorzystuje próbkę PL-EV wcześniej wyizolowaną metodą chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) z poprzednio opisanymi warunkami21,22. Jednak każda próbka EV z dowolnego źródła może być używana z tym protokołem.
<ol>
	<li>Zagęścić próbkę EV i próbkę kontrolną (PBS) za pomocą rurki zagęszczającej.
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w probówce zagęszczającej o pojemności 15 ml lub 500 μl, w zależności od początkowej objętości próbki EV. Odwirować probówki zgodnie z instrukcjami producenta, aż do uzyskania prawie suchej próbki. 
		UWAGA: Próbka kontrolna jest niezbędna do sprawdzenia, czy nie ma tła barwnika. Chociaż metoda ta nie wymaga określonej objętości początkowej, należy wziąć pod uwagę, że około 10% cząstek zostanie utraconych podczas etapów oczyszczania. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić zagęszczone próbki rozcieńczalnikiem C. Zawiesić próbki EV w 200 μl, a grupę kontrolną w 100 μl i przenieść je do nowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Rozdzielić próbkę EV na dwie podwielokrotności po 100 μl. Oznaczyć jedną z nich barwnikiem i użyć jako obróbki (PKH-PL-EV); drugą pozostawić nieoznaczoną, ale przetworzyć ją (NTA-PL-EV) jak próbkę EV i użyć jej do ilościowego określenia stężenia EV przez NTA.</li>
	<li>Przygotować 2x roztwór barwnika, w wyniku czego otrzymamy 8 μM roztworu PKH26 w rozcieńczalniku C.</li>
	<li>Zmieszać 1 μl 1 mM łącznika PKH26 na 125 μl rozcieńczalnika C w próbce. Przygotować objętość wymaganą do dodania do próbek w stosunku 1:1.</li>
	<li>Dodać 2x roztwór barwnika do PKH-PL-EV i próbek kontrolnych w stosunku 1:1, aby uzyskać 1x stężenie barwnika i 4 μM stężenie PKH26. Dodać tę samą objętość PBS do próbki NTA-PL-EV. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5% roztwór albuminy bydlęcej-PBS do próbek w stosunku 1:1 i upewnić się, że końcowa objętość wynosi ~400 μL. 
	UWAGA: Ten krok umożliwia usunięcie niespecyficznych interakcji barwnika lub barwnika niezwiązanego.</li>
	<li>Kontynuuj oddzielanie oznakowanych EV od niezwiązanego barwnika i niespecyficznych interakcji barwnika z kolumną.</li>
</ol>
3. Izolacja oznaczona jako EV
<ol>
	<li>Zdjąć nakrętkę z kolumny, dodać 400 μl próbki (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV lub kontrolnej) i wyrzucić całą eluowaną ciecz.</li>
	<li>Poczekaj, aż próbka całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku. Dodać 600 μl PBS i wylać cały eluowany płyn.</li>
	<li>Poczekaj, aż PBS całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku. Dodaj 600 μl PBS i zbierz frakcję 600 μl w 1,5. probówka wirówkowa o pojemności ml (EV lub kontrolna). 
	UWAGA: Te kroki są potrzebne, aby usunąć nadmiar barwnika z próbek. Kolejna separacja według kolumn jest potrzebna do uzyskania czystszych EV. W związku z tym następujące kroki należy wykonać w nowej kolumnie zrównoważonej (krok 4.1.) lub w tej samej kolumnie po wstępnym etapie mycia (krok 4.2).</li>
	<li>Przygotuj kolumnę do nowego etapu separacji EV, aby uzyskać czystsze EV. Jeśli jest to nowa kolumna, powtórz kroki 2.1. oraz 2.2. Jeśli jest to ta sama kolumna, przemyć ją 2,5 ml 20% izopropanolu, a następnie powtórzyć kroki 2.1 i 2.2.</li>
	<li>Dodać 600 μl wcześniej eluowanych EV otrzymanych w kroku 2.5 do kolumny i wyrzucić wymywaną objętość. Poczekaj, aż ciecz całkowicie dostanie się do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
	<li>Dodać 400 μl PBS i wyrzucić całą eluowaną objętość. Poczekaj, aż ciecz całkowicie dostanie się do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku.</li>
	<li>Dodać 600 μl PBS i zebrać frakcję 600 μl w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykorzystać EV i próbki kontrolne do dalszych analiz lub przechowywać je przez noc w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Przechowuj używane kolumny do wykorzystania w przyszłości.
	<ol>
		<li>Przemyć kolumnę 25 ml 20% izopropanolu i wyrzucić wymytą objętość. Przemyć kolumnę 3 razy 2,5 ml PBS.</li>
		<li>Dodaj bufor magazynu usunięty w kroku 1.1.1 i poczekaj, aż bufor wejdzie do kolumny. Przykryć kolumnę nakrętką i przechowywać w temperaturze 4 oC do następnego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja EV
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia w stosunku 1:1 000 próbki NTA-PL-EV i początkowej próbki PL-EV zgodnie z opisem w poniższych dwóch krokach.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml rozcieńczonego w stosunku 1:10 NTA-PL-EV i 1 ml rozcieńczonego w stosunku 1:10 początkowego PL-EV z PBS przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm.</li>
		<li>Przygotować 1 ml rozcieńczonych wcześniej próbek w stosunku 1:100 z PBS przefiltrowanym przez filtr 0,2 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć rozcieńczoną w stosunku 1:1 000 próbkę NTA-PL-EV lub początkową próbkę PL-EV za pomocą sterylnej strzykawki do pompy NTA. Postępuj zgodnie z instrukcjami i zaleceniami producenta dotyczącymi oznaczania stężenia cząstek i rozkładu wielkości. 
	UWAGA: Ponieważ stężenie EV zależy od objętości startera próbki, może być konieczne odczytanie pośrednich rozcieńczeń i dokonanie regulacji w celu uzyskania prawidłowego oznaczenia NTA.</li>
</ol>
5. EV stosowane w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów wywołanej stanem zapalnym
<ol>
	<li>Chrząstkę należy dwukrotnie przemyć PBS i wyciąć za pomocą stempla do biopsji o średnicy 3 mm w sterylnych warunkach. 
	UWAGA: Wykonaj procedurę od kroków 5.1 do 5.6 w kapturze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umieść eksplantaty na 96-dołkowych płytkach hodowlanych z pożywką DMEM-F12 uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 oC, 5% CO2 i wilgotności 80%.
	<ol>
		<li>Aby ustalić model choroby zwyrodnieniowej stawów wywołany stanem zapalnym, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowej o 10 ng/ml onkostatyny M i czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) o stężeniu 2 ng/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potraktuj eksplantaty 1 × 109 cząstkami/basenik znakowanych EV (PKH-PL-EV) lub kontrolą w pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej onkostatyną M i TNFα. 
	UWAGA: Zmierzyć objętość próbki zawierającej 1 × 109 cząstek/basenik i użyć tej samej objętości do kontroli.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych zawierających eksplantaty chrząstek. Dodać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych opisanej w kroku 5.3 do każdego dołka. 
	UWAGA: Jeśli 96-dołkowe płytki miały kontakt z płodową surowicą bydlęcą (FBS), przemyj każdą studzienkę trzykrotnie 200 μl PBS, aby usunąć wszelkie EV z FBS.</li>
	<li>Test in vitro należy przerwać w różnych momentach: 0, 1, 2, 3, 4 i 5 godzin.</li>
	<li>Studzienki hodowli komórkowych zawierające eksplantaty chrząstki należy przemyć dwukrotnie 200 μl PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do tkanki, aby utrwalić ją przez 3 godziny w temperaturze 4 oC. 
	UWAGA: Czynności związane z PFA należy wykonywać w dygestoriach zgodnie z zaleceniami zawartymi w karcie charakterystyki.</li>
	<li>Usunąć PFA, dodać 100 μl PBS, przechowywać utrwaloną tkankę w temperaturze 4 °C i przetworzyć próbki w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
6. Przygotowanie i wizualizacja mikroskopii
UWAGA: Ta procedura histologiczna składa się z etapów odwodnienia, zatapiania parafiny i nawadniania. Kroki te mogą zmniejszyć ogólną fluorescencję barwnika (ograniczenie wymienione w karcie katalogowej PKH26). Dlatego inne procedury, takie jak zamrożone sekcje, mogą być bardziej odpowiednie do wizualizacji EV za pomocą mikroskopii konfokalnej.
<ol>
	<li>Osadź utrwalone tkanki w blokach parafinowych. Pokrój tkankę na odcinki o grubości 6 μm.</li>
	<li>Odparafinować skrawki tkanek. 
	UWAGA: Wszystkie czynności z użyciem ksylenu należy wykonywać pod wyciągiem.
	<ol>
		<li>Zanurz skrawki tkanki w ksylenie na 30 min, 100% etanolu na 2 min, 96% etanolu na 2 min, 75% etanolu na 1 min, a na koniec w wodzie destylowanej na 30 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepuszczalność skrawków tkanki.
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,1% roztwór cytrynianu sodu Triton-0,1%, aby przeniknąć do tkanki. Dodaj kroplę o objętości 20 μl do każdej sekcji tkanki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj każdą sekcję dwukrotnie 20 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na szkiełku mikroskopowym dodać kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) z wodnym podłożem montażowym w celu zachowania fluorescencji. Zakryj szkiełko zawierające 3 skrawki tkanki z kroku 6.3.1.</li>
	<li>Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>

<ol><li>Sutton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+synovium%2C+synovial+derived+inflammatory+cytokines+and+neuropeptides+to+the+pathogenesis+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis.</a> The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).</li>
<li>Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+articular+cartilage+defects%3A+Focus+on+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering.</a> In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).</li>
<li>Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte+and+mesenchymal+stem+cell-based+therapies+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis+and+related+orthopaedic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions.</a> Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+medicine+in+rheumatic+disease-progress+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering.</a> Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).</li>
<li>Burke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+mesenchymal+stem+cell+based+therapy+for+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis.</a> Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).</li>
<li>Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+improve+post-stroke+neuroregeneration+and+prevent+postischemic+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).</li>
<li>Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+protect+against+acute+tubular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).</li>
<li>Bruno, S., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mesenchymal+stem+cell-derived+microvesicles+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair.</a> Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).</li>
<li>Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+secreted+vesicles+and+intercellular+communications%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).</li>
<li>D'Arrigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+and+extracellular+vesicles+as+new+biological+therapies+for+knee+osteoarthritis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).</li>
<li>Ryan, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+from+mesenchymal+stromal+cells+for+the+treatment+of+inflammation-related+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).</li>
<li>El Backly, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+induces+in+vitro+wound+healing+of+human+keratinocytes+associated+with+a+strong+proinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response.</a> Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).</li>
<li>Yuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graefe%27s+archive+for+clinical+and+experimental+ophthalmology+outcomes+of+phacoemulsification+in+patients+with+chronic+ocular+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).</li>
<li>Del Bue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+lysate+promotes+in+vitro+proliferation+of+equine+mesenchymal+stem+cells+and+tenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes.</a> Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).</li>
<li>Klatte-Schulz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+platelet+lysates+and+platelet+rich+preparations+to+stimulate+tendon+cell+biology%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).</li>
<li>Headland, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+microvesicles+enter+cartilage+and+protect+the+joint+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+platelet-rich+plasma+present+a+novel+potential+in+alleviating+knee+osteoarthritis+by+promoting+proliferation+and+inhibiting+apoptosis+of+chondrocyte+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).</li>
<li>Otahal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+chondroprotective+effects+of+extracellular+vesicles+from+plasma-+and+serum-based+autologous+blood-derived+products+for+osteoarthritis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).</li>
<li>Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+carriers+of+microRNA%2C+proteins+and+lipids+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment.</a> International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).</li>
<li>Ortega, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+endolysosomal+trafficking+enhances+release+of+bioactive+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).</li>
<li>de Miguel Pérez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-miRNAs+as+liquid+biopsy+biomarkers+for+disease+identification+and+prognosis+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Morelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%2C+intracellular+sorting%2C+and+processing+of+exosomes+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells.</a> Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+internalization+of+exosomes+occurs+through+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis.</a> Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).</li>
<li>Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+Current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6, 7029(2015).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+in+vivo+tracking+of+the+exosomes+of+murine+melanoma+B16-BL6+cells+in+mice+after+intravenous+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection.</a> Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).</li>
<li>Askenasy, N., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+PKH-labeled+hematopoietic+cells+in+recipient+bone+marrow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo.</a> Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).</li>
<li>Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effect+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+on+a+concanavalin+A-induced+liver+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model.</a> Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Skardelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+benefit+of+human+fetal+neuronal+progenitor+cell+transplantation+in+a+clinically+adapted+model+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).</li>
<li>Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html">https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html</a> (2021).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+extracellular+vesicles+for+nanoscale+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie EV pomaga zrozumieć właściwości EV, takie jak mechanizmy ich uwalniania i wychwytywania. Ich obrazowanie pozwala na monitorowanie ich biodystrybucji i scharakteryzowanie ich właściwości farmakokinetycznych jako nośników leków. Jednak obrazowanie i śledzenie EV może być trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary, chociaż opracowano wiele urządzeń do obrazowania i technik znakowania, aby pomóc naukowcom monitorować EV w warunkach in vitro i in vivo 23,24,25.</sup...

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest chorobą zwyrodnieniową stawów, która implikuje postępujące i nieodwracalne zapalenie oraz zniszczenie macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki stawowej1. Chociaż różne formy zapalenia stawów mają liczne metody leczenia2,3,4, są one ograniczone przez ich skutki uboczne i ograniczoną skuteczność. Techniki inżynierii tkankowej wykorzystujące autologiczną implantację chondrocytów są rutynowo stosowane do leczenia regeneracyjnego uszkodzonej chrząstki we wczesnych uszkodzeniach chrząstki zwyrodnieniowej stawów4. Terapie komórkowe są ograniczone głównie ze względu na ograniczoną liczbę fenotypowo stabilnych chondrocytów lub chondroprogenitorów zdolnych do skutecznej naprawy chrząstki3. Dlatego tak ważne jest opracowanie nowych strategii terapeutycznych zapobiegających postępowi choroby i regeneracji dużych zmian w chrząstce.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) zostały zasugerowane jako metoda leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów przez różnych autorów5,6. EV są błoniastymi ciałami wydzielanymi przez większość typów komórek, biorą udział w sygnalizacji międzykomórkowej i wykazano, że wywierają terapeutyczne działanie komórek macierzystych7,8,9, dzięki czemu ostatnio wzbudziły zainteresowanie medycyną regeneracyjną10. EV pochodzące z mezenchymalnych komórek zrębowych (MSC) są głównymi terapeutycznymi EV badanymi pod kątem choroby zwyrodnieniowej stawów, chociaż jako źródła EV stosowano inne komórki związane ze stawami, np. chondroprogenitory lub komórki odpornościowe11,12.
Koncentraty płytek krwi, takie jak lizaty płytkowe (PL), są używane do przyspieszenia gojenia się ran w różnych urazach, takich jak owrzodzenia rogówki13,14,15 lub w regeneracji tkanek ścięgien16, ze względu na hipotezę, że składnik EV koncentratów płytek krwi może być odpowiedzialny za te efekty17. Niektóre badania związane z chorobami związanymi ze stawami wykorzystują płytki krwi (PL-EVs) jako leczenie w celu złagodzenia stanów zwyrodnieniowej stawów. PL-EV poprawiają proliferację chondrocytów i migrację komórek poprzez aktywację szlaku Wnt/β-kateniny 18, promowanie ekspresji markerów chondrogennych w chondrocytach z chorobą zwyrodnieniową stawów19, lub wykazywanie wyższych poziomów białek chondrogennych i mniej nieprawidłowości tissular u królików z chorobą zwyrodnieniową stawów leczonych PL-EVs18.
EV zawierają białka, lipidy i kwasy nukleinowe, które są uwalniane do komórki docelowej, ustanawiając komunikację między komórkami, co jest główną cechą związaną z ich zastosowaniami terapeutycznymi20. Skutki działania pojazdów elektrycznych zależą od ich dotarcia do ogniw i późniejszego uwolnienia ładunku. Efekt ten może być potwierdzony pośrednio przez zmiany zachodzące w komórkach, takie jak aktywność metaboliczna czy modyfikacja ekspresji genów. Metody te nie pozwalają jednak na wizualizację, w jaki sposób EV docierają do komórek, aby pełnić swoją funkcję. W związku z tym w niniejszym artykule przedstawiono metodę oznaczania tych EV pochodzących z PL, które mają być stosowane w leczeniu eksplantatów chrząstki zwyrodnieniowej stawów wywołanych stanem zapalnym. Mikroskopię konfokalną wykorzystano do monitorowania wychwytu EV i progresji do chondrocytów obecnych w eksplantatach w czasie poklatkowym wynoszącym 5 godzin.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>SPL nauki przyrodnicze</td><td>PLC60015</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka BD Plastipak</td><td>BD</td><td>303174</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Panreac AppliChem</td><td>1.310.901.211</td><td>Przygotowany w 20% z wodą Milli-Q</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>SPL nauki przyrodnicze</td><td></td><td></td>PLC30096</tr><tr><td>Etanol absolutny Pharmpur</td><td>Scharlab</td><td>ET0006005P</td><td>Służy do przygotowania 96% i 75% etanolu z wodą Milli-Q</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji z tłokiem 3 mm</td><td>Scandidact</td><td>MTP-33-32</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca&nbsp; Albumina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Przygotowana w 5% z PBS</td></tr><tr><td>Eksplantaty chrząstki</td><td>IdISBa Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka zagęszczająca 15 ml Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>MCP100C41</td><td></td></tr><tr><td>Rurka zagęszczająca 500 &micro; L Nanosep 100 kD Omega</td><td>Pall</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>Deltalab</td><td>D102460</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 -GlutaMAX medium</td><td>Biowest</td><td>L0092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Wbudowane bloki tkanki parafinowej</td><td>Biobank</td><td></td> IdISBa <td>Opłata za usługę</td></tr><tr><td>Kolumny Exo-spin mini-HD</td><td>Systemy prowadzenia komórek</td><td>EX05</td><td></td></tr><tr><td>Feather S35 Microtome Blade</td><td>Feather</td><td>43037</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0,2 &micro; m filtr strzykawkowy</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield z DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6057</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatin M Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O9635-10UG</td><td>Przygotować roztwór podstawowy do końcowego stężenia 0,1 &mikro; g/&mikro; L rozcieńczony w PBS-0,1%</td></tr><tr><td>BSA Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18715.1000</td><td>Przygotowany w stężeniu 4% z PBS i przechowywany w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny 100x</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego znakowania błon komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 i Dliuent C w zestawie</td></tr><tr><td>Dwuwodny cytrynian sodu</td><td>Scharlab</td><td>SO019911000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>TNF&alfa;</td><td>R& Systemy D</td><td>210-TA-005</td><td>Przygotować roztwór podstawowy do końcowego stężenia 0,01 &mikro; g/&mikro; L rozcieńczony w PBS-0,1% BSA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Służy do przygotowania 0,1% roztworu cytrynianu sodu Triton-0,1% z wodą Milli-Q</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Scharlab</td><td>XI0050005P</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5430 R</td><td>Wirnik Eppendorf</td><td>5428000210</td><td>F-45-48-11</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Urządzenie Malvern</td><td>NS300</td><td>z wbudowanym laserem o długości &lambda;= 532 nm i kamerą sCMOS</td></tr><tr><td>Shandon Finesse 325 Instrukcja obsługi Microtome</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny A78100101 TCS-SPE</td><td>5200000271</td><td></td> <td>Leica Microsystems</td></tr></tbody></table>

znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są używane w różnych badaniach, aby udowodnić ich potencjał jako leczenie bezkomórkowe, ze względu na ich ładunek pochodzący ze źródła komórkowego, takiego jak lizat płytkowy (PL). Oczekuje się, że w przypadku stosowania w leczeniu EV dotrą do komórek docelowych i wywołają z nich odpowiedź. W tym badaniu EV pochodzące z PL zostały zbadane jako bezkomórkowe leczenie choroby zwyrodnieniowej stawów (OA). W związku z tym stworzono metodę znakowania EV i testowania ich wchłaniania na eksplantatach chrząstek. EV pochodzące z PL są znakowane lipofilowym barwnikiem PKH26, dwukrotnie przemywane przez kolumnę, a następnie testowane w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów in vitro napędzanym stanem zapalnym przez 5 godzin po kwantyfikacji cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Co godzinę eksplantaty chrząstki są utrwalane, parafinowane, cięte na sekcje 6 μm w celu zamontowania na szkiełkach i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Pozwala to na weryfikację, czy EV dostają się do komórek docelowych (chondrocytów) w tym okresie i analizę ich bezpośredniego działania.

Schematyczny przegląd znakowania EV i monitorowania ich pobierania przedstawiono w Rysunek 1Stężenie cząstek i wielkość EV wyznaczone za pomocą NTA w Tabela 1 wykazano, że stężenie EV spada w trakcie procesu z powodu dwukrotnego przeprowadzenia etapu oczyszczania kolumnowego po znakowaniu. Niemniej jednak otrzymana ilość mieści się w optymalnym zakresie liczby cząstek do zastosowania w terapii. Stężenie cząstek to jest wykorzystywane do obliczenia objętości PKH-PL-EV oraz ko...

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytkowego w celu monitorowania ich migracji i pobierania w eksplantatach chrząstek, używanych jako model choroby zwyrodnieniowej stawów.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Ten prosty protokół pozwala na oznaczanie EV i monitorowanie ich za pomocą mikroskopii konfokalnej. Na przykład obrazowanie EV może pomóc w ocenie dystrybucji EV w przypadku stosowania go w terapii. Technika ta pozwala na łatwe monitorowanie migracji i wychwytu EV w eksplantatach chrząstek, za pomocą mikroskopii konfokalnej bez żadnej specjalnej funkcji.Ten sam protokół może być stosowany w przypadku EV w eksperymentach in vitro lub in vivo. Upewnij się, że kolumny są przygotowane wcześniej i że początkowa objętość EV jest wystarczająca do osiągnięcia pożądanego końcowego stężenia cząstek, biorąc pod uwagę, że około 10% cząstek zostanie utraconych na etapie oczyszczania. Zacznij od zagęszczenia pęcherzyka zewnątrzkomórkowego lub EV próbki i kontroli.Umieść próbki w probówce zagęszczającej o pojemności 15 mililitrów lub 500 mikrolitrów, w zależności od początkowej objętości próbki EV. Odwirować probówki zgodnie z instrukcjami producenta, aż do uzyskania prawie suchej próbki. Ponownie zawiesić skoncentrowane próbki EV w 200 mikrolitrach, a grupę kontrolną w 100 mikrolitrach rozcieńczalnika C i przenieść je do nowych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych.Podzielić próbkę EV na dwie podwielokrotności po 100 mikrolitrów każda. Oznacz jedną z porcji barwnikiem i użyj jej jako zabiegu. Pozostaw drugą nieoznaczoną, ale przetwórz ją jak próbkę EV i użyj jej do ilościowego określenia stężenia EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.Przygotować 2x roztwór barwnika tak, aby wynikowe stężenie roztworu PKH26 w rozcieńczalniku C wynosiło osiem mikromolów. Wymieszać jeden mikrolitr jednomilimolowego łącznika PKH26 na 125 mikrolitrów rozcieńczalnika C w próbce. Przygotować objętość wymaganą do dodania do próbek w stosunku 1:1.Dodaj 2x roztwór barwnika do EV pochodzących z lizatu płytkowego PKH i próbek kontrolnych w stosunku 1:1, aby uzyskać 1x stężenie barwnika i cztery mikromolowe stężenie PKH26. Dodać tę samą objętość PBS do próbki EV pochodzącej z lizatu płytkowego NTA. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Dodać 5% roztwór albuminy PBS surowicy bydlęcej do próbek w stosunku 1:1 i upewnić się, że końcowa objętość wynosi około 400 mikrolitrów. Kontynuuj oddzielanie oznaczonych EV od niezwiązanego barwnika i niespecyficznych interakcji barwnika z kolumną. Zdjąć nakrętkę z kolumny, dodać 400 mikrolitrów EV pochodzących z lizatu płytkowego PKH, EV pochodzących z lizatu płytkowego NTA lub kontrolować i wyrzucać cały eluowany płyn.Poczekaj, aż próbka całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku. Dodaj 600 mikrolitrów PBS i wyrzuć cały eluowany płyn. Poczekaj, aż PBS całkowicie wejdzie do kolumny, zanim przejdziesz do następnego kroku.Dodaj 600 mikrolitrów PBS i zbierz frakcję 600 mikrolitrów w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. W przypadku nowej kolumny należy powtórzyć kroki dotyczące stężenia próbek wymienionych na początku protokołu. Dodaj 600 mikrolitrów wcześniej eluowanych EV do kolumny i wyrzuć wymywaną objętość.Następnie dodaj 400 mikrolitrów PBS i wyrzuć wszystkie eluowane objętości. Dodaj 600 mikrolitrów PBS do kolumny i zbierz frakcję 600 mikrolitrów w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej. Umyj chrząstkę dwa razy PBS i wyciąć ją za pomocą stempla biopsyjnego o średnicy trzech milimetrów w sterylnych warunkach.Umieść eksplantaty na 96-dołkowych płytkach hodowlanych z pożywką DMEM-F12, uzupełnioną 1% streptomycyną penicyliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i wilgotności 80%. Aby ustalić model choroby zwyrodnieniowej stawów wywołany stanem zapalnym, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowej o 10 nanogramów na mililitr onkostatyny M i dwóch nanogramów na mililitr czynnika martwicy nowotworu alfa. Potraktuj eksplantaty 1 razy 10 do 9 cząstek na studzienkę EV pochodzących z lizatu płytkowego PKH lub kontroli w pożywce do hodowli komórkowej uzupełnionej onkostatyną M i czynnikiem martwicy nowotworu alfa.Usunąć pożywkę z 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych zawierających eksplantaty chrząstek. Dodać 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka, jak opisano w manuskrypcie. Test in vitro należy wykonywać co godzinę od zera do pięciu godzin.Umyj studzienki hodowli komórkowych zawierające eksplantaty chrząstki dwa razy 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 100 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do tkanki, aby utrwalić ją przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza. Usuń PFA, dodaj 100 mikrolitrów PBS, przechowuj utrwaloną tkankę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przetwórz próbki w ciągu 48 godzin.Obrazy wykonane w różnych punktach czasowych pokazują, w jaki sposób EV wnikają do tkanki, aż dotrą do chondrocytów i dostają się do chondrocytów w czasie. Oznaczone EV były już zlokalizowane wokół chondrocytów po godzinie inkubacji. Upewnij się, że początkowa objętość EV jest wystarczająca do osiągnięcia pożądanego końcowego stężenia cząstek.Kolejną ważną rzeczą do zapamiętania jest użycie oznaczonych EV w ciągu najbliższych 24 godzin. Jeśli nie zostanie zużyty w ciągu 24 godzin, może wystąpić spadek fluorescencji. Technika ta pomoże naukowcom udoskonalić obrazowanie pojazdów elektrycznych oraz badać pojazdy elektryczne w biologii i leczeniu.

labeling-extracellular-vesicles-for-monitoring-migration-uptake

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Ten protokół opisuje skuteczny sposób monitorowania trwałości komórek i biodystrybucji ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (haMSC) poprzez znakowanie fluorescencyjne na czerwono w modelu choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego szczura (KOA) poprzez wstrzyknięcie dostawowe (IA).

In vivo (in vivo) Śledzenie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej w modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolanowych szczura z fluorescencyjnym lipofilowym barwnikiem błonowym

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Tutaj prezentujemy protokół produkcji dużej liczby egzosomów klasy GMP z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą bioreaktora 3D.

Przygotowanie na dużą skalę egzosomów pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych płynu maziowego za pomocą hodowli bioreaktora 3D

Opisujemy protokół znakowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z makrofagów barwnikami PKH i obserwowania ich absorpcji in vitro i w rdzeniu kręgowym po podaniu dokanałowym.

Wychwyt znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych in vitro i w rdzeniu kręgowym

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę znakowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z lizatu płytek krwi w celu monitorowania ich migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Znakowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu monitorowania migracji i wychwytu w eksplantatach chrząstki

Przeglądaj więcej filmów