Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Neutrofile są komórkami nieuleczalnie zróżnicowanymi i obecnie nie ma linii komórkowych, które w pełni podsumowałyby biologię neutrofili. Dlatego konieczne jest uzyskanie czystych, inaktywowanych, zdrowych i świeżych neutrofili w celu zbadania ich biologii. Ta metoda odświeżania łączy gradient gęstości, sedymentację, delikatną lizę w celu uzyskania czystego preparatu neutrofilowego.

Jest łatwy w konfiguracji, wymaga prostego sprzętu i niewielkiej wprawy. Aspekt techniczny, taki jak nakładanie warstw gradientowych, tej metody będzie wymagał pewnej praktyki do opanowania, ale gdy gradient zostanie udoskonalony, inne kroki powinny przyjść z łatwością. Zacznij od wysterylizowania sierści buffy, opakowania i kaptura laminarnego.

Następnie dodaj 10 mililitrów krwi do 50-mililitrowej probówki. Aby rozcieńczyć krew w celu oczyszczenia gradientu, dodaj 5% FBS/HBSS i uzupełnij objętość do 35 mililitrów. Po zamknięciu wieczka należy kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania, a następnie trzymać probówkę do góry dnem, aby uzyskać dno pozbawione czerwonych krwinek.

Dodaj 10 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości bezpośrednio pod krwią, upewniając się, że pożywka i krew nie mieszają się, a granica faz pozostaje ostra. Kręć rurką 400 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, upewniając się, że hamulec jest wyłączony. Po wirowaniu obserwuj gradient podzielony na górną warstwę osocza surowicy, środkowy biały pierścień komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, warstwę pożywki o mętnym gradimencie gęstości i dolną osadkę składającą się z białego cienkiego pasma neutrofili na wierzchu czerwonych krwinek.

Aby usunąć PBMC, należy wsunąć pipetę ssącą bezpośrednio w warstwę PBMC i całkowicie zassać, podczas gdy warstwa osocza surowicy zmniejsza się wraz z usuwaniem pierścienia. Zeskrob bok rurki pipetą ssącą, aby zmaksymalizować usunięcie PBMC. Ostrożnie usunąć mętną warstwę pożywki gradientu gęstości między pierścieniem PBMC a osadem neutrofili/RBC.

Do sedymentacji erytrocytów użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść osad neutrofili/RBC do czystej probówki. Następnie dodaj 5% FBS/HBSS do końcowej objętości 25 mililitrów. Bezpośrednio dodaj 25 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu zawierającego 3% dekstranu/0,9% NaCl w wodzie do probówki i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.

Umieść rurkę na wypoziomowanej i niewibrującej powierzchni na 15 minut. Po umieszczeniu probówki z powrotem w kapturze, lekko zanurz pipetę w cieczy i zbierz około 30 mililitrów wierzchniej warstwy, podążając za powierzchnią cieczy w dół. Zakręć rurką, aby uzyskać czerwoną osadkę bez unoszących się cząstek w pożywce.

W celu lizy resztkowych erytrocytów należy delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu. Dodaj 25 milimetrów sterylnej ultraczystej wody bezpośrednio do probówki i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę przez 28 sekund, aby zlizować RBC. Następnie natychmiast dodaj 25 mililitrów sterylnego 1,8% roztworu NaCl przygotowanego w wodzie do probówki i doprowadź roztwór z powrotem do warunków izotonicznych poprzez delikatne mieszanie.

Obracaj probówkę z prędkością 200 g przez trzy do pięciu minut z niskim hamulcem, aby zminimalizować sedymentację RBC i płytek krwi z neutrofilami. W celu ponownego wymieszania białego osadu neutrofili należy bezpośrednio dodać pożywkę hodowlaną na osad, ale nie pipetować w górę i w dół. Następnie kołysz rurką poziomo z boku na bok, aby zminimalizować aktywację komórek.

Jeśli zaobserwuje się agregację lub zlepianie się komórek, przefiltruj zawiesinę komórek przez siatkę o wielkości 70 mikrometrów, aby odrzucić zbite neutrofile. W celu oceny jakości wyizolowanego preparatu neutrofili należy wybarwić komórki markerami specyficznymi dla neutrofili, eozynofili i markerem aktywacji. Po uzyskaniu 20 000 komórek za pomocą cytometrii przepływowej, przeanalizuj czystość i aktywację komórek przy użyciu strategii bramkowania i określ żywotność komórek za pomocą aneksyny V / jodku propidyny, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

Gradient gęstości przy niskiej prędkości dawał neutrofile o większej czystości, podczas gdy wysoka prędkość powodowała wzrost wydajności kosztem czystości. Korzystając z sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, sam rozkład komórek zapewnił oszacowanie jakości izolacji komórek, ale należy preferować stosowanie określonych markerów komórkowych. Zidentyfikowane zanieczyszczające populacje komórek to monocyty, limfocyty i eozynofile.

Ogromna wydajność neutrofili została osiągnięta przy użyciu tego protokołu. Oceniano ekspresję CD62L. Średnia intensywność fluorescencji dla CD62L była zmniejszona w komórkach kontroli pozytywnej, co wskazuje na wydalanie CD62L i aktywację neutrofili.

Przed wykonaniem testu należy ocenić stan zdrowia neutrofili, ponieważ neutrofile mają stosunkowo krótki okres półtrwania, a aktywacja dodatkowo skraca życie. Po oczyszczeniu neutrofili za pomocą gradientu gęstości i komercyjnych mikrogranulek, komórki hodowano przez 24 godziny, a przeżycie komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Kwantyfikacja żywych komórek wykazała, że oczyszczanie w gradiencie gęstości spowodowało uzyskanie większej liczby żywotnych komórek po 24 godzinach niż oczyszczanie przy użyciu zestawu.

Ważne jest, aby etapy warstwowania gradientowego i wirowania były wykonane tak dobrze, jak to możliwe, ponieważ będzie to miało duży wpływ na jakość preparatu. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić eksperymenty in vitro i testy biochemiczne. Selekcję negatywną można również przeprowadzić, jeśli wymagane są ultraczyste komórki, jak w eksperymentach z ekspresją cytokin i białek.