Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metod preparowania dorosłej nogi Drosophila. Technika ta usuwa część naskórka, odsłaniając leżącą pod spodem tkankę w sposób, który zachowuje architekturę neuronów i mięśni. Procedura ta pozwala nam scharakteryzować połączenie nerwowo-mięśniowe dla zidentyfikowanych altan neuronów ruchowych przy użyciu standardowych immunocytarnych technik chemicznych.

Sekcja jest szczególnie przydatna do badania powolnych zmian zwyrodnieniowych, które zachodzą w stosunkowo długich okresach czasu. Aspekt czasowy jest ważnym czynnikiem, ponieważ dobrze scharakteryzowane połączenie nerwowo-mięśniowe larw Drosophila jest stabilne przez około pięć do siedmiu dni przed rozpoczęciem metamorfozy. I odwrotnie, dorosłe neurony są obecne przez całe życie dorosłej muchy, około 90 dni w przypadku dzikiego, hodowanego w laboratorium Drosophila melanogaster.

Technika ta jest elastyczna i może być stosowana do wielu genotypów dla różnych modeli choroby i wykorzystywać szereg przeciwciał dostępnych dla Drosophila jako system modelowy. Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metod preparowania dorosłej nogi Drosophila. Technika ta usuwa część naskórka, odsłaniając leżącą pod spodem tkankę w sposób, który zachowuje architekturę neuronalną i mięśniową.

Za pomocą pędzla przenieś muchy do zimnego metanolu w szklanej studzience lub naczyniu na około 30 sekund do jednej minuty. Metanol rozpuszcza węglowodory kutykularne, a muchy mogą być teraz zanurzane, zamiast unosić się w roztworach wodnych. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś muchy do PBS.

Spłucz trzy razy w lodowatym PBS, aby usunąć nadmiar metanolu i trzymaj muchy w PBS na lodzie aż do rozbioru i utrwalenia. W tym momencie muchy powinny zostać wypreparowane i naprawione w jak najkrótszym czasie, najlepiej krótszym niż 30 minut. Przenieś muchy do naczynia preparacyjnego z elastomeru silikonowego wypełnionego zimnym PBS.

Usuń nogi śródpiersiowe przy koksie za pomocą dwóch par kleszczy Dumonta numer pięć lub przetnij nogi nożyczkami Vannas. Przenieś nogi do studzienki w plastikowej, 24-dołkowej płytce wypełnionej jednym mililem PBS i trzymaj płytkę na lodzie, aż wszystkie nogi zostaną usunięte i przeniesione do studzienek. Zazwyczaj używamy 20 nóg na studzienkę.

Zastąp roztwór PBS jednym mililitrowym roztworem FA i obracaj na nutatorze przez 30 minut. Ustawienie nutatora należy ustawić na średnią prędkość. Upewnij się, że w tym czasie nogi są całkowicie zanurzone w roztworze.

Aby usunąć roztwór FA, umyj szybko jeden mil PBS trzy razy, a następnie dodatkowe trzy płukania przez pięć minut każde w jednym mil PBS. Trzymaj tkanki w jednym mililitrze PBS na lodzie, przed i w trakcie etapów sekcji. Aby zapewnić krótki przegląd anatomii nóg Drosophila, wskazano segmenty nóg, w tym kokso, krętarz, kość udową, piszczel i pięć segmentów stępu.

Tutaj widzimy przedni widok nogi, rozpoznawany przez obecność czuciowego włosia, w przeciwieństwie do nagiego naskórka obecnego po tylnej stronie. Wskazano również orientację osi proksymalnej-dystalnej i osi grzbietowo-brzusznej. Ta procedura preparowania usuwa mały kawałek naskórka z bliższej części kości udowej, dzięki czemu można badać altanki aksonów, które wystają grzbietowo, unerwiając mięsień dźwigacza piszczeli.

Nasze wcześniejsze prace koncentrowały się na wskazanej altanie, pochodzącej z przypuszczalnej linii neuroblastów oka. W tej części zabiegu usuwamy naskórek z przedniej strony kości udowej. Kleszcze preparacyjne mają kluczowe znaczenie dla sukcesu i odkryliśmy, że wprowadzenie lekkiego zgięcia na końcu bardzo cienkich kleszczy numer pięć zapewnia skos, który pozwala na powierzchowne uchwycenie naskórka, a nie szturchanie, co może zniszczyć tkankę.

Przenieś nogi do naczynia z elastomeru silikonowego w PBS w celu rozwarstwienia. Za pomocą jednej pary kleszczy przypnij segment piszczeli do naczynia z elastomeru silikonowego, jak pokazano po prawej stronie. Używając innych kleszczy trzymanych ukośnie stroną do dołu, chwyć kawałek naskórka na dystalnym końcu kości udowej i pociągnij w kierunku bliższym w kierunku krętarza.

Kontynuuj metodyczne usuwanie naskórka, aż nagi mięsień będzie widoczny na całym bliższym końcu kości udowej. Po wycięciu wszystkich nóg zastąp PBS roztworem FA, aby postfix nogi przez 30 minut, potrząsając nutatorem ze średnią prędkością. Następnie przemyć próbki w jednym mililitrze PBS trzy razy szybko, a następnie trzy razy po pięć minut w roztworze PBT.

Aby zablokować tkanki, zastąp jeden mil PBT roztworem blokującym składającym się z jednego miliona 5% normalnej koziej surowicy rozcieńczonej w PBT. Inkubuj wypreparowane nogi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć roztwór blokujący i zastąpić go przeciwciałem pierwszorzędowym, które rozcieńcza się w roztworze blokującym.

Tutaj używamy dużych dysków anty w rozcieńczeniu od jednego do 200. Umieść płytki z powrotem na shakerze i inkubuj w temperaturze czterech stopni przez noc. Po inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych należy przemyć przeciwciała pierwszorzędowe w jednym mln PBT trzy razy krótko, a następnie trzy razy po 15 minut.

Ponownie zablokuj tkanki w jednym młynie 5% normalnej surowicy koziej przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć roztwór blokujący i dodać 300 mikrolitrów odpowiednich rozcieńczonych fluorescencyjnych sprzężonych przeciwciał drugorzędowych. Dodatkowo dodaj jedno do 2000 rozcieńczenia fluorescencji sprzężonej z falloidyną, aby oznaczyć mięśnie.

Aby inkubować, uszczelnij studzienki laboratoryjną taśmą uszczelniającą i pokrywką. Owiń również talerze folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed światłem. Inkubować przez sześć do ośmiu godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego należy przeprowadzić płukanie PBT w podobny sposób opisany wcześniej podczas przemywania przeciwciała pierwszorzędowego. Po tym kroku próbki są teraz gotowe do zamontowania i zobrazowania. Ułóż nogi przednią stroną do góry i w razie potrzeby przykryj dodatkowymi nośnikami montażowymi.

Delikatnie zeskrob rogi szkiełka nakrywkowego po glinianej kulce. Powstała glina posłuży jako przekładka między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym, aby tkanki nie zostały zgniecione. Dociśnij szkiełko nakrywkowe, aż dotknie górnej części nóg.

Uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci i przechowuj w czterech stopniach do momentu obrazowania. Obraz za pomocą mikroskopii konfokalnej z wykorzystaniem parametrów obrazowania opisanych w rozdziale czwartym pisemnego protokołu. Aby pomóc w walidacji protokołu sekcji, najpierw obrazujemy nogi za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego w małym powiększeniu.

Oto przykład na panelu A dobrego rozbioru po lewej stronie i złego rozbioru po prawej, w którym włókna mięśniowe zostały przerwane. Panel C pokazuje konfokalny obraz dobrego rozwarstwienia, w którym mięsień nie został przerwany. Natomiast panel D przedstawia nogę uszkodzoną podczas sekcji, w której brakuje włókien mięśniowych, jak wskazuje strzałka.

Tutaj zabarwiliśmy obrazowane nogi peroksydazą antychrzanową w celu wykrycia procesów neuronalnych, pokazanych tutaj na zielono, dużych dysków antysynucznych, co ułatwia grupowanie postsynaptycznych receptorów glutaminianu, pokazanych na czerwono, i falloidyny do oznaczania mięśni, pokazanej na niebiesko. Po uchwyceniu w 20-krotnym powiększeniu z kanałem światła przechodzącego łatwo jest zobaczyć wypreparowany obszar. Należy pamiętać, że przeciwciała częściowo przenikają do niewypreparowanych obszarów i można je zobaczyć przez naskórek, jak wskazuje biała strzałka.

Każdy z neuronów ruchowych nóg tworzy stereotypowe projekcje podczas unerwiania mięśni. Nasza praca koncentruje się na neuronach ruchowych unerwiających mięsień dźwigacza piszczelowego, pokazanych tutaj jako obszar pudełkowy i oznaczonych białą strzałką. Przy większym powiększeniu 60X z 2-krotnym zoomem w prawym górnym rogu, możemy skutecznie obrazować boutony, pokazane na zielono, oraz otaczające DLG pokazane na czerwono.

Dalsze zwiększanie powiększenia lub przechodzenie do obiektywu 100X pozwala na ilościowe określenie rozmiaru i morfologii butonu, jak pokazano w prawym dolnym rogu. Korzystając z tej techniki preparacji w połączeniu z immunocytochemią, stwierdziliśmy, że w zmutowanym modelu ALS sod1 występuje zależny od H obrzęk bouton, pokazany tutaj w starzejących się nogach H71Y, w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, jak wskazano strzałkami. Rozmiary botonów są określone ilościowo na wykresie roju pszczół po prawej stronie.

Ponadto stwierdziliśmy zmniejszenie markera strefy aktywnej Bruchpilot, pokazanego na czerwono, w słabo wybarwionych aksonach HRP, pokazanych na zielono, mutantów H71Y. Aby zbadać neurodegenerację, ubikwitynowane agregaty białkowe są często wykrywane przez przeciwciało FK2 i pokazane tutaj jako FK2-dodatnie puncta, w aksonach i mięśniach starzejących się muchów darniowych H71 po prawej stronie, oznaczonych strzałkami. Wreszcie, mitochondria można uwidocznić za pomocą immunocytochemii przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty ATP5a, jak pokazano tutaj na czerwono w mięśniu dźwigacza piszczeli

Odkryliśmy, że mitochondria powiększają się wraz z wiekiem u mutantów H71Y. Po opanowaniu, preparowany preparat nóg i związane z nim barwienie przeciwciałami pozwoli ci analizować zmiany molekularne w dorosłym połączeniu nerwowo-mięśniowym dla twojego ulubionego mutanta w różnych punktach czasowych.