Name: Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Naucz się tworzenia naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków Danio rerio w celu badania sygnałowania Nodal podczas gastrulacji. Ta metoda umożliwia analizę ruchów komórkowych i ekspresji genów w uproszczonym systemie pozaustrojowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NICHD R00HD091386 do MLKW i przez NIEHS T32ES027801 do AAE.

1 Przygotuj odczynniki i zapasy
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynnika
	<ol>
		<li>Przygotować 500 ml 3x roztworu Danieau (roztwór 1, tabela 1).</li>
		<li>Przygotuj 1 l wody jajecznej (roztwór 2, tabela 1).</li>
		<li>Przygotuj 1,2% roztwór agarozy w wodzie jajecznej. Rozpuść agarozę w całości w kuchence mikrofalowej, a następnie schłodzić do 55 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Przygotuj 4 ml pożywki eksplantacyjnej (roztwór 3, tabela 1, nieznacznie zmodyfikowana z19,21) zgodnie z warunkami doświadczalnymi. 
		UWAGA: Pamiętaj, aby przy obliczaniu wymaganej objętości uwzględnić co najmniej jeden studzienek eksplantatów z zarodków niewstrzykniętych (lub z wstrzykniętymi zarodkami kontrolnymi).
		<ol>
			<li>Zdezynfekuj miejsce pracy za pomocą 70% etanolu.</li>
			<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z 4 °C i spryskać/przetrzeć 70% etanolem.</li>
			<li>Przygotować pożywkę z eksplantatów i umieścić w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C do ogrzania podczas wstrzykiwania zarodków. 
			UWAGA: W celu oceny stopnia zaawansowania należy zawsze dołączać nienaruszone zarodki rodzeństwa o tym samym wieku. Dechorionować te zarodki i hodować je na płytkach pokrytych agarozą w 0,3x roztworze Danieau (roztwór 4, tabela 1).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Usunąć podwielokrotności pronazy (1 ml przy 20 mg/ml) z temperatury -20 °C i pozostawić do rozmrożenia na lodzie. Rozmrozić jedną podwielokrotność 1 ml na każde trzy warunki doświadczalne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj talerze z agarozą
	<ol>
		<li>Wykonaj płytki wtryskowe.
		<ol>
			<li>Napełnij plastikową szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm do połowy stopioną agarozą w wodzie jajecznej.</li>
			<li>Delikatnie umieść formę wtryskową na stopionej agarozie pod kątem 45° i stopniowo opuszczaj ją do agarozy, upewniając się, że pod spodem nie są uwięzione pęcherzyki. Niech całkowicie ostygnie.</li>
			<li>Usuń formę. Płytkę należy zużyć natychmiast lub zachować na później, dodając 2 ml wody jajecznej, owijając płytkę i przechowując ją w temperaturze 4 °C. Przed wstrzyknięciem należy ogrzewać płytkę przez 15-30 minut w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zrób płyty do cięcia eksplantacji.
		<ol>
			<li>Dodaj 3 ml stopionej 1,2% agarozy w wodzie jajecznej do szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm, upewniając się, że całe dno studzienki jest pokryte. Niech całkowicie ostygnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pokryj płytki hodowlane agarozą.
		<ol>
			<li>Dla każdego warunku eksperymentalnego dozuj 1 ml stopionej 1,2% agarozy w wodzie jajecznej do jednej studzienki na 6-dołkowej płytce, upewniając się, że całe dno studzienki jest pokryte. Niech całkowicie ostygnie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby zrobić chimeryczne eksplantaty, stwórz naczynie do cięcia eksplantów z małymi dołkami, dodając dwanaście szklanych kulek o średnicy 1 mm do stopionej agarozy na szalce Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm. Usuń koraliki kleszczami, gdy agaroza całkowicie ostygnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2 Wstrzykiwanie zarodków z RNA
<ol>
	<li>W rękawiczkach wyjąć porcję syntetycznego mRNA ndr2 z magazynu w temperaturze -80 °C i natychmiast umieścić ją na lodzie.</li>
	<li>Przygotować igłę do wstrzykiwań.
	<ol>
		<li>Napełnij wyciągniętą szklaną igłę kapilarną RNA. Umieść napełnioną igłę w mikromanipulatorze i złamij końcówkę igły kleszczami.</li>
		<li>Skalibruj objętość wtrysku za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego, dostosowując czas wtrysku i ciśnienie na wtryskiwaczu pneumatycznym, aby uzyskać bolus o pożądanej wielkości. Bolus o średnicy 120 μm ma objętość 1 nL. 
		UWAGA: Pożądana objętość bolusa będzie zależeć od stężenia RNA i pożądanej dawki na zarodek. Na przykład, jeśli RNA jest porcjowany w ilości 10 ng / μl, wstrzyknij 1 nL, aby uzyskać końcową ilość 10 pg.
		<ol>
			<li>Końcówkę igły RNA należy przechowywać zanurzoną w oleju, aż będzie gotowa do wstrzyknięcia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować zarodki i wstrzyknąć.
	<ol>
		<li>Pociągnij przegrody w zbiornikach hodowlanych, pozwól rybom na tarło przez 10-15 minut i zbierz zarodki za pomocą sitka do herbaty.</li>
		<li>Załadować zarodki do płytki iniekcyjnej za pomocą pipety Pasteura i pompki do pipet, a następnie delikatnie wcisnąć jaja do koryt palcem w rękawiczce.</li>
		<li>Wstrzyknąć 10 pg ndr2 RNA do żółtka zarodków jednokomórkowych, aż do osiągnięcia pożądanej liczby zarodków lub do momentu, gdy zarodki zaczną się dzielić. 
		UWAGA: Nie należy wstrzykiwać po stadium jednokomórkowym, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie RNA w całym zarodku.</li>
		<li>Wypłukać zarodki z płytki iniekcyjnej na oznaczoną szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm delikatnym strumieniem wody jajecznej z butelki do wyciskania. 
		UWAGA: Jako grupę kontrolną należy zawsze trzymać grupę rodzeństwa w tym samym wieku, któremu nie wstrzyknięto iniekcji.</li>
		<li>Umieścić zarodki w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną stadium 128 komórek. Usuń niezapłodnione jaja i martwe zarodki z naczynia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3 Dechorionacja zarodków
<ol>
	<li>Gdy zarodki osiągną stadium 128 komórek, umieść je na oznakowanych szklanych szalkach Petriego i zlej z nich jak najwięcej wody jajecznej.</li>
	<li>Oznacz szklane naczynia krystalizujące taśmą laboratoryjną (odpowiadającą nazwom małych naczyń) i napełnij 2/3 drogi wodą jajeczną. Umieść te naczynia obok mikroskopu preparacyjnego, aby mieć do nich szybki dostęp.</li>
	<li>Dodaj 1 ml bulionu pronazy (20 mg/ml, rozmrożonego na lodzie) do 15 ml 3x roztworu Danieau w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Ta ilość jest wystarczająca dla maksymalnie trzech warunków eksperymentalnych. Zwiększ objętość pronazy i 3x roztwór Danieau, aby uzyskać dodatkowe warunki eksplantacji. 
	UWAGA: Pronaza jest substancją drażniącą; dlatego podczas obsługi należy nosić rękawice.</li>
	<li>Dodać co najmniej 5 ml roztworu pronazy do każdej szklanej szalki Petriego zawierającej zarodki.</li>
	<li>Mieszaj szklane naczynia okrężnymi ruchami, konsekwentnie monitorując postęp dechorionacji pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Gdy kosmówka zacznie się marszczyć, a 1-2 zarodki wyjdą z kosmówki, ostrożnie zanurz szklaną szalkę Petriego zawierającą pronazę i zarodki w odpowiednim szklanym naczyniu krystalizującym zawierającym wodę jajeczną.</li>
	<li>Umyj zarodki z odkorzówką.
	<ol>
		<li>Umyj zarodki trzy razy wodą jajeczną, delikatnie dodając, a następnie dekantując wodę jajeczną z naczynia.</li>
		<li>Trzecie i ostatnie mycie odbywa się 0,3x roztworem Danieau. 
		UWAGA: Jeśli po umyciu zarodki nadal mają kosmówkę, delikatnie pipetuj zarodki, aż kosmówka zostanie usunięta lub pozwól im siedzieć w płuczce (woda jajeczna lub 0,3 x roztwór Danieau) przez minutę lub dwie i delikatnie mieszaj okrężnymi ruchami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryć zarodki z odkorówką pokrywką na płytce Petriego i umieścić je z powrotem w inkubatorze (28,5 °C) aż osiągną stadium 256 komórek.</li>
</ol>
4 Wytnij eksplantaty
<ol>
	<li>Napełnij pokrytą agarozą szalkę Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm 3x roztworem Danieau.</li>
	<li>Gdy zarodki znajdą się w stadium 256 komórek, przenieś je na pokrytą agarozą płytkę zawierającą 3x roztwór Danieau, ustawiając je wzdłuż środka naczynia.</li>
	<li>Pokrój eksplantaty za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
	<ol>
		<li>Użyj jednej pary kleszczy, trzymanych blisko, aby ustabilizować zarodek, a drugiej użyj do przecięcia blastodermy w przybliżeniu w połowie jej wysokości (od marginesu do bieguna zwierzęcego) (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).</li>
		<li>Aby przeciąć, delikatnie ściśnij komórki blastodermy jedną parą kleszczy. Następnie weź kleszcze stabilizujące i przesuń je wzdłuż innych kleszczy, aby przeciąć mniej więcej do połowy blastodermy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1B).</li>
		<li>Obróć zarodek, umieszczając kleszcze w istniejącym nacięciu, a następnie odetnij pozostałą blastodermę prostopadle do pierwszego cięcia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj eksplantaty w 3x roztworze Danieau przez co najmniej 5 minut, aby się zagoić, a następnie przenieś je do dołka 6-dołkowej płytki pokrytej agarozą i wypełnionej 4 ml pożywki eksplantacyjnej. 
	UWAGA: Wytnij eksplantaty z niewstrzykniętego (lub kontrolnego) rodzeństwa jako kontrolę negatywną. Jeśli eksplantaty są wykonywane prawidłowo, te eksplantaty nie będą ani rozszerzać, ani wyrażać markerów endodermy, mezodermy lub neuroektodermy.</li>
	<li>Umieścić płytki z kultur eksplantatów w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aż do osiągnięcia pożądanego punktu czasowego/etapu (określonego na podstawie nienaruszonego rodzeństwa). 
	UWAGA: W przypadku traktowania eksplantatów związkiem, takim jak inhibitor małych cząsteczek, pożądane stężenie można dodać bezpośrednio do pożywki eksplantacyjnej w studzienkach w żądanych punktach czasowych. Pamiętaj, aby przy obliczaniu stężeń uwzględnić objętość agarozy. (Przykład: 1 ml agarozy + 4 ml pożywki eksplantacyjnej, = 5 ml całkowitej objętości na studzienkę).</li>
</ol>
5 Przygotuj chimeryczne eksplantaty
<ol>
	<li>Zamiast zwykłego talerza pokrytego agarozą, pokrój chimeryczne eksplantaty w naczyniu z agarozą uformowaną w dwanaście małych, płytkich dołków za pomocą szklanych kulek o średnicy 1 mm (sekcja 1.2.4). Napełnij tę płytkę 3x roztworem Danieau. 
	UWAGA: Chimeryczne eksplantaty są generowane z komórek blastodermy dwóch zarodków o różnych genotypach lub stanach. Należy zapewnić, aby warunki te można było odróżnić od siebie na podstawie ekspresji transgenicznych lub wstrzykniętych markerów fluorescencyjnych.
	<ol>
		<li>Przygotować się, dodając dwanaście zarodków jednego genotypu/stanu po lewej stronie płytki i dwanaście zarodków o innym genotypie/stanie po prawej stronie płytki.</li>
		<li>Przenieś po jednym zarodku każdego stanu na środek płytki, w pobliżu jednego z 12 dołków.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy wytnij eksplant z każdego zarodka, jak opisano dla eksplantatów z pojedynczych zarodków (krok 4.3).</li>
		<li>Szybko ściśnij przycięte krawędzie dwóch eksplantatów do siebie w płytkiej studni za pomocą kleszczy, aby obie połówki zagoiły się razem w jeden eksplant.</li>
		<li>Kontynuuj z pozostałymi jedenastoma dołkami na talerzu. Po zagojeniu eksplantatów przenieś je do dołka 6-dołkowej płytki pokrytej agarozą i wypełnionej 4 ml pożywki z eksplantatów. Powtarzaj, aż zostanie osiągnięta pożądana liczba eksplantatów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6 Kultura i/lub obraz stałych eksplantatów
<ol>
	<li>Hodowlę eksplantuje się w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C, aż nienaruszone zarodki rodzeństwa osiągną pożądane stadium.</li>
	<li>Żywe eksplantaty mogą być montowane w celu ciągłego obrazowania poklatkowego, obrazowane okresowo przez cały okres hodowli lub obrazowane na żywo w eksperymentalnym punkcie końcowym.</li>
	<li>W razie potrzeby napraw eksplantaty. Gdy eksplantaty osiągną pożądany punkt końcowy, zwróć uwagę na stadium nienaruszonego rodzeństwa zarodków i umieść eksplantaty w szklanej fiolce scyntylacyjnej z 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS. Mocować przez noc na wytrząsarce w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny. Podczas obchodzenia się z tą substancją chemiczną należy nosić rękawice i utylizować ją metodami zatwierdzonymi przez każdą instytucję.
	<ol>
		<li>Po utrwaleniu przepłukać eksplantaty sześć razy po 15 minut PBS + 0,1% Tween-20 i stopniowo odwadniać do metanolu. Przechowywać eksplantaty w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy poprzez hybrydyzację in situ w całości, barwienie immunofluorescencyjne itp.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+embryonic+Xenopus+cells+to+activin+and+FGF+are+separated+by+multiple+dose+thresholds+and+correspond+to+distinct+axes+of+the+mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm.</a> Cell. 71 (5), 731-739 (1992).</li>
<li>Sudarwati, S., Nieuwkoop, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+formation+in+the+anuranXenopus+laevis+%28Daudin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archiv+fur+Entwicklungsmechanik+der+Organismen%22%5BJournal%5D)">Mesoderm formation in the anuranXenopus laevis (Daudin).</a> Wilhelm Roux Archiv fur Entwicklungsmechanik der Organismen. 166 (3), 189-204 (1971).</li>
<li>Gurdon, J. B., Fairman, S., Mohun, T. J., Brennan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+actin+genes+in+Xenopus+development+by+an+induction+between+animal+and+vegetal+cells+of+a+blastula%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific actin genes in Xenopus development by an induction between animal and vegetal cells of a blastula.</a> Cell. 41 (3), 913-922 (1985).</li>
<li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+expression%2C+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li>
<li>Ariizumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+Xenopus+animal+cap+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of Xenopus animal cap cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1 Unit 1D.5 (2009).</li>
<li>Asashima, M., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inducers+on+inner+and+outer+gastrula+ectoderm+layers+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Effects of inducers on inner and outer gastrula ectoderm layers of Xenopus laevis.</a> Differentiation. 23 (3), 206-212 (1983).</li>
<li>Jones, E. A., Woodland, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+ectoderm+in+Xenopus%3A+tissue+specification+and+the+role+of+cell+association+and+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development of the ectoderm in Xenopus: tissue specification and the role of cell association and division.</a> Cell. 44 (2), 345-355 (1986).</li>
<li>Keller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+dye+mapping+of+the+gastrula+and+neurula+of+Xenopus+laevis.+I.+Prospective+areas+and+morphogenetic+movements+of+the+superficial+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Vital dye mapping of the gastrula and neurula of Xenopus laevis. I. Prospective areas and morphogenetic movements of the superficial layer.</a> Developmental Biology. 42 (2), 222-241 (1975).</li>
<li>Sokol, S., Wong, G. G., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+macrophage+factor+induces+head+structures+and+organizes+a+body+axis+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mouse macrophage factor induces head structures and organizes a body axis in Xenopus.</a> Science. 249 (4968), 561-564 (1990).</li>
<li>Thomsen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activins+are+expressed+early+in+Xenopus+embryogenesis+and+can+induce+axial+mesoderm+and+anterior+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activins are expressed early in Xenopus embryogenesis and can induce axial mesoderm and anterior structures.</a> Cell. 63 (3), 485-493 (1990).</li>
<li>Howard, J. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrulation%3A+different+types+of+gastrulation+movement+are+induced+by+different+mesoderm-inducing+factors+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrulation: different types of gastrulation movement are induced by different mesoderm-inducing factors in Xenopus laevis.</a> Mechanisms of Development. 43 (1), 37-48 (1993).</li>
<li>Fulton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+specification+in+Zebrafish+is+robust+to+cell+mixing+and+reveals+a+regulation+of+pattern+formation+by+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Axis specification in Zebrafish is robust to cell mixing and reveals a regulation of pattern formation by morphogenesis.</a> Current Biology. 30 (15), 3063-3064 (2020).</li>
<li>Schauer, A., Pinheiro, D., Hauschild, R., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryonic+explants+undergo+genetically+encoded+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryonic explants undergo genetically encoded self-assembly.</a> eLife. , 55190(2020).</li>
<li>Oppenheimer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+isolated+blastoderms+of+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The development of isolated blastoderms of Fundulus heteroclitus.</a> The Journal of Experimental Zoology. 72 (2), 247-269 (1936).</li>
<li>Trinkaus, J. P., Drake, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+control+of+morphogenesis+in+isolated+Fundulus+blastoderms+by+nutrient+chemical+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Exogenous control of morphogenesis in isolated Fundulus blastoderms by nutrient chemical factors.</a> The Journal of Experimental Zoology. 132 (2), 311-347 (1956).</li>
<li>Grinblat, Y., Lane, M. E., Sagerström, C., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+zebrafish+development+using+explant+culture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of zebrafish development using explant culture assays.</a> Methods in Cell Biology. 59, 127-156 (1999).</li>
<li>Sagerström, C. G., Grinblat, Y., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%3A+an+explant+assay+reveals+inductive+and+suppressive+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in the zebrafish, Danio rerio: an explant assay reveals inductive and suppressive cell interactions.</a> Development. 122 (6), 1873-1883 (1996).</li>
<li>Sagerström, C. G., Gammill, L. S., Veale, R., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+enveloping+layer+and+lack+of+autoneuralization+in+zebrafish+embryonic+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Devolopmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Specification of the enveloping layer and lack of autoneuralization in zebrafish embryonic explants.</a> Devolopmental Dynamics. 232 (1), 85-97 (2005).</li>
<li>Xu, P. F., Houssin, N., Ferri-Lagneau, K. F., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+vertebrate+embryo+from+two+opposing+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Construction of a vertebrate embryo from two opposing morphogen gradients.</a> Science. 344 (6179), 87-89 (2014).</li>
<li>Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+and+planar+cell+polarity+signaling+cooperate+to+regulate+zebrafish+convergence+and+extension+gastrulation+movements%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nodal and planar cell polarity signaling cooperate to regulate zebrafish convergence and extension gastrulation movements.</a> eLife. 9, (2020).</li>
<li>de Olivera-Melo, M., Xu, P. F., Houssin, N., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+ectopic+morphogen+gradients+in+the+Zebrafish+blastula%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of ectopic morphogen gradients in the Zebrafish blastula.</a> Methods in Molecular Biology. 1863, 125-141 (2018).</li>
<li>Sepich, D. S., Calmelet, C., Kiskowski, M., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+convergence+and+extension+movements+of+lateral+mesoderm+during+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Devolopmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Initiation of convergence and extension movements of lateral mesoderm during zebrafish gastrulation.</a> Devolopmental Dynamics. 234 (2), 279-292 (2005).</li>
<li>Gritsman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EGF-CFC+protein+one-eyed+pinhead+is+essential+for+nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The EGF-CFC protein one-eyed pinhead is essential for nodal signaling.</a> Cell. 97 (1), 121-132 (1999).</li>
<li>Feldman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+organizer+development+and+germ-layer+formation+require+nodal-related+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals.</a> Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).</li>
<li>Spemann, H., Manngold, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uber+inducktion+von+embryoalanlangen+durch+implantation+artfremder+organisatoren%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+mikroskopische+Anatomie+und+Entwicklungsmechanik%22%5BJournal%5D)">Uber inducktion von embryoalanlangen durch implantation artfremder organisatoren.</a> Archiv für mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik. 100, 599-638 (1924).</li>
<li>Mangold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Induktionsf%C3%A4higkeit+der+verschiedenen+Bezirke+der+Neurula+von+Urodelen%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Über die Induktionsfähigkeit der verschiedenen Bezirke der Neurula von Urodelen.</a> Naturwissenschaften. 21 (43), 761-766 (1933).</li>
<li>Shih, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+zebrafish+organizer%3A+microsurgical+analysis+at+the+early-shield+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterizing the zebrafish organizer: microsurgical analysis at the early-shield stage.</a> Development. 122 (4), 1313-1322 (1996).</li>
<li>Agathon, A., Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+nature+of+the+zebrafish+tail+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular nature of the zebrafish tail organizer.</a> Nature. 424 (6947), 448-452 (2003).</li>
<li>Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+juxtaposition+between+inducing+chordamesoderm+and+reacting+neuroectoderm+is+a+prerequisite+for+neural+induction+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Close juxtaposition between inducing chordamesoderm and reacting neuroectoderm is a prerequisite for neural induction in Xenopus laevis.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (1), 33-43 (1988).</li>
<li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+lhx1a+transgenic+reporter+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish.</a> The International Journal of Developmental Biology. 54 (4), 731-736 (2010).</li>
<li>Williams, M. L. K., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoderm-independent+role+for+Nodal+signaling+in+convergence+%26+extension+gastrulation+movements%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A mesoderm-independent role for Nodal signaling in convergence & extension gastrulation movements.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Londin, E. R., Niemiec, J., Sirotkin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin%2C+FGF+signaling%2C+and+mesodermal+factors+cooperate+in+zebrafish+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Chordin, FGF signaling, and mesodermal factors cooperate in zebrafish neural induction.</a> Developmental Biology. 279 (1), 1-19 (2005).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li>Veenvliet, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryonic+stem+cells+self-organize+into+trunk-like+structures+with+neural+tube+and+somites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mouse embryonic stem cells self-organize into trunk-like structures with neural tube and somites.</a> Science. 370 (6522), (2020).</li>
<li>Beccari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-axial+self-organization+properties+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+gastruloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cells into gastruloids.</a> Nature. 562 (7726), 272-276 (2018).</li>
<li>Moris, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+early+anteroposterior+organization+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of early anteroposterior organization during human development.</a> Nature. 582 (7812), 410-415 (2020).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+somitogenesis+in+gastruloids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids.</a> Nature. 582 (7812), 405-409 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym artykule opisano, jak generować eksplantaty blastodermy danio pręgowanego i omówiono dwa praktyczne zastosowania tych eksplantatów w rozwiązywaniu roli węzłowej sygnalizacji morfogennej w gastrulacji. Ta metoda cięcia i hodowli eksplantatów zapewnia czystą kartę naiwnych komórek, którymi można manipulować za pomocą zastrzyków RNA i leczenia związkami małocząsteczkowymi w celu zbadania interesującego szlaku molekularnego.
Kroki krytyczne W tym protokole są cztery kroki, które są szczególnie krytyczne dla jego sukcesu. Pierwszym z nich jest wstrzyknięcie do zarodków odpowiedniej ilości węzła chłonnego. Protokół ten zaleca 10 pg ndr2 RNA i chociaż zakres dawek sprzyja przedłużeniu, zbyt duża lub zbyt mała ilość Nodal uniemożliwi optymalne wydłużenie eksplantatu20. Drugim krokiem jest dechorionacja zarodków. Jeśli zarodki pozostaną w pronazie zbyt długo, żółtka pękną, a zarodki nie będą zdolne do cięcia. Jeśli nie znajdują się w pronasie wystarczająco długo, kosmówka nie zostanie rozluźniona przez mycie i zamiast tego będzie wymagała czasochłonnej ręcznej dechorionacji. Trzecim krytycznym krokiem jest wycięcie eksplantatów. Zaleca się wciskanie 3x roztworu Danieau, ponieważ niższa zawartość soli w 0,3x roztworze Danieau lub wodzie jajecznej nie sprzyja gojeniu i przetrwaniu eksplantatów.
Dodatkowo eksplantaty muszą być przycięte mniej więcej w połowie wysokości blastodermy, aby zapewnić naiwność komórek. Jeśli zostaną przecięte zbyt blisko żółtka, będą zawierały sygnały z brzegu (w tym endogennego węzła węzłowego), które sprzyjają specyfikacji tkanek i morfogenezie. Czwartym i ostatnim krytycznym krokiem jest uzdrowienie chimerycznych eksplantatów. Dwa eksplantaty nie połączą się, tworząc chimery, chyba że ich przycięte krawędzie zostaną delikatnie ściśnięte natychmiast po ich przecięciu.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów Krytyczne kroki opisane powyżej dają możliwość rozwiązywania problemów. Poniżej przedstawiono kilka typowych problemów i proponowane rozwiązania.
Jeśli eksplantaty nie rozciągają się w obecności sygnalizacji węzłowej, istnieje kilka możliwych rozwiązań. (A) Wstrzyknąć zarodki w stadium pojedynczej komórki, aby zapewnić równomierne rozproszenie RNA w całym zarodku. (B) Należy unikać wstrzykiwania zbyt dużej ilości węzłowego RNA, upewniając się, że wstrzyknięta objętość jest prawidłowa za pomocą mikrometru do pomiaru bolusa do wstrzykiwania. (C) Unikaj wstrzykiwania zbyt małej ilości węzłowego RNA, mierząc jego stężenie, aby upewnić się, że nie uległ degradacji. (D) Zachowaj kilka nienaruszonych rodzeństwa w tym samym wieku, aby wywnioskować równoważny etap eksplantatów. Eksplantaty osiągają maksymalne wydłużenie, gdy nienaruszone rodzeństwo osiąga stadium 2-5 somitów. Jeśli eksplantaty zostaną zebrane zbyt wcześnie, optymalne przedłużenie nie zostanie osiągnięte.
Jeśli żółtka pękają po dechorionacji, a zarodki nie są zdolne do cięcia, usuń zarodki z roztworu pronazy, gdy kosmówka zacznie się marszczyć, a 1-2 zarodki zrzucą kosmówkę. Następnie natychmiast spłucz w wodzie jajecznej.
Jeśli eksplantaty wydają się bąbelkowe na krawędziach, istnieje kilka rozwiązań. (A) Ścinaj eksplantaty tylko w określonych ramach czasowych rozwoju. Chociaż eksplantaty cięte na dowolnym etapie od 128 do 1000 komórek mogą przetrwać i rozwijać się w hodowli, te cięte w stadiach od 256 do 512 komórek są zwykle najbardziej wytrzymałe. (B) Upewnij się, że eksplantaty są pokrojone w 3x roztworze Danieau, aby zapewnić prawidłowe gojenie. (C) Pokrój eksplantaty czysto, ale delikatnie. Unikaj rozciągania lub rozrywania komórek podczas procesu cięcia.
Jeśli niewstrzyknięte eksplantaty kontrolne rozszerzają się, eksplantaty prawdopodobnie przycinały się zbyt blisko żółtka. Aby eksplantaty były naiwne, upewnij się, że nacięcia są wykonane w połowie odległości między żółtkiem a górną częścią blastodermy.
Jeśli chimeryczne eksplantaty nie zrośnią się, jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że eksplantaty w roztworze 3x Danieau po przecięciu mają tendencję do zaokrąglania i gojenia się na krawędzi cięcia. Aby upewnić się, że dwie blastodermy goją się do siebie, a nie do siebie, ściśnij je razem natychmiast po przecięciu. Użyj kleszczy, aby delikatnie wywrzeć nacisk na nowo połączone blastodermy w studni agarozy, aby zachęcić je do wspólnego gojenia.
Ograniczenia Chociaż te eksplantaty są cennym narzędziem do badania roli danego morfogenu (lub innej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania) we względnej izolacji, obserwacje dokonane w dowolnym modelu ex vivo muszą być interpretowane z ostrożnością. Eksplantaty wykazują morfogenezę C&E, która jest bardzo podobna do tej obserwowanej in vivo20, ale nie podsumowują wszystkich aspektów gastrulacji, na przykład ruchów epibolicznych. Brakuje im również wielu innych czynników regulacyjnych i cząsteczek sygnałowych, które są obecne w nienaruszonym zarodku. Chociaż jest to znacząca zaleta eksperymentalna eksplantatów, może również prowadzić do wniosków, które nie są prawdziwe in vivo. Na przykład, ponieważ eksplantaty, które nie otrzymują egzogennych ligandów węzłowych, nie wykazują ekspresji markerów neuroektodermy, można wywnioskować z samych eksplantatów, że sygnalizacja węzłowa jest wymagana do specyfikacji neuroektodermy. Jednak neuroektoderma powstaje w nienaruszonych zarodkach pozbawionych wszystkich sygnałów węzłowych23,24, co wskazuje na istotną rolę innych cząsteczek sygnałowych w specyfikacji neuronalnej32. Eksplantaty mogą nam powiedzieć, do czego zdolny jest morfogen w odizolowanym środowisku. Mimo to wszystkie takie wyniki powinny zostać potwierdzone lub porównane z nienaruszonymi zarodkami, aby wyniki mogły być dokładnie zinterpretowane. Innymi słowy, eksplantaty nie mogą zastąpić rozwijającego się zarodka. Zamiast tego są dodatkowym narzędziem do identyfikacji roli i związku morfogenu z otoczeniem. Mając na uwadze te ograniczenia, eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są cennym narzędziem dla wielu pytań badawczych.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod Wraz z ponownym zainteresowaniem embriologią syntetyczną, regularnie stosuje się kilka podejść ex vivo i in vitro do modelowania aspektów rozwoju embrionalnego. Na przykład, 2- i 3-wymiarowe gastruloidy złożone z mysich lub ludzkich embrionalnych / indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych można nakłonić, poprzez zastosowanie egzogennych cząsteczek sygnałowych, do podsumowania niektórych wzorców i / lub zdarzeń morfogenetycznych gastrulacji, segmentacji i neurulacji 33,34,35,36,37 . Chociaż metody te są skuteczne, wymagają pracochłonnych i długotrwałych metod hodowli, zarówno w celu ciągłego utrzymywania pluripotencjalnych komórek macierzystych, jak i hodowania gastruloidów, które potrzebują wielu dni, aby osiągnąć stadium gastrulacji. Natomiast eksplantaty danio pręgowanego nie wymagają utrzymywania kultur komórek macierzystych, ponieważ zarodki są po prostu pobierane w razie potrzeby. Są stosunkowo łatwe do wygenerowania i osiągają stadium gastrulacji w ciągu kilku godzin, tak samo jak zarodki danio pręgowanego. Podkreśla to kolejną zaletę eksplantatów danio pręgowanego, ich nienaruszony zegar rozwojowy. Ponieważ wiek rozwojowy embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych może być zmienny i wysoce dyskusyjny, embrionalne eksplantaty są być może lepiej przystosowane do badania czasowej regulacji rozwoju. Wreszcie, podczas gdy eksplantaty peskoidów danio pręgowanego (które zawierają margines embrionalny) podobnie rozciągają się w hodowli12,13, robią to w odpowiedzi na endogenne centra sygnalizacyjne. Zamiast tego, opisane tutaj eksplantaty umożliwiają naukowcom badanie interesujących cząsteczek przy stosunkowo niewielkiej interferencji ze strony takich sygnałów embrionalnych.
Potencjalne przyszłe zastosowania W tym przypadku zastosowano eksplantaty, aby wykazać, że sygnalizacja węzłowa jest niezbędna i wystarczająca do morfogenezy C&E. Mimo to przewiduje się, że mogą one być i będą wykorzystywane do rozpoznawania roli wielu różnych cząsteczek w wielu innych procesach rozwojowych, na przykład w regulacji ekspresji genów, gradientach sygnałowych i dodatkowych programach morfogenetycznych. Dodatkowo, ponieważ te eksplantaty są żywotne do co najmniej 24 hpf19, można oczekiwać, że ich użyteczność wykracznie poza gastrulację i obejmie procesy takie jak segmentacja i organogeneza, każdy proces, w którym naukowcy pragną rozwojowej czystej karty.

Odwiecznym celem dziedziny biologii rozwojowej jest rozwikłanie zawiłości rozwijających się embrionów, aby zrozumieć pochodzenie formy i funkcji zwierząt. Nawet wczesne embriony zawierają złożoną mieszaninę cząsteczek sygnałowych, interakcji komórkowych i tkankowych oraz sił mechanicznych, z których wszystkie podlegają ścisłej regulacji przestrzennej i czasowej. Z tego powodu często trudno jest określić dokładną rolę danego sygnału w interesującym nas procesie rozwojowym. Usuwając tkanki embrionalne z ich endogennego środowiska, eksplantacja zarodków tworzy uproszczoną platformę, na której można dostrzec role rozwojowe poszczególnych tkanek i cząsteczek we względnej izolacji. Techniki eksplantacji są prawdopodobnie najbardziej znane w Xenopus laevis, gdzie były używane do badania między innymi indukcji tkanek, sygnalizacji komórkowej, adhezji komórek i morfogenezy1,2,3,4. Tak zwane eksplantaty czapek zwierzęcych, w których region zwierzęcy zarodków Xenopus w stadium blastuli jest izolowany przed interakcjami indukcyjnymi5,6,7, są szeroko rozpowszechnioną i potężną techniką eksplantacji. Niezmanipulowane czapki zwierzęce są skazane na stanie się ektodermą7,8. Mimo to są w stanie reagować na kilka czynników indukcyjnych, co pozwala im tworzyć tkanki ze wszystkich trzech listków zarodkowych i przechodzić odpowiednie dla tkanek ruchy morfogenetyczne9,10,11. Jednak ograniczone narzędzia genetyczne i nieoptymalna przydatność do obrazowania na żywo uniemożliwiają wielu biologom rozwojowym stosowanie eksplantatów z kapelusza zwierzęcego Xenopus. Eksplantując komórki blastodermy z zarodków danio pręgowanego, naukowcy mogą połączyć użyteczność testu kapelusza zwierzęcego z przejrzystością optyczną, obfitością narzędzi genetycznych i innymi eksperymentalnymi zaletami systemu modelowego danio pręgowanego.
Do tej pory badacze korzystali z dwóch smaków eksplantatów danio pręgowanego: tak zwanych peskoidów i eksplantatów blastodermy. W modelu peskoidowym cała blastoderma, w tym strefa brzeżna, jest izolowana od żółtka i pozwala się jej rozwijać ex vivo bez pozazarodkowej warstwy syncytialnej żółtka (YSL)12,13. W ten sposób peskoidy wykazują znaczne podobieństwo do eksplantatów Fundulus wygenerowanych kilkadziesiąt lat temu przez Jane Oppenheimer i J.P. Trinkaus14,15. Te eksplantaty podsumowują wiele aspektów wzorców embrionalnych i morfogenezy12,13. Ponieważ jednak izolaty te zawierają endogenne centra sygnalizacyjne (margines embrionalny), nie są one uproszczone pod względem ich środowiska molekularnego. Alternatywnie, badacze mogą wygenerować stosunkowo naiwne eksplantaty blastodermy danio pręgowanego, wykluczając strefę marginalną16,17,18,19,20,21. Niemanipulowane eksplantaty blastodermy danio pręgowanego wykazują wysoki poziom morfogenów białka morfogenetycznego kości (BMP)19 i powodują powstawanie nieneuronalnej ektodermy i warstwy otaczającej (EVL), gdy są hodowane ex vivo18. Przypominają jednak wiele aspektów wzorca osiowego i morfogenezy w odpowiedzi na egzogenne gradienty sygnalizacji19,20,21, podobnie jak czapki zwierzęce Xenopus. Z tego powodu eksplantaty blastodermy są korzystnym modelem do badania roli danego morfogenu (lub morfogenów) w specyfikacji listka zarodkowego, morfogenetycznych ruchach komórek i gradientach sygnałowych w uproszczonym środowisku sygnalizacyjnym. Co więcej, blastodermy z zarodków o różnych genotypach lub stanach mogą być łączone w jeden chimeryczny eksplantat 19,21 w celu zbadania autonomii komórek/tkanek i interakcji indukcyjnych.
Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego mogą być używane do badania roli sygnałów embrionalnych (na przykład węzłowych) w morfogenezie i specyfikacji tkanek podczas gastrulacji. Poprzez wstrzyknięcie syntetycznego RNA ndr2 (kodującego ligand węzłowy) na etapie pojedynczej komórki, sygnalizacja węzłowa jest aktywowana w całej blastodermie zarodka. Eksplantaty z tych zarodków generują gradienty sygnalizacji węzłowej, tworzą wszystkie trzy listki zarodkowe i przechodzą ruchy gastrulacyjne konwergencji i wydłużenia (C&E), jak widać w nienaruszonych zarodkach20. Dodatkowo, chimeryczne eksplantaty są używane do zilustrowania zdolności tkanek mezodermy do indukowania neuroektodermy z niewstrzykniętej (naiwnej) blastodermy. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące tworzenia eksplantatów blastodermy danio pręgowanego i demonstruje ich przydatność w określaniu roli sygnalizacji węzłowej w indukcji i morfogenezie tkanek.

<table><tbody><tr><td>Koraliki szklane 1 mm</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Z250473</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Fisher</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 .4H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12364-36</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze zegarmistrzowskie</td><td>World Precision Instruments</td><td>500341</td><td></td></tr><tr><td>Forma do iniekcji zarodków</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynia krystalizujące</td><td>Fisher</td><td>08-741A Szklane</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-748A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>JT4018-1</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Sols</td><td>Instant</td><td>Ocean SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator niskotemperaturowy</td><td>Fisher</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometr</td><td>SPI dostarcza</td><td>02265-AB</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>VWR</td><td>MK635704</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>BDH9286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla noworodków</td><td>Invitrogen</td><td>26010-066</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Wtryskiwacz pneumatyczny Pico-pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Pompa pipetowa</td><td>Fisher</td><td>13 683C</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego 100 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego 60 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe butelki do mycia</td><td>Fisher</td><td>03-409-10E</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>200002-836</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Ze względu na ich przejrzystość optyczną i szybki rozwój, embriony danio pręgowanego są doskonałym systemem do badania zachowań komórek i procesów rozwojowych. Jednak ze względu na złożoność i redundancję sygnałów embrionalnych, może być trudno dostrzec pełną rolę każdego pojedynczego sygnału we wczesnej embriogenezie. Poprzez eksplantację regionu zwierzęcego blastodermy danio pręgowanego powstają stosunkowo naiwne skupiska komórek embrionalnych, które można łatwo hodować i manipulować nimi ex vivo. Wprowadzając interesujący nas gen poprzez wstrzyknięcie RNA przed eksplantacją, można ocenić wpływ tej cząsteczki na ekspresję genów, zachowania komórek i inne procesy rozwojowe we względnej izolacji. Co więcej, komórki z zarodków o różnych genotypach lub stanach mogą być łączone w jednym chimerycznym eksplantacie w celu zbadania interakcji komórka/tkanka i funkcji genów specyficznych dla tkanki. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące generowania eksplantatów blastodermy danio pręgowanego i pokazuje, że pojedyncza cząsteczka sygnałowa - ligand węzłowy - jest wystarczająca do indukowania tworzenia listka zarodkowego i morfogenezy wydłużania w skądinąd naiwnych tkankach embrionalnych. Ze względu na ich zdolność do rekapitulacji zachowań komórek embrionalnych, gradientów morfogenu i wzorców ekspresji genów w uproszczonym systemie ex vivo, oczekuje się, że te eksplantaty będą bardzo przydatne dla wielu badaczy danio pręgowanego.

Ligandy Nodal sterują formowaniem warstw zarodkowych i C&amp;Ekstrakty blastodermy zarodka ryby danio pręgowanej 
Eksplanty kontrolne wycięte z nieiniekcyjnych embrionów typu dzikiego (WT) lub z embrionów iniekcyjnych z 50 pg mRNA kodującego zielone białko fluorescencyjne (GFP) zachowały okrągły kształt przez cały okres hodowli (Rysunek 2A-C) i nie wykazywały ekspresji markerów mezodermy, endodermy ani neuroektodermy (Rycina 3C)20Razem wskazują one na brak morfogenezy oraz tworzenia się listków zarodkowych, które charakteryzują gastrulację kręgowców. Jednakże eksplanty wycięte z embrionów wstrzykniętych 10 pg ndr2 mRNA uległo znacznemu wydłużeniu po 8–9 h hodowli (Rycina 2D). Obrazowanie poklatkowe tych eksplantatów w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem mikroskopii kontrastowej interferencyjnej (DIC) wykazało, że wydłużanie rozpoczyna się około 8 godziny po zapłodnieniu (hpf) (Rysunek 2F), w tym samym czasie, w którym C&amp;Morfogeneza E rozpoczyna się w nienaruszonych embrionach danio pręgowanego22Eksplanty wycięte z MZoepembriony -/-, którym brakuje niezbędnego tdgf1 Koreceptor Nodal23, nie uległy wydłużeniu w odpowiedzi na ndr2 wstrzyknięcie (Rysunek 2E), co wykazuje, że aktywność Nodal jest kluczowa dla tego procesu ex vivo morfogeneza. Ponadto, w preparatach całych (whole-mount) in situ hybrydyzacja dodatkowo wykazała, że ndr2eksplantaty wykazujące ekspresję [genu/białka] wykazują markery neuroektodermy (sox2) oraz kilka podtypów mezodermy (tbxta, noto, tbx16) (Rysunek 2G), a także endodermę i organizator embrionalny20.
Sygnalizacja Nodal nie jest wymagana do indukcji neuroektodermy przez mezodermę 
Aktywność sygnalizacji Nodal jest niezbędna do indukcji endodermy i większości mezodermy, lecz jest zbędna dla specyfikacji neuroektodermy w gastrulach danio pręgowanego23,24. Podczas gdy nie wstrzyknięte eksplanty blastodermy danio pręgowanego nie różnicowały się w neuroektodermę (Rycina 3C18), eksplanty z embrionów, do których wstrzyknięto 10 pg ndr2, wykazały silną ekspresję markera neuroektodermy sox2 w postaci wyraźnych pasów wzdłuż długiej osi eksplantu (Rycina 2G), co wskazuje, że aktywność Nodal jest wymagana do tworzenia neuroektodermy ex vivo. Od dawna wiadomo, że tkanki mezodermalne mogą indukować tkankę nerwową25,26,27,28,29, w tym w eksplantach blastodermy danio pręgowanego17. Nie jest jednak jasne, czy tworzenie neuroektodermy w tym systemie eksplantów wymaga bezpośrednio sygnalizacji Nodal, czy też egzogenne ligandy Nodal indukują mezodermę, która następnie wtórnie indukuje tkanki nerwowe.
Tworzono chimeryczne eksplanty zawierające fragmenty potencjalnej mezodermy i neuroektodermy pochodzące z dwóch różnych embrionów, aby sprawdzić, czy sygnalizacja Nodal jest wymagana w sposób autonomiczny dla tkanki w celu specyfikacji neuroektodermy ex vivo. Fragment mezodermy każdego eksplantu wycinano z embrionu WT, który wyrażał specyficzny dla mezodermy transgeniczny reporter GFP, Tg[lhx1a:eGFP]30, i który został wstrzyknięty wysoką dawką (100 pg) ndr2 (Rysunek 3A). Domniemany fragment neuroektodermy każdego eksplantu wycinano albo z kontrolnego embrionu WT, albo z embrionu MZoep-/- z niedoborem sygnalizacji Nodal, wstrzykniętego jedynie mRNA kodującym fluorescencyjny marker jądrowy H2B-RFP (Rysunek 3A). Każdy chimeryczny eksplant tworzono poprzez połączenie blastodermy z każdego z tych dwóch warunków, a następnie analizowano ekspresję markerów specyficznych dla tkanki za pomocą hybrydyzacji in situ całego preparatu w 12 hpf.
Większość eksplantów z pojedynczych embrionów wstrzykniętych z 100 pg ndr2 wykazywała niewielką lub żadną ekspresję sox2 oraz wykazywała ekspresję markerów mezodermy, w tym tbxta i reportera lhx1a:gfp w całym eksplancie (Rysunek 3B,G). Niewstrzyknięta blastodermy WT (typu stanowiącego przyszłą część neuroektodermy eksplantów chimerycznych) nie wykazywała ekspresji ani markerów mezodermy, ani sox2 podczas hodowli jako pojedynczy eksplant, co wskazywało na brak specyfikacji neuroektodermy i mezodermy (Rysunek 3C,H). Eksplanty z pojedynczych embrionów MZoep-/- w podobny sposób wykazywały brak ekspresji markerów zarówno neuroektodermy, jak i mezodermy, nawet po wstrzyknięciu ndr2 (Rysunek 3D). Jednakże, gdy niewstrzyknięte blastodermy WT połączono z mezodermą indukowaną wysokimi dawkami ligandów Nodal, te chimeryczne eksplanty silnie eksponowały zarówno markery mezodermy, jak i sox2 (Rysunek 3E,I). Wyniki te wykazują, że – jak zaobserwowano wcześniej17,26,27,29 – mezoderma może indukować losy neuronalne w komórkach, które w przeciwnym razie stałyby się nie-neuronalną ektodermą. Aby sprawdzić, czy sygnalizacja Nodal jest wymagana bezpośrednio w części przyszłej neuroektodermy tych eksplantów do ich indukcji neuronalnej, utworzono eksplanty chimeryczne z blastoderm WT wstrzykniętych z 100 pg ndr2 oraz blastoderm z embrionów MZoep-/- (Rysunek 3J). Pomimo niezdolności do odbierania sygnałów Nodal z sąsiedniej części mezodermalnej, eksplanty te wykazywały ekspresję sox2 na podobnym poziomie co chimery kontrolne WT (Rysunek 3F). Wynik ten pokazuje, że zgodnie z sytuacją w nienaruszonych embrionach, w których tkanki neuronalne są specyfikowane przy braku aktywności Nodal, sygnalizacja Nodal nie jest wymagana autonomicznie tkankowo do indukcji neuroektodermy ex vivo.
<img alt="Proces endocytozy komórkowej; schemat ilustrujący etapy tworzenia i odrywania się pęcherzyka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Procedura eksplantacji blastodermy ryby danio-ostreconoskiej (krok 4.3). (A) Trzymając pęsetę w niedominującej ręce (pomarańczowa), dociśnij ją do żółtka, aby ustabilizować embrion, jednocześnie chwytając blastodermę na wysokości około ½ jej wysokości za pomocą pęsety w dominującej ręce (niebieska). (B) Przesuń pomarańczową pęsetę wzdłuż krawędzi niebieskiej pęsety trzymającej embrion, aby przeciąć blastodermę tak, by pierwsze cięcie sięgało mniej więcej do połowy szerokości blastodermy. (C) Obróć embrion o 90°, następnie umieść niebieską pęsetę wewnątrz (ale prostopadle do) pierwotnego cięcia i zaciśnij, aby oddzielić pozostałą część blastodermy. (D) Pozostaw eksplantowane komórki blastodermy do regeneracji w 3x roztworze Danieau przez około 5 min przed przeniesieniem do pożywki dla eksplantów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat embriogenezy danio pręgowanego; proces ekspresji mRNA ndr2; stadia rozwojowe i markery genowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 (zmodyfikowana na podstawie20): Ligandy Nodal promują morfogenezę C&amp;E oraz tworzenie warstw zarodkowych w eksplantach blastodermy danio pręgowanego. (A) Schemat wstrzykiwania i eksplantacji embrionów danio pręgowanego. (B-E) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu żywych eksplantów blastodermy dla wskazanych warunków/genotypów w odpowiednim stadium 2-4 somytów. N = liczba eksplantów z dwóch do czterech niezależnych prób. (F) Seria obrazów DIC time-lapse reprezentatywnego eksplantu z embrionu WT, do którego wstrzyknięto 10 pg RNA ndr2. (G) Reprezentatywne obrazy hybrydyzacji in situ całego preparatu dla wskazanych transkryptów w eksplantach z embrionów WT wstrzykniętych 10 pg RNA ndr2. Paski skali wynoszą 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat chimerycznych eksplantów; oddziaływanie mezodermy i neuroektodermy, efekt ndr2, markery GFP/RFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62797/62797fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3 (Zmodyfikowano na podstawie31): Chimeryczne eksplanty ujawniają, że specyfikacja neuroektodermy nie wymaga tkankowo-autonomicznego sygnalizowania Nodal ex vivo. (A) Schemat procedury generowania chimerycznych eksplantów ryb zebrafish. (B-F) Hybrydyzacja in situ całego preparatu dla markera mezodermy tbxta (góra) oraz markera neuroektodermy sox2 (dół) w eksplantach z embrionów WT wstrzykniętych z 100 pg RNA ndr2 (B), niewstrzykniętych kontroli WT (C), MZoep-/- wstrzykniętych z 10 pg ndr2 (D) oraz eksplantów chimerycznych zawierających części neuroektodermy z embrionów WT (E) lub MZoep-/- (F) na etapie odpowiadającym stadium 2-4 somytów. Ułamki wskazują liczbę eksplantów z przedstawionym fenotypem w stosunku do całkowitej liczby badanych eksplantów. (G-J) Reprezentatywne obrazy żywych eksplantów Tg[lhx1a:gfp] z jednego embrionu (G-H) lub połączonych z blastodermami ekspresującymi H2B (I-J, kolor magenta) w warunkach wskazanych na etapie odpowiadającym stadium 2-4 somytów. N = liczba eksplantów z trzech niezależnych prób. Paski skali wynoszą 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62797/62797fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Roztwór 1</td>
			<td >Roztwór 2</td>
			<td >Roztwór 3</td>
			<td >Roztwór 4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór</td >
			<td >3x Danieau's</td >
			<td >Woda z jaj</td >
			<td >Pożywka dla eksplantów</td >
			<td >0.3x Danieau's</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Składniki</td >
			<td >174 mM NaCl</td >
			<td >60 µg/mL soli morskich</td >
			<td >DMEM/F12 + 2.5 mM L-Glutaminy i 15 mM HEPES</td >
			<td >17.4 mM NaCl</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >2.1 mM KCl</td >
			<td >1 L wody destylowanej</td >
			<td >3% całkowitej objętości surowicy z noworodka cielęcia lub płodowej surowicy bydlęcej</td >
			<td >0.21 mM KCl</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >1.2 mM MgSO4.7H2O</td >
			<td ></td>
			<td >1:200 Penicylina (50 jednostek/mL)-Streptomycyna (50 µg/mL)</td >
			<td >0.12 mM MgSO4•7H2O</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >1.8 mM Ca(NO3)2 •4H2O</td >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >0.18 mM Ca(NO3)2 •4H2O</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >15 mM HEPES</td >
			<td ></td>
			<td >Przykład:</td >
			<td >1.5 mM HEPES</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td >Woda destylowana</td >
			<td ></td>
			<td >4 mL/warunek x 9 warunków = 36 mL</td >
			<td >Woda destylowana</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >1.08 mL surowicy z noworodka cielęcia (NCS, alikwoty w -20 °C (3%))</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >0.18 mL 200x Pen-Strep (PS, alikwoty w -20 °C) (1:200)</td >
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td >35 mL DMEM/F12</td >
			<td ></td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1.

Eksplantaty blastodermy danio pręgowanego są generowane przez izolowanie komórek embrionalnych od endogennych centrów sygnalizacyjnych we wczesnym zarodku, tworząc stosunkowo naiwne klastry komórek, które łatwo manipulować i hodować ex vivo. Ten artykuł zawiera instrukcje dotyczące tworzenia takich eksplantatów i demonstruje ich użyteczność, pytając o role sygnalizacji węzłowej podczas gastrulacji.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Nawet bardzo wczesne zarodki zawierają wiele różnych cząsteczek sygnałowych, co może utrudniać rozpoznanie pełnej funkcji każdego pojedynczego sygnału embrionalnego. Izolując komórki od endogennych centrów sygnalizacyjnych, eksplantaty te umożliwiają naukowcom zbadanie roli danej cząsteczki sygnałowej we względnej izolacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie podsumować czas embrionalny, ruchy komórek i wzorce ekspresji genów w uproszczonym systemie ex-vivo bez czasu i wysiłku wymaganego do utrzymania komórek macierzystych w hodowli.Zacznij od wycięcia eksplantatów z niezakażonych zarodków. Jeśli eksplantaty przedłużają kulturę, oznacza to, że cięcie zostało wykonane tak, aby zbliżyć się do żółtka. Zacznij od wypełnienia wyciągniętej szklanej igły kapilarnej RNA.Umieść napełnioną igłę w mikromanipulatorze i złamij końcówkę igły kleszkami. Skalibruj objętość wtrysku za pomocą mikrometru stopniowego z kroplą oleju mineralnego, dostosowując czas wtrysku i ciśnienie na wtryskiwaczu pneumatycznym, aby uzyskać bolus o pożądanej wielkości. Końcówkę igły RNA należy przechowywać zanurzoną w oleju, aż będzie gotowa do wstrzyknięcia.Załadować zarodki do płytki iniekcyjnej za pomocą pipety Pasteura i pompki do pipet, a następnie delikatnie wcisnąć jaja do koryt palcem w rękawiczce. Wstrzyknąć 10 pikogramów RNA ndr2 do żółtka zarodków jednokomórkowych, aż do osiągnięcia pożądanej liczby zarodków lub do momentu, gdy zarodki zaczną się dzielić. Użyć delikatnego strumienia wody jajecznej z wyciskanej butelki, aby wypłukać zarodki z płytki do wstrzykiwań na oznakowaną szalkę Petriego.Umieść zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aż osiągną stadium 128 komórek. Usuń niezapłodnione jaja i martwe zarodki z naczynia. Gdy zarodki osiągną stadium 128 komórek, umieść je na oznaczonych szklanych szalkach Petriego i zlej z nich jak najwięcej wody z jaj.Oznacz szklane naczynia krystalizujące taśmą laboratoryjną odpowiadającą nazwom małych naczyń i napełnij dwie trzecie drogi wodą jajeczną. Umieść te naczynia obok mikroskopu preparacyjnego, aby mieć do nich szybki dostęp. Dodaj jeden mililitr 20 miligramów na mililitr bulionu pronazy, rozmrożonego na lodzie do 15 mililitrów roztworu 3X Danieau w 50-mililitrowej stożkowej probówce.Dodać co najmniej pięć mililitrów roztworu pronazy do każdej szklanej szalki Petriego zawierającej zarodki. Mieszaj szklane naczynia okrężnymi ruchami, konsekwentnie monitorując postęp dechorionacji pod mikroskopem preparacyjnym. Gdy kosmówka zacznie się marszczyć i jeden lub dwa zarodki wypadną z kosmówki, ostrożnie zanurz szklaną szalkę Petriego zawierającą pronazę i zarodki do odpowiedniego szklanego naczynia krystalizującego zawierającego wodę jajeczną.Umyj zarodki dechorionacji trzykrotnie wodą z jajkiem i zdekantuj wodę z jajka z naczynia. Wykonaj trzecie i ostatnie pranie 0,3X roztworem Danieau. Przykryj odkorzoniowane zarodki pokrywką na szalce Petriego i umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza, aż osiągną stadium 256 komórek.Napełnij szalkę Petriego pokrytą agarozą 3X roztworem Danieau. Gdy zarodki znajdą się w stadium 256 komórek, przenieś je na płytkę pokrytą agarozą zawierającą 3X roztwór Danieau, ustawiając je wzdłuż środka naczynia. Użyj jednej pary kleszczy, trzymanych zaciśniętych, aby ustabilizować zarodek, a drugiej użyj do przecięcia blastodermy.Aby przeciąć, delikatnie ściśnij komórki blastodermy jedną parą kleszczy, a następnie weź kleszcze stabilizujące i przesuń je wzdłuż drugich kleszczy, aby przeciąć mniej więcej do połowy blastodermy. Obróć zarodek, umieszczając kleszcze w istniejącym nacięciu, a następnie odetnij pozostałą blastodermę prostopadle do pierwszego cięcia. Trzymaj eksplantaty w roztworze 3X Danieau przez co najmniej pięć minut, aby się zagoiły, a następnie przenieś je do studzienki pokrytej agarozą sześciodołkowej płytki wypełnionej czterema mililitrami pożywki eksplantacyjnej.Umieść płytki z kulturami eksplantatów w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aż do osiągnięcia żądanego punktu czasowego lub etapu. Aby pokroić chimeryczne eksplantaty, użyj naczynia z agarozą uformowanego w 12 małych płytkich studzienkach za pomocą szklanych koralików o średnicy jednego milimetra. Napełnij płytkę 3X roztworem Danieau.Przygotować poprzez dodanie 12 zarodków jednego genotypu lub stanu po lewej stronie płytki, a 12 zarodków o innym genotypie jest kondycjonowanych po prawej stronie płytki. Przenieś po jednym zarodku z każdego stanu na środek płytki w pobliżu jednego z 12 dołków. Za pomocą kleszczy wytnij eksplant z każdego zarodka, jak opisano dla eksplantatów z pojedynczych zarodków.Szybko ściśnij przycięte krawędzie dwóch eksplantatów do siebie w płytkiej studni za pomocą kleszczy, aby obie połówki zagoiły się razem w jeden eksplant. Kontynuuj z pozostałymi 12 dołkami w płytce. Po zagojeniu eksplantatów przenieś je do studzienki pokrytej agarozą na sześciodołkowej płytce wypełnionej czterema mililitrami pożywki z eksplantatu.Powtarzaj, aż zostanie osiągnięta pożądana liczba eksplantatów. Hodowla eksplantuje się w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aż nienaruszone zarodki rodzeństwa osiągną pożądany etap. Eksplantaty kontrolne wycięte z niezakażonych zarodków typu dzikiego lub te, którym wstrzyknięto 50 pikogramów mRNA kodującego zielone białko fluorescencyjne, pozostały zaokrąglone przez cały okres hodowli i nie wykazywały ekspresji markerów mezodermy, endodermy lub neuroektodermy.Eksplantaty wycięte z zarodków, którym wstrzyknięto 10 pikogramów mRNA ndr2, stały się bardzo wydłużone po ośmiu do dziewięciu godzinach w hodowli. Obrazowanie poklatkowe na żywo tych eksplantatów za pomocą różnicowej interferującej mikroskopii kontrastowej wykazało, że wydłużenie rozpoczyna się około ośmiu godzin po zapłodnieniu. Eksplantaty z zarodków, którym wstrzyknięto 10 pikogramów ndr2, wykazywały silną ekspresję markerów mezodermy, tbxta, noto, tbx16 i markera neuroektodermy sox2.Bardzo ważne jest, aby przyciąć eksplantaty znacznie powyżej brzegu zarodka. W przeciwnym razie eksplantaty będą zawierały endogenne sygnały z marginesu i nie będą naiwne. W tej metodzie wykorzystano eksplantaty, aby zająć się rolą sygnalizacji węzłowej w morfogenezie gastrulacji.W przyszłości inni badacze mogą wykorzystać to podejście do testowania roli dodatkowych cząsteczek sygnałowych, na przykład w dowolnej liczbie procesów rozwojowych.

generation-of-nave-blastoderm-explants-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przewodnik krok po kroku po generowaniu ukierunkowanych chimerycznych zarodków danio przewrotnego poprzez transplantację w stadium blastuli lub gastruli.

Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Naucz się tworzenia naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków Danio rerio w celu badania sygnałowania Nodal podczas gastrulacji. Ta metoda umożliwia analizę ruchów komórkowych i ekspresji genów w uproszczonym systemie pozaustrojowym.

Wytwarzanie naiwnych eksplantatów blastodermy z zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów