Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki
12 lipca 2021
Celem metody jest badanie przesiewowe pod kątem hipertermii lub napadów wywołanych ciepłem w modelach mysich. Protokół opisuje użycie specjalnie zbudowanej komory z ciągłym monitorowaniem temperatury ciała w celu określenia, czy podwyższona temperatura ciała prowadzi do napadów.
Mutacje GEFS+ powodują drgawki gorączkowe u pacjentów. Możliwość badania napadów wywołanych hipotermią u myszy GEFS+ pozwala nam zbadać związek między określonymi mutacjami a profilem napadów. Cyfrowy regulator temperatury pomaga w powtarzalny sposób ustawić gradient temperatury w skrzynce grzewczej.
W ten sposób temperatura ciała myszy może być zwiększana w powolnym i stałym tempie. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji potencjalnych terapii, takich jak leki lub ograniczenia dietetyczne, które można zastosować w celu zmniejszenia lub wyeliminowania drgawek gorączkowych. Aby włożyć sondę temperatury doodbytniczej do myszy bez obrażeń, zalecamy krótkie znieczulenie myszy i nasmarowanie końcówki sondy doodbytniczej.
Zacznij od włączenia komory grzewczej myszy za pomocą przycisku włączania, a następnie naciśnij przycisk włączania grzania. Za pomocą klawiatury na cyfrowym regulatorze temperatury ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 stopni Celsjusza. Wyłóż podłogę komory grzewczej ściółką z kolb.
Zamontuj kamerę nagrywającą wideo przed komorą grzewczą. Wyłóż szalkę Petriego o średnicy 140 milimetrów grubymi warstwami bibuły i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca. W przypadku testu przesiewowego upewnij się, że masa ciała myszy wynosi 15 gramów lub więcej.
Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Pokryj metalową końcówkę sondy temperatury doodbytniczej smarem i delikatnie włóż ją do myszy. Przymocuj sondę doodbytniczą do ogona myszy za pomocą taśmy.
Umieść mysz w nowej klatce regeneracyjnej wyłożonej ściółką z kolb. Uruchom minutnik i obserwuj mysz przez pięć minut, monitorując temperaturę ciała, aż mysz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, a temperatura ustabilizuje się na poziomie od 35 do 36 stopni Celsjusza. Po upływie pięciu minut zanotuj temperaturę ciała myszy jako początkową temperaturę ciała w minucie zero.
Szybko przenieś mysz na podłogę podgrzanej komory grzewczej myszy, aby rozpocząć próbę eksperymentalną. Po umieszczeniu myszy w podgrzanej komorze myszy uruchom aparat i stoper, zwiększaj temperaturę komory grzewczej w regularnych odstępach czasu, tak aby temperatura ciała myszy rosła w tempie 25, 2,5 stopnia Celsjusza na minutę. Rozpocznij rejestrowanie temperatury ciała myszy w jednominutowych odstępach czasu na czas trwania eksperymentu.
Po 9,5 minuty ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 stopni Celsjusza, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej na poziomie 55 stopni Celsjusza do 10 minuty. Podobnie osiągnij stabilną temperaturę komory grzewczej do 60 stopni Celsjusza do 20 minuty. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 minut.
Jeśli u myszy wystąpi napad, zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu jako temperaturę progu drgawkowego. Zwróć uwagę na charakterystykę zachowania drgawkowego wyświetlaną przez mysz, a następnie szybko podnieś mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej. Jeśli mysz nie doświadczy napadów wywołanych ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 stopnie Celsjusza, umieść mysz na podkładce chłodzącej.
Gdy temperatura ciała myszy spadnie do 36 do 37 stopni Celsjusza, przenieś mysz do klatki regeneracyjnej. Aby wyjąć sondę doodbytniczą z myszy, ostrożnie przeciąć taśmę między ogonkiem myszy a drutem sondy doodbytniczej. Wytrzyj i wyczyść metalową końcówkę sondy doodbytniczej 70% etanolem.
Obserwuj mysz, aż wyzdrowieje, zanim wrócisz do klatki domowej. Monitoruj stan myszy. Zaznacz koniec próby eksperymentalnej.
Zresetuj temperaturę komory grzewczej myszy do 50 stopni Celsjusza i pozwól jej się zrównoważyć przed następnym testem. W teście napadów cieplnych średnia temperatura ciała myszy była rejestrowana co minutę przy użyciu protokołu ogrzewania i oceniano szybkość zmian temperatury ciała w czasie. Nie stwierdzono różnicy w szybkości zmian temperatury ciała między heterozygotycznymi zmutowanymi i dzikimi myszami w odpowiednich tłach genetycznych.
Grupy eksperymentalne i kontrolne myszy wykazywały różne zachowania pod wpływem okresowego wzrostu temperatury ciała. Wszystkie heterozygotyczne zmutowane myszy z tła genetycznego 129X1 lub B6NJ wykazywały napady wywołane ciepłem. Żadna z myszy typu dzikiego w wzbogaconym tle 129X1 nie doświadczyła napadów, podczas gdy tylko jedna trzecia myszy z wrażliwego na napady tła B6NJ wykazywała drgawki.
Średnia temperatura progu drgawkowego zmutowanych myszy 129X1 nie różniła się znacząco od średniej temperatury progu drgawkowego obserwowanej u myszy B6NJ. Jedna trzecia myszy typu dzikiego B6NJ, które wykazywały napady wywołane ciepłem, miała temperaturę progu drgawkowego, która była znacznie wyższa niż heterozygotyczne zmutowane myszy B6NJ. Nasilenie napadów mierzono za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a.
Maksymalny wynik Racine'a heterozygotycznych zmutowanych myszy na wzbogaconym tle 129X1 nie różnił się znacząco od heterozygotycznych zmutowanych myszy w tle genetycznym B6NJ. Podczas ustawiania protokołu ogrzewania upewnij się, że temperatura ciała myszy nie rośnie szybciej niż 25 stopni Celsjusza na minutę, ponieważ może to być szkodliwe dla zdrowia zwierzęcia. Byłoby bardzo fajnie połączyć protokół ogrzewania z jednoczesnymi zapisami EEG, co pozwoliłoby nam skorelować różne wzorce aktywności mózgu z różnymi typami zachowań napadowych.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ hipertermii na indukcję napadów w modelach mysich, koncentrując się w szczególności na mutacjach GEFS+. W celu ciągłego monitorowania temperatury ciała oraz oceny, czy podwyższona temperatura wywołuje napady, wykorzystano specjalnie skonstruowaną komorę grzewczą.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurobiologia behawioralna
- Badania nad napadami drgawkowymi
Wstęp
- Mutacje GEFS+ są powiązane z napadami gorączkowymi u pacjentów.
- Modele mysie GEFS+ pozwalają na badanie wpływu konkretnych mutacji na profil napadów.
- Zrozumienie napadów indukowanych ciepłem może pomóc w opracowaniu potencjalnych terapii napadów gorączkowych.
Cel badania
- Przesiewowe badanie napadów drgawek indukowanych hipertermią w modelach mysich.
- Określenie związku między mutacjami genetycznymi a podatnością na drgawki w warunkach podwyższonej temperatury.
- Identyfikacja potencjalnych terapii łagodzących drgawki gorączkowe.
Zastosowane metody
- Specjalnie skonstruowana komora cieplna do monitorowania temperatury ciała myszy podczas prób eksperymentalnych.
- Wykorzystanie modeli mysich GEFS+ z uwzględnieniem masy ciała oraz znieczulenia w celu uzyskania dokładnych pomiarów.
- Gradienty temperatury są ustawione tak, aby stopniowo zwiększać temperaturę ciała w celu oceny progów drgawek.
- Wprowadzono obserwacje wizualne i oceny behawioralne podczas 30-minutowego okresu próby.
Główne wyniki
- Napady indukowane ciepłem różniły się znacząco pomiędzy myszami mutantami heterozygotycznymi a myszami typu dzikiego.
- Średnie temperatury progu napadowego wykazały wyraźne różnice w zależności od tła genetycznego.
- Zarejestrowano charakterystykę zachowań podczas napadów, co pozwoliło na uzyskanie informacji o zmienności odpowiedzi na podwyższoną temperaturę.
Wnioski
- Badanie ustanawia metodologię oceny podatności na drgawki powiązanej z temperaturą w modelach mysich.
- Wyniki podkreślają wpływ genetyczny na progi drgawkowe i zachowania w warunkach hipertermii.
- Otrzymane dane przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw drgawek gorączkowych i mogą pomóc w opracowaniu podejść terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Metoda ta umożliwia powtarzalną, kontrolowaną temperaturowo indukcję napadów wywołanych ciepłem w modelach mysich, wspierając walidację celów w badaniach nad epilepsją. Zapewnia ona ilościowy screening behawioralny do oceny genetycznych modyfikatorów podatności na napady, pomagając w przedklinicznym ograniczaniu ryzyka w przypadku kandydatów na leki. Test ten ułatwia wczesną ocenę związków, które mogą modulować progi drgawek gorączkowych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w procesie odkrywania leków działających na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Analizuje zależności genotyp-fenotyp w epilepsjach związanych z genem SCN1A poprzez powiązanie konkretnych mutacji z fenotypami napadów indukowanych ciepłem.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów genetycznych dzięki standaryzowanym, mierzalnym pomiarom progu drgawkowego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez identyfikację tła genetycznego, które warunkuje różną podatność na napady w warunkach stresu hipertermicznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje dane typu dawka-odpowiedź poprzez korelację wzrostu temperatury ciała z wystąpieniem napadu, co umożliwia wyznaczenie progu pobudliwości.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, kompatybilne z wysoką przepustowością odczyty behawioralne dla kampanii przesiewowych związków chemicznych.
- Gotowość testu: Dostarcza zestandaryzowane wskaźniki ciężkości napadów za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a, co wspiera porównywalność między badaniami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Modeluje progresję drgawek gorączkowych u ludzi u myszy GEFS+, umożliwiając przedkliniczną ocenę interwencji modyfikujących przebieg choroby.
- Użyteczność przedkliniczna: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez identyfikację związków, które podnoszą próg drgawek lub zmniejszają ich nasilenie w modelach mutantów.
- Zgodność z biomarkerami: Ułatwia korelację termicznych progów drgawek z modyfikatorami genetycznymi, co dostarcza informacji dla strategii stratyfikacji pacjentów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków na epilepsję, od walidacji celu, poprzez optymalizację wiodących związków, aż po przedkliniczne badania skuteczności, szczególnie w przypadku modulatorów pobudliwości neuronalnej w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu konkretnych genów na próg drgawek w kontrolowanych paradygmatach wyzwania termicznego.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych parametrów początku drgawek do oceny bibliotek związków pod kątem aktywności przeciwdrgawkowej.
- Analityka: Pozwala na wyznaczenie temperatury progu drgawek oraz oceny ciężkości według skali Racine’a jako kluczowych odczytów dla analizy zależności dawka-odpowiedź i zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genetyczne w modelach mysich z ludzkimi fenotypami drgawek gorączkowych, wspierając przedkliniczną walidację powiązaną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy standaryzowaną platformę wyzwania termicznego, którą można zastosować w wielu modelach epilepsji i kampaniach przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach epilepsji poprzez wyizolowanie stresu termicznego jako zdefiniowanego czynnika wyzwalającego napady.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testu dzięki precyzyjnej kontroli temperatury i zestandaryzowanemu monitorowaniu behawioralnemu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację związków o efektach pośredniczonych przez cel w zakresie podatności na napady na etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z obszaru OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o efekty w genetycznie zdefiniowanych modelach napadów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z myszami, znieczulaniu oraz wprowadzaniu sondy temperatury do odbytu, aby zapewnić dobrostan zwierząt i rzetelność danych.
- Zależy od skalibrowanych komór grzewczych z cyfrowymi sterownikami temperatury i systemami wymuszonego obiegu powietrza w celu precyzyjnej kontroli rampy termicznej.
- Wymaga standaryzacji warunków środowiskowych (np. ściółka z kukurydzy, temperatura otoczenia), aby zminimalizować zmienność odpowiedzi termicznej.
- Wymaga koordynacji międzyzespołowej w zakresie behawiorystyki, farmakologii i genetyki w celu zapewnienia spójności oceny napadów i interpretacji danych.
- Ograniczone do modeli, w których ciepło jest istotnym czynnikiem wyzwalającym napady; nie dotyczy nietermicznych mechanizmów epilepsji bez wprowadzenia modyfikacji.
