Name: Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy C57BL/6J. Protokół umożliwia utrzymanie komórek w stanie macierzystym do badań biologii komórek macierzystych jamy ustnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (20H03266) (do A.S.), Grant-in-Aid dla początkujących naukowców (18K14709) (do A.S.), AMED pod numerem grantu JP21gm6110016 i 21bm0704067 (do A.S.) oraz granty badawcze od Takeda Science Foundation (do A.S.). Dziękujemy Centrum Zasobów i Rozwoju Zwierząt na Uniwersytecie Kumamoto oraz Centrum Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie Tsukuba za doskonałą opiekę nad myszami. Dziękujemy ośrodku IRCMS na Uniwersytecie Kumamoto za wsparcie w zakresie obrazowania konfokalnego.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu Eksperymentów na Zwierzętach na Uniwersytecie Kumamoto i Uniwersytecie Tsukuba.
1. Przygotowanie odczynników i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Przygotować 40 ml pożywki hodowlanej keratynocytów zawierającej 60 μM wapnia i 600 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Przygotuj 20 ml 0,025% trypsyny i 400 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego.
	<ol>
		<li>Rozmrozić roztwór hamujący trypsynę w temperaturze pokojowej i utrzymywać go w temperaturze 4 °C do momentu użycia w kroku 4.1. 
		UWAGA: Odczynnik izolacyjny jest przygotowany do izolacji tkanek pięciu myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę hodowlaną, należy wziąć 500 ml pożywki i dodać 5 ml roztworu suplementu wzrostu (patrz Tabela materiałów) (zwanego dalej kompletną pożywką) i 20% zubożonej w wapń surowicy bydlęcej (FBS) zubożonej w wapń (FBS)33 (zwanej dalej chelexed-FBS).</li>
</ol>
2. Wypreparowanie tkanki podniebienia od dorosłej myszy
<ol>
	<li>Ofiarować dorosłą mysz C57BL/6J (samca lub samicę) przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z przepisami zakładu dotyczącymi dobrostanu zwierząt.
	<ol>
		<li>Usuń włosy wokół ust za pomocą golarki. Za pomocą nożyczek tnij od policzka w kierunku szczęki, po obu stronach. 
		UWAGA: Mysz musi zostać znieczulona przed złożeniem ofiary. Stosuje się znieczulającą mieszaninę medetomidyny, midazolamu i butorfanolu (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby szeroko otworzyć usta i wchłonąć krew za pomocą bawełnianego wacika. Aby zdezynfekować podniebienie, przetrzyj wnętrze jamy ustnej bawełnianym wacikiem zawierającym 10% jodu powidonu.</li>
	<li>Aby zebrać podniebienie myszy, najpierw użyj chirurgicznego ostrza skalpela, aby wykonać nacięcie brzeżne o pełnej grubości wzdłuż podniebienia zębów szczęki. Następnie dokładnie rozetnij całe podniebienie za pomocą raspatorium. 
	UWAGA: Raspatorium to narzędzie służące do podnoszenia płata śluzówkowo-okostnowego (patrz Tabela Materiałów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Szybko przenieś tkankę podniebienia do 15 ml probówki zawierającej 4 ml kompletnego roztworu + antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. Chusteczki należy przechowywać na lodzie, aż będą gotowe do inkubacji. 
	UWAGA: W przypadku pobrania od wielu myszy tkanki podniebienia można przechowywać na lodzie do 4 godzin.</li>
</ol>
3. Wstępne leczenie tkanki podniebienia
<ol>
	<li>W kapturze z przepływem laminarnym przenieść tkanki do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego 4 ml kompletnego roztworu pożywki + antybiotyku i antybiotyku.</li>
	<li>Za pomocą krótkich, kleszczyków i ostrza skalpela delikatnie usuń krew z tkanek. Umyj chusteczki 10 razy w pełnym podłożu.</li>
	<li>Przenieś tkanki do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 4 ml 0,025% trypsyny + roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego, powierzchnią nabłonka skierowaną w dół. 
	UWAGA: Powierzchnię nabłonka, która zakrzywia się do wewnątrz, należy namoczyć w roztworze trypsyny; Blaszka właściwa powinna być skierowana do góry. Tkanka powinna być spłaszczona tak bardzo, jak to możliwe, aby mogła być w całości inkubowana w roztworze trypsyny.</li>
	<li>Inkubować tkanki w 0,025% trypsyny przez ~16 godzin w temperaturze pokojowej w kapturze hodowlanym.</li>
</ol>
4. Pobieranie i hodowla komórek pierwotnych
<ol>
	<li>Za pomocą jednej pary kleszczyków usuń tkankę z roztworu trypsyny (w naczyniu 35 mm) i przenieś do roztworu inhibitora trypsyny w naczyniu o średnicy 60 mm (4 ml na miskę) z powierzchnią nabłonka skierowaną do góry.</li>
	<li>Używając kleszczy, aby przytrzymać krawędź podniebienia, delikatnie zeskrob warstwę nabłonka z leżącej poniżej blaszki właściwej za pomocą ostrza skalpela. 
	UWAGA: Tkanka łączna nie jest trawiona przez trypsynę, więc nie złuszcza się podczas skrobania.</li>
	<li>Aby pobrać maksymalną ilość komórek nabłonka z tkanek, przenieś tkankę do innego naczynia o średnicy 60 mm z 4 ml kompletnego podłoża i powtórz etap skrobania. 
	UWAGA: Upewnij się, że nie skrobasz chusteczki końcówką ostrza; Zamiast tego użyj krawędzi ostrza. Skrobanie wykonuje się przez 5-10 minut na tkankę.</li>
	<li>Umieść sterylne sitko do komórek 100 μm na wierzchu stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety przenieś 2 ml roztworu trypsyny (z kroku 4.1) do sitka w celu zwilżenia jego powierzchni.</li>
	<li>Za pomocą pipety wymieszać zawiesinę komórek w naczyniu o średnicy 60 mm (z etapów 4.2-4.3) i przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 100 μm przygotowane w krokach 4.4-4.5.</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Przygotować 15 μl roztworu błękitu trypanowego i dodać 15 μl zawiesiny komórek (krok 4.6). Przenieść 10 μl mieszanki komórek i błękitu trypanowego do hemocytometru i policzyć liczbę komórek. 
	UWAGA: Jeden kawałek podniebienia myszy może dać do 1 miliona komórek.</li>
	<li>Podczas liczenia odwirować probówkę (z kroku 4.6) o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety. Dodać 2 ml kompletnej pożywki + chelexed-FBS do probówki. Zawiesić osad komórkowy, kilkakrotnie rozcierając go za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Płytka 2-5 x 105 komórek z jednej myszy do jednego dołka 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej kolagenem typu I (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 dni bez zmiany pożywki.</li>
	<li>Dwa dni po wysiewie zastąp połowę pożywki kompletną pożywką + chelexed-FBS. Sprawdź morfologię komórki pod mikroskopem. Karmić komórki kompletną pożywką + chelexed-FBS co 2 dni. 
	UWAGA: Po wysiewie będą obserwowane komórki o różnych rozmiarach. Około 3-5 dni po wysiewie można zaobserwować keratynocyty o morfologii kostki brukowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Potrzeba 1-2 tygodni hodowli, zanim będzie można przeprowadzić pierwsze pasaże, a kolejne 1-2 tygodnie są konieczne, zanim komórki będą gotowe do drugiego i trzeciego pasażu. Następnie komórki będą rosły szybciej i mogą być przygotowane do krioprezerwacji. Komórki można ponownie posiać do jednego dołka (na płytce 24-dołkowej) i płytki 6-dołkowej odpowiednio w pierwszym i drugim pasażu. Późniejsze przejście będzie zależało od wzrostu i gęstości komórek. Po trzecim przejściu można zastosować współczynnik podziału komórek 1:2 lub 1:3.</li>
</ol>
5. Przejście keratynocytów
<ol>
	<li>Zebrać 2 ml supernatantu z naczynia hodowlanego i przelać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (na lodzie). Umyj komórki sterylnym 1x PBS dwa razy. 
	UWAGA: Gdy komórki osiągną około 70%-80% konfluencji, są gotowe do przejścia.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia do jednego dołka na 6-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować przez 5-15 minut w temperaturze 37 °C; po 5 minutach sprawdzić, czy komórki odrywają się od naczynia. </li>
	<li>Zneutralizować reakcję za pomocą 1 ml roztworu hamującego trypsynę i 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej + cheleksed-FBS przez delikatne pipetowanie. Następnie przenieś zawiesinę komórek do tej samej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, co w kroku 5.1.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie umieść 1 ml zawiesiny komórkowej na nowej 24- lub 6-dołkowej płytce hodowlanej. 
	UWAGA: Niektóre komórki z wczesnych pasaży można zamrozić w mieszaninie 70% kompletnej pożywki hodowlanej + 20% chelexed-FBS + 10% DMSO. Z jednej zlewającej się płytki hodowlanej można pobrać 1-2 kriowiale komórek.</li>
</ol>
6. Kriokonserwacja i odzyskiwanie keratynocytów
<ol>
	<li>Zamrażanie komórek
	<ol>
		<li>Wzrost keratynocytów do 80%-90% konfluencji. 
		UWAGA: Nie dopuszczaj do przerostu komórek, ponieważ może to zmniejszyć ich stan proliferacji i żywotność.</li>
		<li>Potraktuj keratynocyty w naczyniu 0,05% trypsyny-EDTA, jak opisano w krokach 5.1-5.5.</li>
		<li>Policz keratynocyty za pomocą hemocytometru. Przygotuj kriowiale na podstawie obliczonej liczby komórek, aby umożliwić transfer 1 x 106 komórek/ml do każdej fiolki.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml roztworu 10% DMSO + 20% cheleksedu-FBS + 70% kompletnej pożywki hodowlanej (9 ml kompletnej pożywki + cheleksed-FBS i 1 ml DMSO).</li>
		<li>Dozować komórki do kriowialiów w ilości 1 ml zawiesiny na fiolkę. Umieścić fiolki w pojemniku do przechowywania kriogenicznego na noc w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika z ciekłym azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie komórek
	<ol>
		<li>Wyjmij kriowial ze zbiornika ciekłego azotu i częściowo rozmrozić w temperaturze pokojowej. W probówce o pojemności 15 ml wymieszać 1 ml zawiesiny komórek z 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej + chelexed-FBS.</li>
		<li>Odwirować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze 100 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej + cheleksed-FBS.</li>
		<li>Umieść zawiesiny komórek w nowych 60-milimetrowych naczyniach hodowlanych pokrytych kolagenem I. Wymieniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni i przechodź komórki po zlaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Hodowla keratynocytów jamy ustnej na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych (22 mm x 22 mm) na płytkach 6-dołkowych (5 x 10 5 komórek/dołek) przez 2 dni.</li>
	<li>Utrwal keratynocyty w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA) i PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed trzykrotnym umyciem 1x PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek w roztworze 0,1% Trytonu w PBS. Inkubować komórki w odczynniku blokującym (2,5% surowicy koziej, 2,5% surowicy osła) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe stosowano w następujących rozcieńczeniach: królicze anty-K14 (1:1000), szczurza α6-integryna (1:100), królicze anty-p63 (1:500), królicze anty-K13 (1:100) i kozie anty-PDGFRα (1:100).</li>
	<li>Próbki przemyć w roztworze 0,1% Trytona w PBS, a następnie przeprowadzić inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe (Alexa 488 lub 555) stosowano w rozcieńczeniu 1:300.</li>
	<li>Wybarwić wszystkie próbki roztworem Hoechst przez 10 minut i zamontować kuwety na szkiełkach podstawowych. 
	UWAGA: Roztwór Hoechsta służy do barwienia jąder komórek.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego. 
	UWAGA: Jasność i kontrast są dostosowywane do równej intensywności za pomocą oprogramowania do edycji obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Presland, R. B., Jurevic, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+sense+of+the+epithelial+barrier%3A+what+molecular+biology+and+genetics+tell+us+about+the+functions+of+oral+mucosal+and+epidermal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Education%22%5BJournal%5D)">Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues.</a> Journal of Dental Education. 66 (4), 564-574 (2002).</li>
<li>Squier, C. A., Kremer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oral+mucosa+and+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Biology of oral mucosa and esophagus.</a> Journal of the National Cancer Institute Monographs. (29), 7-15 (2001).</li>
<li>Jones, K. B., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+epithelial+stem+cells+in+tissue+maintenance+and+disease%3A+the+first+steps+in+a+long+journey%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey.</a> International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).</li>
<li>Winning, T. A., Townsend, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+embryology+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal embryology and histology.</a> Clinics in Dermatology. 18 (5), 499-511 (2000).</li>
<li>Asaka, T., Akiyama, M., Kitagawa, Y., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+density+of+label-retaining+cells+in+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Higher density of label-retaining cells in gingival epithelium.</a> Journal of Dermatological Science. 55 (2), 132-134 (2009).</li>
<li>Bickenbach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+label-retaining+cells+in+oral+mucosa+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of label-retaining cells in oral mucosa and skin.</a> Journal of Dental Research. 60, Spec No C 1611-1620 (1981).</li>
<li>Bickenbach, J. R., Mackenzie, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+localization+of+label-retaining+cells+in+hamster+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Identification and localization of label-retaining cells in hamster epithelia.</a> Journal of Investigative Dermatology. 82 (6), 618-622 (1984).</li>
<li>Byrd, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+within+stratified+epithelial+stem+cell+populations+maintains+the+oral+mucosa+in+response+to+physiological+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).</li>
<li>Jones, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+clonal+analysis+and+single-cell+transcriptomics+reveal+division+kinetics%2C+hierarchy%2C+and+fate+of+oral+epithelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).</li>
<li>Willberg, J., Syrjanen, S., Hormia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+epithelium+in+rats+is+characterized+by+slow+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Junctional epithelium in rats is characterized by slow cell proliferation.</a> Journal of Periodontology. 77 (5), 840-846 (2006).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+that+maintain+and+regenerate+lingual+keratinized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).</li>
<li>Compton, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+regenerated+from+cultured+epithelial+autografts+on+full-thickness+burn+wounds+from+6+days+to+5+years+after+grafting.+A+light%2C+electron+microscopic+and+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Skin regenerated from cultured epithelial autografts on full-thickness burn wounds from 6 days to 5 years after grafting. A light, electron microscopic and immunohistochemical study.</a> Laboratory Investigation. 60 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Gallico, G. G., O'Connor, N. E., Compton, C. C., Kehinde, O., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+coverage+of+large+burn+wounds+with+autologous+cultured+human+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium.</a> New England Journal of Medicine. 311 (7), 448-451 (1984).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 2(2013).</li>
<li>O'connor, N. E., Mulliken, J. B., Banksschlegel, S., Kehinde, O., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+burns+with+cultured+epithelium+prepared+from+autologous+epidermal-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal-cells.</a> Lancet. 1 (8211), 75-78 (1981).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Caldelari, R., Suter, M. M., Baumann, D., De Bruin, A., Muller, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+murine+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of murine epidermal keratinocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 114 (5), 1064-1065 (2000).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Yano, S., Okochi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+adult+murine+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of adult murine epidermal keratinocytes.</a> British Journal of Dermatology. 153 (6), 1101-1104 (2005).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+signature+primes+human+oral+mucosa+for+rapid+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing.</a> Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).</li>
<li>Papagerakis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+epithelial+stem+cells+-+implications+in+normal+development+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Oral epithelial stem cells - implications in normal development and cancer metastasis.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 111-129 (2014).</li>
<li>Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+injury+responses+in+oral+mucosal+and+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds.</a> Journal of Dental Research. 82 (8), 621-626 (2003).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+differences+in+the+wound+transcriptome+of+skin+and+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa.</a> BMC Genomics. 11, 471(2010).</li>
<li>Chen, L., Gajendrareddy, P. K., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+HIF-1alpha+in+skin+and+mucosal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Differential expression of HIF-1alpha in skin and mucosal wounds.</a> Journal of Dental Research. 91 (9), 871-876 (2012).</li>
<li>Simoes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profile+underlies+the+divergent+healing+responses+in+skin+and+oral+mucosal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profile underlies the divergent healing responses in skin and oral mucosal wounds.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7160(2019).</li>
<li>Turabelidze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+between+oral+and+skin+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences between oral and skin keratinocytes.</a> PLoS One. 9 (9), 101480(2014).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Izumi, K., Tobita, T., Feinberg, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+oral+keratinocyte+progenitor%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of human oral keratinocyte progenitor/stem cells.</a> Journal of Dental Research. 86 (4), 341-346 (2007).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Hatakeyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+gingival+epithelial+cell+lines+from+transgenic+mice+harboring+temperature+sensitive+simian+virus+40+large+T-antigen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Establishment of gingival epithelial cell lines from transgenic mice harboring temperature sensitive simian virus 40 large T-antigen gene.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 30 (5), 296-304 (2001).</li>
<li>Ookura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+and+epidermal+growth+factors+modulate+proliferation+and+neural+cell+adhesion+molecule+expression+in+epithelial+cells+derived+from+the+adult+mouse+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast and epidermal growth factors modulate proliferation and neural cell adhesion molecule expression in epithelial cells derived from the adult mouse tongue.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (6), 365-372 (2002).</li>
<li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li>
<li>Brennan, J. K., Mansky, J., Roberts, G., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+for+reducing+calcium+and+magnesium+concentrations+in+tissue+culture+medium%3A+application+to+studies+of+lymphoblast+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Improved methods for reducing calcium and magnesium concentrations in tissue culture medium: application to studies of lymphoblast proliferation in vitro.</a> In Vitro. 11 (6), 354-360 (1975).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Keratynocyty pierwotne wyizolowane z naskórka ludzkiej lub mysiej skóry są wykorzystywane od wielu lat w badaniach i zastosowaniach klinicznych 12,13,15,18,27,28,29. W przeciwieństwie do tego, ustanowiono kilka protokołów izolacji i hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej od dorosłych myszy 30,31,32. W niniejszym badaniu wykorzystano komercyjną kompletną pożywkę hodowlaną i cheleksed-FBS w celu utrzymania keratynocytów w stanie proliferacyjnym lub podobnym do komórek macierzystych. Ten system hodowli może być stosowany w testach molekularnych i biochemicznych w celu lepszego zrozumienia cech komórek macierzystych nabłonka jamy ustnej i powiązanych z nimi chorób.
W tym protokole zawarto kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, stężenie trypsyny i czas inkubacji są niezbędne do wytworzenia żywotnych komórek do kolejnych hodowli. Konsekwentnie stosowaliśmy 0,025% roztwory trypsyny i 16-godzinne okresy inkubacji w kapturze komory w temperaturze pokojowej. Jeśli keratynocyty nie będą inkubowane przez wystarczająco długi czas, nie oddzielą się prawidłowo od tkanki, co spowoduje niższą końcową wydajność komórek. Po drugie, delikatne pipetowanie zawiesiny komórkowej w drugim dniu znacząco wpływa na żywotność komórek. Skrobanie należy delikatnie rozpocząć od strony nabłonka i nie przekraczać 10 minut na próbkę tkanki. Wreszcie pierwsza izolowana zawiesina komórkowa zawiera fibroblasty i inne typy komórek; Te niechciane komórki zwykle zaczną zanikać w kolejnych hodowlach.
Potencjalne ograniczenia zidentyfikowano podczas izolacji komórek i hodowli. W rzadkich przypadkach fibroblasty mogą zostać zanieczyszczone podczas procesu izolacji, a fibroblasty mogą hamować wzrost keratynocytów w kolejnych pasażach (ryc. 2H). Konieczne jest wybranie komercyjnej pożywki, która zawiera inhibitor wzrostu fibroblastów, aby wyeliminować takie zanieczyszczenie w kulturze. Ponieważ podniebienie myszy i inne błony śluzowe jamy ustnej mają stosunkowo małe rozmiary, początkowa wydajność komórek od jednej myszy może być niska. Dlatego cały okres hodowli w tym protokole - do etapu kriokonserwacji - jest dłuższy niż w przypadku pierwotnych keratynocytów skóry. Izolowane keratynocyty jamy ustnej najlepiej stosować w ciągu 10 pasaży, ponieważ dłuższe okresy hodowli mogą zmienić właściwości komórek i obniżyć liczbę komórek macierzystych.
Obecna metoda wykazała, że keratynocyty jamy ustnej myszy wykazywały ciasno upakowaną, brukowaną morfologię i tworzyły jednowarstwowe kolonie w warunkach proliferacji. Wykazali również wysoką ekspresję podstawowych markerów α6-integryny, K14 i markera komórek macierzystych p63. W przyszłych badaniach, oprócz barwienia immunofluorescencyjnego, sekwencjonowanie RNA, RT-PCR i analizy western blot zostaną wykorzystane do weryfikacji niejednorodności komórkowej i czystości doustnych keratynocytów, co jeszcze bardziej poprawi nasze zrozumienie natury tych komórek.
Po 2-3 pasażach keratynocyty jamy ustnej były na tyle stabilne, że można je było wykorzystać w dalszych eksperymentach funkcjonalnych. Co ważne, ten protokół hodowli może być łączony z transgenicznymi liniami myszy, w tym z nokautem genów, Cre-loxP i systemami indukowanymi tet, a także może być stosowany w testach komórkowych i molekularnych. W związku z tym obecny protokół zapewnia naukowcom fundamentalną i skuteczną metodę, którą można wykorzystać do lepszego zrozumienia biologii komórek macierzystych keratynocytów jamy ustnej.

Nabłonek jamy ustnej służy jako pierwsza bariera chroniąca organizm przed stresem środowiskowym, w tym uszkodzeniami chemicznymi lub fizycznymi oraz infekcjami bakteryjnymi i wirusowymi1,2. Błona śluzowa jamy ustnej składa się z zewnętrznej warstwy warstwowego nabłonka płaskonabłonkowego, która składa się z keratynocytów i leżącej poniżej tkanki łącznej zwanej blaszką właściwą, która składa się głównie z fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej. Błonę śluzową jamy ustnej myszy można ogólnie podzielić na trzy podtypy: żucie (podniebienie twarde i dziąsło), wyspecjalizowane (język grzbietowy) i błona śluzowa (błona śluzowa policzka, język brzuszny, podniebienie miękkie, wargi) błona śluzowa2,3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Nabłonek jamy ustnej jest zrogowaciały w błonie śluzowej żucia i specjalistycznej oraz niezrogowaciały w błonie śluzowej wyściółki. Pomimo swojego anatomicznego położenia nabłonek jamy ustnej jest podobny do naskórka skóry, ponieważ składa się z ciasno upakowanych komórek nabłonka o różnym stopniu zróżnicowania: warstwy podstawne zawierające niezróżnicowane komórki; warstwy kolczyste, ziarniste i zrogowaciałe, które tworzą zrogowaciały nabłonek lub warstwy pośrednie i powierzchowne, które tworzą nabłonek niezrogowaciały4. Transgeniczne modele myszy ułatwiły badanie cech komórkowych i molekularnych komórek macierzystych nabłonka jamy ustnej w podniebieniu, błonie śluzowej policzka, języku i dziąśle5,6,7,8,9,10,11. Jednak większość z tych badań wykorzystywała głównie eksperymenty in vivo na myszach. Systemy hodowli komórkowych nie były zazwyczaj stosowane ze względu na brak ustalonych i skutecznych protokołów.
System hodowli in vitro może być używany do analizy molekularnej i biochemicznej regulatorów komórek macierzystych, testów komórkowych i badań przesiewowych leków. Obecnie opracowano protokoły hodowli pierwotnych keratynocytów naskórka skóry, w których podstawowe keratynocyty mogą być z powodzeniem izolowane i hodowane do celów klinicznych i badawczych12,13,14,15. W 1980 roku Hennings i in. wykazali, że niskie stężenie wapnia (< 0,09 mM Ca2+) w pożywce hodowlanej ułatwiało proliferację i utrzymywało komórki w stanie niezróżnicowanym. Wyższy poziom wapnia sprzyjał różnicowaniu komórek i zmniejszonej proliferacji16. Następnie ustalono metodologie hodowli mysich keratynocytów naskórkowych u noworodków i dorosłych, które są szeroko stosowane do wielu modeli myszy o różnym pochodzeniu genetycznym do badań in vitro17,18,19. Chociaż nabłonek skóry i jamy ustnej ma wspólne cechy, wykazuje również wewnętrzne różnice, np. w stanie rogowacenia, szybkości rotacji, ekspresji genów i zdolności gojenia się ran3,11,20,21,22,23,24,25,26.
Chociaż pomyślnie przeprowadzono hodowlę keratynocytów w jamie ustnej człowieka27,28,29, publikacje na temat hodowli keratynocytów w jamie ustnej myszy30,31,32 są ograniczone ze względu na mały rozmiar tkanki docelowej i odmienne cechy komórek w porównaniu z naskórkiem skóry keratynocyty. Protokół ten opisuje techniki izolacji i długoterminowego posiewu pierwotnych keratynocytów jamy ustnej myszy.

<table><tbody><tr><td>0,025% Trypsyna/EDTA</td><td>Gibco</td><td>R001100</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna/EDTA, czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>0,4w/v% Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Wako</td><td>207-17081</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta serologiczna</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Nylonowe sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 ml sterylna probówka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Piper zasysająca</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylna probówka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>96 Płytka do hodowli dołków (u dna)</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Biocoat Collagen I naczynie komórkowe 60mm</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>AS ONE</td><td>1-8187-03</td><td></td></tr><tr><td>Butorfanol</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td></td><td>Vetorphale</td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>432002</td><td>Przechowywanie kriogeniczne</td></tr><tr><td>Bawełna</td><td>AS ONE</td><td>63-1452-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 &mu; m kwadrat</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td></td><td></td>C022221</tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna 1,2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-0012</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)</td> <td>Gibco</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw królikom osłom (H + L), Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td></td></tr><tr><td>IgG przeciw szczurom osła (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife Zdefiniowany suplement wzrostu (EDGS)</td> <td>Gibco</td><td>S0120</td><td></td></tr><tr><td>EpiLife, z 60 &mikro; M wapń</td><td>Gibco</td><td>MEPI500CA</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td></td></tr><tr><td>Kozia Receptor anty-PDGF i alfa;</td><td>R& D Systems</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze półzakrzywione</td><td>BRC Bio Research Center</td><td>PRI13-3376</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te</td><td>8100204</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>Muromachi Kikai</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td></td><td>Domitor</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Astellas Pharma</td><td>Dormicum</td>No.15 Jednorazowy <td></td></tr><tr><td>skalpel</td><td>Feather</td><td>219AABZX00136000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem 1x, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr>Kwadratowe <td>872612</td><td></td><td>jodu powidonu</td><td>Y's Przeciwciało</td></tr><tr><td>przeciw cytokeratynie 13</td><td>Abcam</td><td>ab92551</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-K14</td><td>BioLegend</td><td>905301</td><td></td></tr><tr><td>Królik przeciwciało anty-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Raspatorium #14</td><td>JAKO JEDEN</td><td>8-4599-01</td><td></td></tr><tr><td>Szczur i alfa; 6-integrin</td><td>BD Biosciences</td><td>553745</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>581-81705</td><td></td></tr><tr><td>Typ I Płytka 24-dołkowa powlekana kolagenem</td><td>Corning</td><td>354408</td><td></td></tr><tr><td>Type I Półmiska 60 mm powlekana kolagenem</td><td>Corning</td><td>356401</td><td></td></tr><tr><td>Type I Płytka 6-dołkowa powlekana kolagenem</td><td>Corning</td><td>355400</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

Przez lata, większość badań z udziałem keratynocytów była prowadzona przy użyciu ludzkich i mysich keratynocytów naskórkowych. Ostatnio keratynocyty jamy ustnej przyciągnęły uwagę ze względu na ich unikalną funkcję i cechy. Utrzymują homeostazę nabłonka jamy ustnej i służą jako zasoby do zastosowań w terapiach regeneracyjnych. Jednak badania in vitro, w których wykorzystuje się doustne keratynocyty pierwotne od dorosłych myszy, były ograniczone ze względu na brak skutecznego i dobrze ugruntowanego protokołu hodowli. W tym przypadku pierwotne keratynocyty w jamie ustnej wyizolowano z tkanek podniebienia dorosłych myszy i wyhodowano w komercyjnym podłożu o niskiej zawartości wapnia uzupełnionym surowicą cheleksedową. W tych warunkach keratynocyty były utrzymywane w stanie proliferacyjnym lub podobnym do komórek macierzystych, a ich różnicowanie było zahamowane nawet po zwiększonym pasażu. Analiza ekspresji markerów wykazała, że hodowane keratynocyty jamy ustnej wykazywały ekspresję markerów komórek podstawnych p63, K14 i integryny α6 i były ujemne dla markera różnicowania K13 i markera fibroblastów PDGFRα. W wyniku tej metody uzyskano żywe i zdolne do hodowli komórki, nadające się do dalszych zastosowań w badaniu funkcji nabłonkowych komórek macierzystych jamy ustnej in vitro.

Przegląd procesu sekcji i izolacji keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy 
Dysocjowane keratynocyty jamy ustnej pobrano z podniebienia dorosłej myszy i hodowano w dostosowanej pożywce z 20% chelexed-FBS. Podniebienie myszy składa się z podniebienia twardego oraz podniebienia miękkiego (Rysunek 1C). Procedura izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy została podsumowana na Rysunku 1D. Tkankę podniebienia wycinano i przenoszono do medium zawierającego roztwór antybiotyk-antymykotyk przed inkubacją w 0,025% roztworze trypsyny w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia tkankę podniebienia poddano działaniu roztworu inhibitora trypsyny oraz pełnej pożywki hodowlanej w równych objętościach. Następnie tkanki zdrapano za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego w celu zebrania keratynocytów jamy ustnej. Zawiesinę komórkową przefiltrowano przez sitko komórkowe o oczkach 100 µm i odwirowano. Komórki wysiano następnie na 24-dołkowe płytki powlekane Kolagenem I, zawierające 2 mL pełnej pożywki hodowlanej + chelexed-FBS.
Reprezentatywne wyniki udanej izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy 
Pierwotne keratynocyty jamy ustnej rosły w monowarstwie i wykazywały morfologię brukową (Rycina 2). Małe kolonie keratynocytów były widoczne w 3-5 dniach (Rycina 2A,B); stawały się one większe i tworzyły zwarte kolonie po 1 tygodniu inkubacji (Rycina 2C). Kolonie keratynocytów wykazywały typowe cechy morfologiczne keratynocytów podstawnych, co wskazywało na ich dobry stan. Ludzkie keratynocyty jamy ustnej pozostawały nieróżnicowane przez kilka pasaży w pełnym medium hodowlanym zawierającym 0,06 mM Ca2+16,28. Pierwszy pasaż wykonano około 2 tygodnie po początkowym wysianiu (Rycina 2D). W późniejszych pasażach keratynocyty wykazywały stabilny wzrost przy krótszym okresie hodowli (Rycina 2E-G). Keratynocyty przestały rosnąć w przypadku wystąpienia znacznej kontaminacji fibroblastami podczas procesu izolacji (Rycina 2H).
Izolowane keratynocyty jamy ustnej myszy wykazują ekspresję markerów komórek podstawnych 
Aby potwierdzić status pierwotnych keratynocytów jamy ustnej, przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne z wykorzystaniem markerów komórek podstawnych: keratyny 14 (K14) oraz integryny α6.34K14 oraz integryna α6 były wykazane w keratynocytach po hodowli (Rycina 3A,B). Komórki wybarwiono również przeciwciałem przeciwko markerowi komórek macierzystych p63, aby potwierdzić ich właściwości macierzyste. Komórki z wczesnego pasażu (pasaż 4) oraz późnego pasażu (pasaż 7) wykazały jednorodną ekspresję p63 (Rycina 3C,D). W przeciwieństwie do nich, keratynocyty poddane działaniu wysokiego stężenia wapnia (indukcja 1,2 mM przez 2 dni) wykazywały zmniejszoną ekspresję p63 (Rysunek 3E), co wskazuje, że wysokie stężenie wapnia hamuje ekspresję genów związanych z komórkami macierzystymi w pierwotnych keratynocytach, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16Marker różnicowania keratyna 13 (K13) wykazywał rzadką lub brak ekspresji zarówno wyczesach wczesnych, jak i późnych, oraz znaczną ekspresję po zastosowaniu wysokiego stężenia wapnia (Rycina 3F-H). Aby sprawdzić możliwość zanieczyszczenia hodowli keratynocytów fibroblastami, przeprowadzono barwienie z wykorzystaniem markera fibroblastów PDGFRα, stosując ten sam zestaw keratynocytów w porównaniu z zarodkowymi fibroblastami myszy (MEF). W hodowli keratynocytów nie stwierdzono ekspresji PDGFRα, w przeciwieństwie do wysokiej ekspresji zaobserwowanej w komórkach MEF (Rysunek 3I-3L). Wyniki te wykazały, że zastosowany protokół pozwala na skuteczną izolację keratynocytów warstwy podstawnej oraz utrzymanie tych komórek w stanie niezróżnicowanym.
<img alt="Schemat sekcji podniebienia myszy, zestaw narzędzi i proces przygotowania tkanki; obejmuje etapy trypsynizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd procedury sekcji i izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (A) Schematyczne przedstawienie jamy ustnej myszy. (B) Narzędzia użyte do sekcji podniebienia i izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (C) Obraz podniebienia myszy w polu jasnym. Pasek skali: 100 µm. (D) Podsumowanie protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat wzrostu hodowli komórkowej w czasie, od 3 dni do 2 tygodni, oraz pasażów od 1 do 3; kontaminacja fibroblastami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki udanej izolacji keratynocytów jamy ustnej myszy. (A-G) Obrazy czasowe hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej po 3 dniach (A), 5 dniach (B), 1 tygodniu (C) i 2 tygodniach (D) od izolacji. Przedstawiono morfologię keratynocytów jamy ustnej myszy po pierwszym (E), drugim (F) i trzecim (G) pasażu. (H) Przykład kontaminacji fibroblastami w hodowli keratynocytów jamy ustnej myszy. Pasek skali: 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące ekspresję keratyny i integryny w hodowlach komórkowych; widoczne barwienie Hoechst." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62820/62820fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Izolowane keratynocyty jamy ustnej myszy wykazują ekspresję markerów komórek podstawnych. (A-B) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego dla K14 (A; czerwony) i integryny α6 (B; zielony) w 4. pasażu. (C-E) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego dla p63 (zielony) w 4. pasażu (C), 7. pasażu (D) oraz po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (E). (F-H) Obrazy immunobarwienia dla K13 (zielony) w 4. pasażu (F), 7. pasażu (G) oraz po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (H). (I-L) Obrazy immunobarwienia dla PDGFRα (czerwony) w 4. pasażu (I), 7. pasażu (J), po traktowaniu wysokim stężeniem wapnia (K) oraz w MEF (L). Jądra barwiono Hoechst (niebieski). Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62820/62820fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę keratynocytów jamy ustnej pochodzących z podniebienia dorosłej myszy. Podano również metodę oceny z wykorzystaniem barwienia immunologicznego.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Ostatnio keratynocyty jamy ustnej przyciągnęły uwagę ze względu na swoje unikalne właściwości. Zapewniamy protokół hodowli keratynocytów jamy ustnej myszy w stanie podobnym do komórek macierzystych, odpowiednim do dalszych zastosowań. Hodowla keratynocytów jamy ustnej myszy i inna charakterystyka keratynocytów skóry.W tym protokole udało nam się wyizolować pierwotny keratynocyt jamy ustnej myszy i opracowaliśmy technikę długoterminowego posiewu. Ten system hodowli może być stosowany w testach molekularnych i biochemicznych w celu lepszego zrozumienia cech podstawnych komórek macierzystych jamy ustnej i związanych z nimi chorób. Po poświęceniu dorosłej myszy C57BLK6J usuń włosy wokół ust za pomocą golarki i nożyczkami przyciąć od policzków w kierunku szczęki po obu stronach.Następnie za pomocą kleszczy otwórz szeroko usta i wchłonij krew za pomocą bawełnianego wacika, a następnie zdezynfekuj paletę, przecierając wnętrze jamy ustnej bawełnianym wacikiem zawierającym 10% jodu powidonu. Aby zebrać paletę myszy, najpierw za pomocą chirurgicznego ostrza skalpela wykonaj nacięcie brzeżne o pełnej grubości wzdłuż strony palety zębów szczęki. Następnie za pomocą raspatorium ostrożnie rozetnij całą paletę.Szybko przenieś tkankę palety do 15-mililitrowej probówki zawierającej cztery mililitry kompletnego podłoża uzupełnionego antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi. Trzymaj chusteczki na lodzie, aż będą gotowe do inkubacji. W kapturze z przepływem laminarnym przenieś tkanki do 60-milimetrowego naczynia zawierającego cztery mililitry kompletnego podłoża z antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi.Następnie za pomocą krótkich, kleszczy i ostrza skalpela delikatnie usuń krew z tkanek i umyj tkanki 10 razy kompletnym podłożem. Po ostatnim praniu przenieś chusteczki do 35-milimetrowego naczynia zawierającego cztery mililitry 0,025% trypsyny uzupełnionej antybiotykami i lekami przeciwgrzybiczymi. Umieść tkanki powierzchnią nabłonka skierowaną w dół i inkubuj je przez 16 godzin w temperaturze pokojowej w kapturze hodowlanym.Po całonocnym trawieniu trypsyny użyj jednej pary kleszczy, aby usunąć tkankę z roztworu trypsyny i przenieś ją do 60-milimetrowego naczynia zawierającego roztwór inhibitora trypsyny powierzchnią nabłonka skierowaną do góry. Następnie, trzymając się kleszczykami krawędzi palety, za pomocą ostrza skalpela delikatnie zeskrob warstwę nabłonka z leżącej pod spodem blaszki właściwej. Aby zebrać maksymalną ilość komórek nabłonka z tkanek, przenieś tkankę do innego 60-milimetrowego naczynia z czterema mililitrami kompletnego podłoża i powtórz skrobanie, jak pokazano wcześniej.Następnie umieść sterylne sitko do komórek o średnicy 100 mikronów na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Za pomocą sterylnej pipety przenieś dwa mililitry roztworu trypsyny do sitka, aby zwilżyć jego powierzchnię. Następnie za pomocą pipety kilkakrotnie wymieszaj zawiesinę komórek w 60-milimetrowym naczyniu i przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 mikronów.Aby policzyć liczbę komórek, dodaj 15 mikrolitrów zawiesiny komórek do 50 mikrolitrów roztworu błękitu trypanowego, a następnie przenieś 10 mikrolitrów mieszanki błękitu trypanowego komórki do hemocytometru i policz liczbę komórek. Następnie odwirować zawiesinę komórkową, usunąć supernatant i dodać do probówki dwa mililitry kompletnej pożywki zawierającej Chelex FBS. Zawiesić osad komórkowy, miareczkując kilkakrotnie za pomocą pięciomililitrowej pipety.Następnie połóż od dwóch do pięciu razy od 10 do piątych komórek jednej myszy w jednym dołku 24-dołkowej płytki wstępnie pokrytej kolagenem typu pierwszego i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwa dni bez zmiany pożywki. Pierwotne keratynocyty jamy ustnej rosły jako monowarstwa i wykazywały morfologię brukową. Małe kolonie keratynocytów były widoczne po trzech i pięciu dniach.Po tygodniu inkubacji kolonie te powiększyły się i utworzyły ciasne kolonie. Pierwsze pasażowanie wykonano dwa tygodnie po początkowym posiewie, a przy późniejszych pasażach keratynocyty wykazywały stabilny wzrost z krótszym okresem hodowli. Keratynocyty przestały rosnąć, jeśli podczas procesu izolacji doszło do znacznego zanieczyszczenia fibroblastami.Po hodowli keratynocyty wykazywały ekspresję keratyny 14 i alfa6-integryny. Komórki wczesnego i późnego pasażu wykazywały jednolitą ekspresję P63, co potwierdzało ich macierzystość. Jednak keratynocyty leczone wysokim poziomem wapnia wykazywały zmniejszoną ekspresję P63, co wskazuje, że leczenie wysoką wartością wapnia hamuje geny związane z komórkami macierzystymi.Marker różnicowania keratyna 13 wykazywał rzadką ekspresję lub brak ekspresji we wczesnych i późnych pasażach, ale znaczącą ekspresję w leczeniu wysokowapniowym. Marker fibroblastów PDGFR alfa nie uległ ekspresji w hodowli keratynocytów, co wskazuje, że protokół ten może z powodzeniem wyizolować podstawowe keratynocyty i utrzymać te komórki w stanie niezróżnicowanym. Wychwytywanie należy rozpocząć od strony znieczulenia zewnątrzoponowego i trwać 10 minut na próbkę tkanki.Ogólnie rzecz biorąc, pipetowanie komórek jest ważne dla lepszej żywotności komórek. Po dwóch lub trzech przejściach doustny keratynocyt staje się stabilny do dalszych eksperymentów funkcjonalnych. Co ważne, protokół ten można połączyć z transgenicznym życiem myszy w celu przeprowadzenia testów komórkowych i molekularnych in vitro.Ostatnie badania wykazały dynamikę i niejednorodność podstawnych komórek macierzystych jamy ustnej. Metoda ta ułatwi badania biologii komórek macierzystych jamy ustnej i doprowadzi do lepszego zrozumienia chorób jamy ustnej.

isolation-culture-primary-oral-keratinocytes-from-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

W tym filmie opisujemy izolację komórek nabłonkowych z mysiego języka. Komórki te mogą być dalej hodowane, aby dać początek koloniom komórkowym.

Izolacja i hodowla komórek nabłonka języka myszy: procedura izolacji i hodowli komórek nabłonka języka z modelu mysiego

Ten film pokazuje zabieg chirurgiczny polegający na wypreparowaniu tkanki podniebienia z mysiego modelu.

Sekcja tkanki podniebienia z dorosłego modelu mysiego: zabieg chirurgiczny polegający na pobraniu podniebienia twardego i miękkiego z jamy ustnej dorosłej myszy

W tym filmie opisujemy izolację nabłonka brodawek okołokolacyjnych (CVP) od mysiego języka.

Izolacja nabłonka brodawek obwodowych (CVP) z modelu mysiego: procedura enzymatyczna mająca na celu oddzielenie nabłonka CVP od języka myszy

Ciągle rosnący siekacz myszy dostarcza modelu do badania odnawiania tkanek zębowych z komórek macierzystych nabłonka zębów (DESCs). Przedstawiono solidny system do konsekwentnego i niezawodnego pozyskiwania tych komórek z siekacza i namnażania ich in vitro.

Izolacja i hodowla komórek macierzystych nabłonka zębów z siekacza dorosłej myszy

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka dziąseł poprzez dodanie inhibitora Rocka, Y-27632, do metody tradycyjnej. Metoda ta jest łatwiejsza, mniej czasochłonna, poprawia właściwości komórek macierzystych i wytwarza większą liczbę komórek nabłonkowych o wysokim potencjale zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka dziąseł przy użyciu Y-27632

Przedstawiamy tutaj protokół izolacji, oczyszczania i hodowli pierwotnych komórek marginalnych z myszy stria vascularis oraz do tworzenia in vitro modeli stresu oksydacyjnego i starzenia komórkowego w celu badania zaburzeń ściany bocznej ślimaka.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek brzegowych prążkowania naczyniowego u noworodkowych myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy C57BL/6J. Protokół umożliwia utrzymanie komórek w stanie macierzystym do badań biologii komórek macierzystych jamy ustnej.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów jamy ustnej z podniebienia dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów