Zautomatyzowana hodowla mikroorganizmów i ewolucja adaptacyjna z wykorzystaniem systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów (MMC)
February 18th, 2022
Ten protokół opisuje, jak używać systemu mikrobiologicznej hodowli mikrokropel (MMC) do prowadzenia zautomatyzowanej hodowli mikrobiologicznej i adaptacyjnej ewolucji. MMC może hodować i podkulminować mikroorganizmy automatycznie i w sposób ciągły oraz monitorować online ich wzrost ze stosunkowo wysoką przepustowością i dobrą równoległością, zmniejszając zużycie pracy i odczynników.
Ta metoda może pomóc rozwiązać problemy związane z konwencjonalnymi metodami uprawy mikrobiologicznej. Stanowi tanią, łatwą w obsłudze i niezawodną platformę eksperymentalną do zautomatyzowanej hodowli drobnoustrojów i ewolucji adaptacyjnej. Technologia ta automatyzuje operacje i znacznie zmniejsza pracochłonność.
A jednocześnie ma dobrą wydajność kultury z wiarygodnymi wynikami i prostymi operacjami. Technologia ta jest stosowana głównie w dziedzinach badań mikrobiologicznych, takich jak pomiar krzywej wzrostu, adaptacyjna ewolucja laboratoriów i jednoczynnikowa analiza wielopoziomowa. Przygotowania do eksperymentu należy rozpocząć od połączenia igły strzykawki o średnicy wewnętrznej 0,41 milimetra i średnicy zewnętrznej 0,71 milimetra do szybkozłączki A i butelki z odczynnikiem.
Następnie autoklaw całego sprzętu w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Aby zainstalować chip mikroprzepływowy, otwórz drzwi komory operacyjnej i podnieś sondę światłowodową. Po wyrównaniu otworów pola elektrycznego z igłami, delikatnie umieść chip na cokole chipa, a następnie włóż dwie kolumny pozycjonujące do otworów pozycjonujących i odłóż sondę światłowodową.
Następnie podłącz szybkozłączkę A na chipie do odpowiedniego portu systemu hodowli mikrokropelek drobnoustrojów lub MMC zgodnie z numerem pozycji opisanym w manuskrypcie. Po zakończeniu zamknij drzwi komory operacyjnej. Rozcieńczyć hodowlaną zawiesinę Escherichia coli MG1655 z pożywką do OD600 0,05 do 0,1, aby uzyskać 10 mililitrów początkowego roztworu bakterii.
Aby zainicjować program MMC, kliknij kartę Inicjalizacja. Gdy pojawi się interfejs inicjalizacji, ustaw temperaturę uprawy na 37 stopni Celsjusza, a wartość sygnału fotoelektrycznego na 0,6. Inicjalizacja zajmie około 20 minut.
Później umieść wysterylizowaną butelkę z odczynnikiem na czystej ławce i dokręć nakrętkę. Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, aby wstrzyknąć od trzech do pięciu mililitrów oleju MMC z igły strzykawki do bocznej rurki do butelki z odczynnikiem. Następnie powoli przechylaj i obracaj butelkę z odczynnikiem, aby olej w pełni przeniknął do wewnętrznej ścianki.
Po wstrzyknięciu pięciu mililitrów początkowego roztworu bakteryjnego do butelki, napełnij butelkę z odczynnikiem, wstrzykując od pięciu do siedmiu mililitrów oleju MMC. Wyciągnij niezależne szybkozłącze A z butelki z odczynnikiem i włóż szybkozłącze A do szybkozłącza B butelki, aby zakończyć operację wstrzykiwania próbki. Po zakończeniu otwórz drzwi komory operacyjnej, aby włożyć butelkę z odczynnikiem do metalowej kąpieli.
Wyciągnij złącze C2 chipa i szybkozłącze A butelki z odczynnikiem. Podłącz boczne złącze rurki butelki z odczynnikiem do złącza C2, a złącze górnej rurki do złącza O2. Następnie zamknij drzwi komory operacyjnej.
Aby wybrać funkcję pomiaru krzywej wzrostu, kliknij Krzywa wzrostu w interfejsie ustawiania parametrów wprowadź liczbę jako 15. Następnie włącz przełącznik wykrywania OD i ustaw długość fali na 600 nanometrów. Kliknij kartę Start, aby rozpocząć generowanie kropel.
Proces zajmie 15 minut. Gdy na głównym interfejsie pojawi się wyskakujące okienko z komunikatem, otwórz drzwi komory operacyjnej, aby wyjąć butelkę z odczynnikiem i podłączyć złącza C2 i O2. Po zamknięciu drzwi kliknij przycisk OK w wyskakującym okienku, aby automatycznie wyhodować kropelki i wykryć wartości OD.
Gdy krzywa wzrostu osiągnie fazę stacjonarną, kliknij przycisk Eksport danych, aby wyeksportować dane OD. Wybierz ścieżkę zapisu danych i wyeksportuj wartość OD zarejestrowaną w okresie uprawy w formacie CVS Aby wykreślić krzywą wzrostu, użyj oprogramowania do mapowania, takiego jak Excel i Origin 9.0. Wstrzyknąć wymagane objętości początkowego roztworu bakterii, świeżej pożywki i oleju MMC do oddzielnych wysterylizowanych butelek z odczynnikiem dla początkowego roztworu bakterii w świeżej pożywce, jak wyjaśniono wcześniej.
Aby wybrać funkcję ewolucji adaptacyjnej, kliknij ALE w oprogramowaniu. W interfejsie ustawiania parametrów włącz przełącznik wykrywania OD, a następnie ustaw wszystkie parametry opisane w manuskrypcie i naciśnij zakładkę Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Proces zajmie około 25 minut.
Podczas każdego okresu poduprawy należy obserwować, czy maksymalne wartości OD kropel znacznie wzrosły. Jeśli wzrost nastąpi i spełni wymagania eksperymentu, kliknij przycisk eksportu danych, aby wyeksportować dane OD. Aby wyodrębnić docelowe kropelki z MMC, kliknij zakładkę przesiewania, aby wybrać funkcję ekstrakcji kropel.
Następnie wybierz opcję Collect i kliknij liczbę docelowych kropel. Po zakończeniu kliknij OK. Poczekaj na wyskakujące okienko z komunikatem. Następnie włóż szybkozłączkę CF do probówki mikrowirówki w celu pobrania i kliknij OK. Po jednej lub dwóch minutach, gdy w interfejsie oprogramowania pojawi się nowe okno z komunikatem, włóż szybkozłącze CF z powrotem i kliknij OK, aby MMC kontynuowało działanie.
Gdy następna kropla docelowa dotrze do miejsca rozpoznawania kropli, zbierz ją zgodnie z wcześniejszymi opisami. Użyj pipety o pojemności 2,5 mikrolitra, aby wyjąć i umieścić kroplę na 90-milimetrowej solidnej płytce, a następnie równomiernie rozprowadź kroplę za pomocą szklanego trójkątnego pręta o boku długości trzech centymetrów, a następnie hoduj kroplę w inkubatorze o stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Później wybierz od trzech do pięciu niezależnych kolonii bakterii, aby hodować każdą kolonię osobno w 50-mililitrowej kolbie do wytrząsania z 10 mililitrami świeżej pożywki w inkubatorze do wytrząsania przy 200 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza przez 48 do 72 godzin.
Po inkubacji należy postępować zgodnie z odpowiednimi standardowymi przepisami dotyczącymi przechowywania roztworu bakterii hodowlanych w probówce z glicerolem. Reprezentatywna analiza pokazuje krzywe wzrostu 50 kropel w całym procesie ewolucji adaptacyjnej. Zaobserwowano, że niezbędny do metanolu szczep Escherichia coli lub MeSV2.2 wykazywał początkowy powolny wzrost, po którym nastąpił szybki wzrost.
Krzywa wzrostu kropli szóstej w całym procesie ewolucji adaptacyjnej została wykreślona oddzielnie. Maksymalna wartość OD600 w pierwszym pokoleniu wynosiła 0,37, która wzrosła do 0,58 w ostatnim okresie poduprawy, co wskazuje, że szczep w kropli szóstej zrealizował oczywistą ewolucję adaptacyjną. Ponadto porównano krzywe wzrostu szczepu kropli szóstej i szczepu początkowego.
Szczep kropli szóstej wykazywał wyższą maksymalną właściwą szybkość wzrostu i stężenie komórek w fazie stacjonarnej niż szczep początkowy. Najważniejszą rzeczą jest upewnienie się, że połączenie chipa instrumentu z butelką z odczynnikiem jest prawidłowe, czyli kropelki, aby operacje przebiegały normalnie. Metoda ta dostarcza naukowcom nowego pomysłu na hodowlę mikroorganizmów, a także zapewnia wydajną i tanią platformę do adaptacyjnej ewolucji szczepów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje system Mikrokropelkowej Kultury Mikrobów (MMC) do zautomatyzowanej hodowlii mikroorganizmów i adaptacyjnej ewolucji. Oferuje niskobudżetową, przyjazną dla użytkownika platformę, która poprawia wydajność hodowli, zmniejszając zużycie pracy i reagentów.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Automatyzowana hodowla
- Adaptacyjna ewolucja
Tło
- Konwencjonalne metody hodowli mikroorganizmów mogą być pracochłonne i zużywać wiele zasobów.
- Automatyzowane systemy mogą poprawić wydajność i niezawodność w badaniach mikrobiologicznych.
- System MMC pozwala na ciągłe monitorowanie wzrostu mikroorganizmów.
- Ta technologia jest szczególnie przydatna do pomiaru krzywych wzrostu i adaptacyjnej ewolucji w laboratorium.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej i wydajnej metody hodowli mikroorganizmów.
- Automatyzacja procesu hodowli i zmniejszenie pracy ręcznej.
- Ułatwienie badań nad adaptacyjną ewolucją w mikrobiologii.
Stosowane metody
- Podłączenie igły strzykawki do szybkozłącza i butelki z reagentem.
- Wykorzystanie systemu MMC do ciągłej kultury mikroorganizmów.
- Monitorowanie wzrostu online dla analizy wysoko-przepustowości.
- Przeprowadzanie eksperymentów z prostymi procedurami operacyjnymi.
Główne wyniki
- System MMC wykazuje dobrą wydajność hodowli.
- Wyniki pokazują niezawodne rezultaty przy zmniejszonym zużyciu pracy.
- Adaptacyjna ewolucja może być wydajnie przeprowadzana za pomocą tej metody.
- Wysoka przepustowość i paralelizacja są osiągane w badaniach mikrobiologicznych.
Wnioski
- System MMC jest cennym narzędziem do badań mikrobiologicznych.
- Upraszcza proces hodowli i ewolucji mikroorganizmów.
- Ta technologia może prowadzić do znaczących postępów w badaniach mikrobiologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The Microbial Microdroplet Culture (MMC) system addresses key limitations in conventional microbial cultivation by enabling automated, high-throughput growth monitoring and adaptive evolution with reduced labor and reagent consumption. This platform supports early-stage discovery workflows where reproducible, quantitative microbial phenotypes are essential for target validation and lead identification. Its integration of droplet generation, online OD monitoring, and sub-cultivation enhances data reliability and parallelization, improving predictive confidence in strain engineering efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial growth phenotypes under controlled conditions to support functional target validation and pathway de-risking.
- Operational Value: Automates inoculation, cultivation, and monitoring steps, reducing manual variability and increasing reproducibility across biological replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative OD600 measurements across thousands of microdroplets, enabling high-resolution phenotypic screening for adaptive traits.
- Operational Value: Standardizes culture conditions through precise fluid control and environmental regulation, improving assay consistency and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports adaptive laboratory evolution (ALE) studies to model strain adaptation, providing mechanistic insights for enzyme engineering and metabolic pathway optimization.
- Operational Value: Facilitates isolation of evolved droplets and downstream validation in shake flasks, bridging microfluidic screening with conventional microbiological workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MMC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven strain characterization and adaptive evolution prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Enables controlled cultivation and real-time growth tracking to assess genetic modifications and environmental responses in microbial strains.
- Screening: Provides droplet-based, parallel cultivation with online OD detection for high-throughput screening of growth variants under selection pressure.
- Analytics: Outputs time-resolved OD600 data for growth curve analysis, enabling quantitative comparison of microbial fitness across generations.
- Translational Research: Links microfluidic screening to offline validation via droplet extraction and shake flask cultivation, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, automated platform for repeated use in microbial strain development programs, reducing retooling costs across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in strain performance by enabling reproducible, high-resolution growth measurements and adaptive evolution tracking.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent use through automation of inoculation, sub-cultivation, and sampling steps.
- Strategic Value: Accelerates strain optimization cycles, supporting faster go/no-go decisions in metabolic engineering and enzyme development programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial strains based on quantitative evolutionary trajectories and growth kinetics.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with microfluidic chip handling, syringe-based reagent loading, and optical calibration for OD detection.
- Depends on stable temperature control (37°C), precise fluidics, and biocompatible oil phases to maintain droplet integrity and prevent evaporation.
- Necessitates standardized protocols for droplet generation, sorting, and extraction to ensure cross-user reproducibility and data comparability.
- Involves adaptation steps when transferring evolved droplets to solid media and shake flasks for offline validation and characterization.
- Limited by the need for sterile reagent preparation and proper sealing to avoid contamination during extended cultivation runs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Preparations for the Experiment
1:48
Growth Curve Measurement in Microbial Microdroplet Culture System (MMC)
4:25
Adaptive Evolution in Microbial Microdroplet Culture System (MMC)
6:41
Results: The Adaptive Evolution of the Methanol-Essential Escherichia coli (MeSV2.2) in MMC
7:36
Conclusion
