Name: Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę behawioralnego badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach GEFS+ z wykorzystaniem komory grzewczej. Ta technika pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych na podatność na napady w warunkach hipertermii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Connorowi J. Smithowi za pomoc w budowie dostosowanej do potrzeb myszy komory grzewczej. Dziękujemy za pomoc członkom laboratorium O'Dowd, Lisha Zeng i Andrew Salgado, w standaryzacji protokołu ogrzewania na wczesnych etapach rozwoju testu. Dziękujemy również Danny'emu Benavidesowi i Kumarowi Perinbamowi za nagranie wideo części eksperymentalnej procedury do rękopisu. Praca ta została wsparta grantem NIH (NS083009) przyznanym D.O.D.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na University of California, Irvine.
1. Przygotowanie do testu drgawek indukowanych ciepłem
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk Power On w komorze grzewczej, a następnie przycisk Heat On.</li>
	<li>Ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 °C, korzystając z klawiatury cyfrowego sterownika temperatury.</li>
	<li>Odczekaj co najmniej 1 h, aby wstępnie podgrzać komorę do 50 °C przed wprowadzeniem do niej pierwszej myszy. Wstępne podgrzanie zapewnia równomierne ogrzewanie wnętrza komory.</li>
	<li>Wykłady dno komory grzewczej dla myszy ściółką z kukurydzy.</li>
	<li>Zamontuj kamerę wideo przed komorą grzewczą w celu rejestracji każdej próby testu drgawek wywołanych ciepłem.</li>
	<li>Wykładaj szalkę Petriego o średnicy 140 mm grubymi warstwami ręczników papierowych i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca. 
	UWAGA: Po zakończeniu testu każda mysz zostanie przeniesiona na schłodzoną podkładkę chłodzącą, aby pomóc w obniżeniu podwyższonej temperatury ciała.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy do badania drgawek indukowanych ciepłem
<ol>
	<li>Wybierz 10 dorosłych myszy (P30-P40), w tym 5 myszy posiadających mutację wywołującą epilepsję oraz 5 myszy typu dzikiego z tego samego miotu, do testu przesiewowego drgawek indukowanych ciepłem. 
	UWAGA: Myszy typu dzikiego, które nie posiadają mutacji wywołującej epilepsję, nie wykazują drgawek indukowanych ciepłem w temperaturach poniżej 44 °C i służą jako grupa kontrolna.</li>
	<li>Zważ każdą mysz przeznaczoną do testu przesiewowego i zapisz jej masę ciała. Do testu należy używać wyłącznie myszy o masie 15 g lub więcej.</li>
	<li>Badaj jedną mysz na raz w komorze cieplnej dla myszy.</li>
	<li>Krótko znieczul mysz przez 10-15 s, stosując kilka kropli izofluranu na dnie klosza.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z klosza i połóż je na ręczniku papierowym.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, sprawdzając, czy nie reaguje na bolesne uszczypnięcie palca u stopy.</li>
	<li>Pokryj metalową końcówkę sondy do pomiaru temperatury rektalnej środkiem nawilżającym (np. wazeliną) i delikatnie wprowadź ją do odbytu myszy na głębokość mniejszą lub równą 2 cm.</li>
	<li>Przymocuj sondę rektalną do ogona myszy za pomocą taśmy, aby sonda nie wypadła podczas testu. 
	UWAGA: Alternatywnie można umieścić zwierzę w stożku stabilizującym dla myszy i wprowadzić sondę do pomiaru temperatury rektalnej, a następnie przymocować ją taśmą do ogona.</li>
	<li>Upewnij się, że sonda rektalna jest podłączona do multimetru, który wyświetla wewnętrzną temperaturę ciała myszy.</li>
	<li>Umieść zwierzę w czystej klatce wyłożonej ściółką z kukurydzy, tzw. klatce rekonwalescencyjnej.</li>
	<li>Uruchom stoper i odczekaj 5 min. Obserwuj mysz, aż całkowicie wybudzi się z narkozy, stanie się aktywna i zacznie się pielęgnować.
	<ol>
		<li>Jednocześnie monitoruj temperaturę rdzeniową ciała myszy, aż ustabilizuje się ona na poziomie 35-36 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upływie 5 min zanotuj temperaturę ciała myszy. Jest to początkowa temperatura ciała w czasie „0” min. 
	UWAGA: Jeśli temperatura rdzeniowa ciała myszy jest niższa niż 35 °C, odczekaj dodatkowy czas, aż zwierzę wyjdzie z hipotermii wywołanej znieczuleniem.</li>
	<li>Szybko przenieś pojedynczą mysz do wstępnie podgrzanej komory dla myszy. Oznacza to POCZĄTEK próby eksperymentalnej. W danym czasie badana jest tylko jedna mysz.</li>
</ol>
3. Test drgawek indukowanych ciepłem
<ol>
	<li>Po delikatnym umieszczeniu myszy na dnie wstępnie podgrzanej komory grzewczej dla myszy, należy zamknąć pleksiglasowe drzwiczki i uruchomić kamerę w celu rejestracji wideo eksperymentu.</li>
	<li>Uruchom stoper. Rejestruj temperaturę ciała myszy za pomocą termometru rektalnego w odstępach 1-minutowych przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>W regularnych odstępach czasu zwiększaj temperaturę w komorze grzewczej dla myszy w taki sposób, aby temperatura ciała myszy wzrastała w tempie 0,25-0.5 °C /min. 
	UWAGA: Gwałtowne wzrosty temperatury ciała mogą prowadzić do udaru cieplnego lub śmierci i należy ich unikać.</li>
	<li>Postępując zgodnie z tym protokołem, należy zwiększyć temperaturę w komorze grzewczej dla myszy o 5 °C co 10 min, jak pokazano w Rycina 2A.</li>
	<li>W 9,5 min ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 °C, aby ustabilizować temperaturę w komorze grzewczej do 55 °C do 10.th min, zgodnie z odczytem na cyfrowym wyświetlaczu temperatury.</li>
	<li>W podobny sposób zwiększyć temperaturę do 60 °C w 19,5 min, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej do 60 °C do 20. dniath min. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 min.</li>
	<li>Jeśli u myszy wystąpi napad (wokalizacja, kiwanie głową, klonus przednich kończyn, wyprost tylnych kończyn, upadek na bok lub uogólnione drgawki toniczno-kloniczne), należy zapisać następujące informacje.
	<ol>
		<li>Zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu (temperaturę progu napadowego), odczytaną z termometru rektalnego.</li>
		<li>Należy zarejestrować charakterystykę zachowań drgawkowych myszy, takich jak kiwanie głową, klonus kończyn przednich, wyprost kończyn tylnych, upadek na bok i/lub uogólnione napady toniczno-kloniczne (GTCS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko, lecz delikatnie wyjmij mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej przygotowanej w kroku 1.6. 
	UWAGA: W przypadku wystąpienia u myszy drgawek stopnia 5 w skali Racine'a objawiających się niekontrolowanymi skokami, wyjęcie zwierzęcia z komory grzewczej i przeniesienie go na podkładkę chłodzącą na zewnątrz może być utrudnione. Typowy napad drgawek wywołany ciepłem trwa jednak od 30 do 60 s. W związku z tym mysz należy wyjąć z komory grzewczej i umieścić na podkładce chłodzącej w ciągu 60 s od rozpoczęcia epizodu drgawek wywołanych ciepłem.</li>
	<li>Należy odczekać, aż temperatura ciała myszy spadnie do 36-37 °Cprzed przeniesieniem go do klatki regeneracyjnej. W klatce regeneracyjnej umieszcza się tylko jedną mysz jednocześnie. 
	UWAGA: Nie należy mieszać myszy, które nie zostały jeszcze poddane przesiewowej indukcji cieplnej, z myszą, u której przeprowadzono już próbę eksperymentu z drgawkami indukowanymi cieplnie.</li>
	<li>Ostrożnie i delikatnie przetnij nożyczkami taśmę znajdującą się między ogonem myszy a przewodem sondy rektalnej, aby usunąć sondę z organizmu myszy.</li>
	<li>Przetrzyj metalową końcówkę sondy rektalnej 70% alkoholem i miękkimi chusteczkami, aby przygotować ją do kolejnej próby.</li>
	<li>Należy kontynuować obserwację myszy w klatce rekonwalescencyjnej do momentu powrotu do normalnej aktywności (chodzenie, pielęgnacja futra itp.), a następnie przenieść zwierzę z powrotem do klatki macierzystej. Oznacza to ZAKOŃCZENIE próby eksperymentalnej dla tej myszy.</li>
	<li>Odnotuj stan zwierzęcia po przeprowadzeniu testu – czy przeżyło i doszło do regeneracji po sesji badawczej, czy też padło. Silne napady drgawek objawiające się niekontrolowanym skakaniem oraz uogólnione napady toniczno-kloniczne mogą czasami prowadzić do śmierci myszy.</li>
	<li>Jeśli u myszy nie wystąpią napady indukowane ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 °Cwyjmij mysz z komory grzewczej i umieść ją na podkładce chłodzącej, aż temperatura ciała myszy powróci do 36-37 °C.</li>
	<li>Zresetuj temperaturę komory grzewczej dla myszy do 50 °C i pozostawić do wyrównania temperatury, aż na wyświetlaczu cyfrowego regulatora temperatury pojawi się wartość 50 °C.</li>
	<li>Wymieniaj ściółkę z kukurydzy pomiędzy poszczególnymi próbami z udziałem myszy.</li>
	<li>Przygotować kolejną mysz do badania przesiewowego zgodnie z opisem w sekcji 2 i powtórzyć kroki z sekcji 3.</li>
</ol>
4. Eutanazja zwierząt
<ol>
	<li>Choć większość zwierząt dochodzi do siebie po napadach wywołanych ciepłem, w naszym doświadczeniu u kilku myszy dochodzi do SUDEP (nagłej nieoczekiwanej śmierci w epilepsji) w klatce domowej w ciągu 24-48 h od wystąpienia napadów wywołanych ciepłem. Po zakończeniu indywidualnego screeningu wszystkich myszy pod kątem napadów wywołanych ciepłem po 30 min próbie, należy uśmiercić wszystkie myszy zgodnie z wytycznymi IACUC danej instytucji.</li>
</ol>
5. Analiza danych dotyczących napadów wywołanych ciepłem
<ol>
	<li>Po zakończeniu przesiewu kohorty zwierząt, oblicz procent myszy o danym genotypie wykazujących drgawki, korzystając z następującego wzoru: 
	<img alt="Wzór obliczania procentu w schemacie eksperymentu drgawek indukowanych ciepłem u myszy." src="/files/ftp_upload/62846/62846eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"></li>
	<li>Oszacuj średnią temperaturę progu drgawek dla myszy o danym genotypie, wyciągając średnią z temperatur progu drgawek wszystkich myszy (odnotowanych w kroku 3.7) w tym genotypie, które wykazują drgawki indukowane ciepłem.</li>
	<li>Zachowując ślepą próbę w odniesieniu do tożsamości i genotypu, odtwórz nagrania wideo każdej myszy z przesiewowego testu drgawek indukowanych ciepłem na ekranie komputera, aby ocenić nasilenie napadów drgawek.</li>
	<li>Przypisz oceny poszczególnym myszom wykazującym zachowania drgawkowe indukowane ciepłem, korzystając z zmodyfikowanej skali Racine13, zgodnie z opisem w poprzednich badaniach13,14. Szczegóły znajdują się w Tabeli 1.</li>
	<li>Jeśli mysz podczas drgawek indukowanych ciepłem wykazuje jedynie potakiwanie głową, przypisz jej ocenę 2. Jeśli mysz rozpoczyna epizod drgawek od potakiwania głową, ale wykazuje również klonus kończyn przednich, upadki i/lub skakanie, przypisz jej ocenę 5.</li>
	<li>Zanotuj maksymalną ocenę dla każdej myszy według zmodyfikowanej skali Racine13, zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Wykreśl wykres rozrzutu maksymalnych ocen Racine uzyskanych przez wszystkie myszy o danym genotypie.</li>
	<li>Statystycznie porównaj maksymalne oceny Racine pomiędzy różnymi grupami myszy jako metodę określenia nasilenia drgawek behawioralnych, takich jak drgawki indukowane ciepłem. 
	UWAGA: Oceny Racine są pomocne w porównywaniu charakterystyki drgawek między różnymi grupami myszy mutantów lub genotypami. Przewiduje się, że myszy typu dzikiego nie będą miały drgawek indukowanych ciepłem i nie będą musiały być uwzględniane w porównaniach ocen Racine.</li>
	<li>W zależności od projektu eksperymentalnego przeprowadź odpowiednią analizę statystyczną, aby określić, czy procent myszy wykazujących drgawki pomiędzy myszami typu dzikiego a mutantami oraz ich średnie wartości temperatury progu drgawek różnią się od siebie w sposób istotny statystycznie.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Skala Racine'a</td>
			<td colspan="3">Charakterystyka napadów drgawkowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="3">Brak napadów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Ruchy ust i twarzy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="3">Potakiwanie głową</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="3">Klonus kończyny przedniej, zazwyczaj jednej kończyny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="3">Klonus kończyn przednich z unoszeniem ciała</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="3">Uogólniony napad drgawkowy w formie toniczno-klonicznej, wstawanie na tylnych łapach, skakanie, upadanie</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skale Racine'a.

<ol><li>Hirtz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+common+are+the+%27common%27+neurologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">How common are the 'common' neurologic disorders.</a> Neurology. 68, 326-337 (2007).</li>
<li>Catterall, W. A. Sodium Channel Mutations and Epilepsy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCatterall%2C+WA+%22Jasper%27s+Basic+Mechanisms+of+the+Epilepsies%22">Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies</a>. , Center for Biotechnology Information. US. Internet (2012).</li>
<li>Mantegazza, M., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCN+1A+%2FNa+V+1.1+channelopathies%3A+Mechanisms+in+expression+systems%2C+animal+models%2C+and+human+iPSC+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">SCN 1A /Na V 1.1 channelopathies: Mechanisms in expression systems, animal models, and human iPSC models.</a> Epilepsia. 60, (2019).</li>
<li>Stafstrom, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+Sodium+Current+and+Its+Role+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Currents%22%5BJournal%5D)">Persistent Sodium Current and Its Role in Epilepsy.</a> Epilepsy Currents. 7, 15-22 (2007).</li>
<li>Schutte, S. S., Schutte, R. J., Barragan, E. V., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+studying+cellular+mechanisms+of+SCN1A-related+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Model systems for studying cellular mechanisms of SCN1A-related epilepsy.</a> Journal of Neurophysiology. 115, 1755-1766 (2016).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+Channel+Genes+and+Epilepsy%3A+Functional+Alteration%2C+Pathogenic+Potential%2C+and+Mechanism+of+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Ion Channel Genes and Epilepsy: Functional Alteration, Pathogenic Potential, and Mechanism of Epilepsy.</a> Neuroscience Bulletin. 33, 455-477 (2017).</li>
<li>Abou-Khalil, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+and+generalized+epilepsy+with+febrile+seizures+plus+and+a+novel+SCN1A+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Partial and generalized epilepsy with febrile seizures plus and a novel SCN1A mutation.</a> Neurology. 57, 2265-2272 (2001).</li>
<li>Zhang, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epilepsy+with+febrile+seizures+plus%3A+Refining+the+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetic epilepsy with febrile seizures plus: Refining the spectrum.</a> Neurology. 89, 1210-1219 (2017).</li>
<li>Patterson, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enduring+memory+impairments+provoked+by+developmental+febrile+seizures+are+mediated+by+functional+and+structural+effects+of+neuronal+restrictive+silencing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enduring memory impairments provoked by developmental febrile seizures are mediated by functional and structural effects of neuronal restrictive silencing factor.</a> Journal of Neuroscience. 37, 3799-3812 (2017).</li>
<li>Rossi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCN1A+and+febrile+seizures+in+mesial+temporal+epilepsy%3A+An+early+signal+to+guide+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Currents%22%5BJournal%5D)">SCN1A and febrile seizures in mesial temporal epilepsy: An early signal to guide prognosis and treatment.</a> Epilepsy Currents. 14, 189-190 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gut+microbiome+composition+in+children+with+refractory+epilepsy+after+ketogenic+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Altered gut microbiome composition in children with refractory epilepsy after ketogenic diet.</a> Epilepsy Research. 145, 163-168 (2018).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCN1A+mutation+database%3A+Updating+information+and+analysis+of+the+relationships+among+genotype%2C+functional+alteration%2C+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">The SCN1A mutation database: Updating information and analysis of the relationships among genotype, functional alteration, and phenotype.</a> Human Mutation. 36, 573-580 (2015).</li>
<li>Cheah, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+deletion+of+NaV1.1+sodium+channels+in+inhibitory+interneurons+causes+seizures+and+premature+death+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+dysfunction+in+a+new+mouse+model+of+SCN1A+GEFS%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Interneuron dysfunction in a new mouse model of SCN1A GEFS.</a> eNeuro. , (2021).</li>
<li>Kalume, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+unexpected+death+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Sudden unexpected death in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Clinical Investigations. 123, 1798-1808 (2013).</li>
<li>Martin, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+function+of+the+SCN1A+voltage-gated+sodium+channel+leads+to+gamma-aminobutyric+acid-ergic+%28GABAergic%29+interneuron+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Altered function of the SCN1A voltage-gated sodium channel leads to gamma-aminobutyric acid-ergic (GABAergic) interneuron abnormalities.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 9823-9834 (2010).</li>
<li>Rubinstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+phenotypes+of+Dravet+syndrome+by+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Dissecting the phenotypes of Dravet syndrome by gene deletion.</a> Brain. 138, 2219-2233 (2015).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nature Neuroscience. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Dutton, S. B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+febrile+seizures+worsen+adult+phenotypes+in+Scn1a+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Early-life febrile seizures worsen adult phenotypes in Scn1a mutants.</a> Experimental Neurology. 293, 159-171 (2017).</li>
<li>Cheah, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+deletion+of+NaV1.1+sodium+channels+in+inhibitory+interneurons+causes+seizures+and+premature+death+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Specific deletion of NaV1.1 sodium channels in inhibitory interneurons causes seizures and premature death in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 109, 14646-14651 (2012).</li>
<li>Oakley, J. C., Cho, A. R., Cheah, C. S., Scheuer, T., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+GABA-enhancing+therapy+against+seizures+in+a+mouse+model+of+Dravet+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Synergistic GABA-enhancing therapy against seizures in a mouse model of Dravet Syndrome.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 345, 215-224 (2013).</li>
<li>Ricobaraza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+and+neuropsychiatric+comorbidities+in+mice+carrying+a+recurrent+Dravet+syndrome+SCN1A+missense+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epilepsy and neuropsychiatric comorbidities in mice carrying a recurrent Dravet syndrome SCN1A missense mutation.</a> Scientific Reports. 9, (2019).</li>
<li>Warner, T. A., Liu, Z., Macdonald, R. L., Kang, J. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+induced+temperature+dysregulation+and+seizures+in+Dravet+Syndrome%2FGEFS%2B+Gabrg2%2B%2FQ390X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Research%22%5BJournal%5D)">Heat induced temperature dysregulation and seizures in Dravet Syndrome/GEFS+ Gabrg2+/Q390X mice.</a> Epilepsy Research. 134, 1-8 (2017).</li>
<li>Eun, B. -L., Abraham, J., Mlsna, L., Kim, M. J., Koh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+potentiates+hyperthermia-induced+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide potentiates hyperthermia-induced seizures.</a> Brain and Behavior. 5, 00348(2015).</li>
<li>Miller, A. R., Hawkins, N. A., McCollom, C. E., Kearney, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+genetic+modifiers+of+survival+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Mapping genetic modifiers of survival in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Genes Brain and Behavior. 13, 163-172 (2013).</li>
<li>Mistry, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-+and+age-dependent+hippocampal+neuron+sodium+currents+correlate+with+epilepsy+severity+in+Dravet+syndrome+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Strain- and age-dependent hippocampal neuron sodium currents correlate with epilepsy severity in Dravet syndrome mice.</a> Neurobiology of Disease. 65, 1-11 (2014).</li>
<li>Ogiwara, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nav1.1+localizes+to+axons+of+parvalbumin-positive+inhibitory+interneurons%3A+a+circuit+basis+for+epileptic+seizures+in+mice+carrying+an+Scn1a+gene+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nav1.1 localizes to axons of parvalbumin-positive inhibitory interneurons: a circuit basis for epileptic seizures in mice carrying an Scn1a gene mutation.</a> Journal of Neuroscience. 27, 5903-5914 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisujemy prosty i skuteczny protokół badań przesiewowych pod kątem występowania napadów wywołanych ciepłem u myszy, behawioralnego odpowiednika napadów gorączkowych u ludzi. Test ocenia kilka parametrów - w tym odsetek myszy wykazujących drgawki, próg drgawkowy, nasilenie napadów w skali Racine'a, w celu porównania wrażliwości grup kontrolnych i testowych myszy na wzrost temperatury ciała.
Krytycznym krokiem w tym protokole jest zwiększenie ciepła w komorze przy jednoczesnym ciągłym monitorowaniu temperatury ciała myszy. Konieczne jest, aby maksymalna temperatura ciała, jakiej doświadczą myszy w tych testach, wynosiła 44 °C, ponieważ zwierzęta typu dzikiego mogą doświadczać napadów wywołanych ciepłem w temperaturze ciała >44 °C. Wstępne leczenie znieczuleniem ogólnym lub środkami przeciwbólowymi może obniżyć temperaturę ciała zwierząt lub zakłócić termoregulację, co z kolei zakłóciłoby gromadzenie danych o temperaturze progu drgawkowego. W związku z tym myszy objęte tym protokołem przesiewowym nie mogły być zaopatrzone w te środki podczas 30-minutowego okna próbnego. Wszystkie procedury muszą zostać zatwierdzone przez komitet IACUC danej instytucji. Aby zapewnić ciągłe monitorowanie temperatury wewnętrznej ciała myszy podczas testu, bezpiecznie przyklej sondę temperatury doodbytnicy do ogona myszy. Jeśli podczas testu okaże się, że temperatura ciała myszy pozostaje niezmieniona przez dłuższy czas, nawet po zwiększeniu temperatury komory myszy, upewnij się, że sonda temperatury w odbycie nie wyszła z myszy lub jest luźno przymocowana do ogona.
Tło genetyczne modeli mysich może wpływać na wrażliwość na mutację SCN1A i napady farmakologicznie wywołane 18,25,26,27. Jak omówiono w powyższych wynikach, tło genetyczne myszy może wpływać na ich podatność na napady wywołane upałem. SCN1a powiedział: Myszy z mutacją K1270T GEFS + testowano w dwóch tłach genetycznych - 129X1 i B6NJ, a niewielki odsetek myszy typu dzikiego (33%) w tle wrażliwym na napady B6NJ również zaobserwowano, że przechodzą napady wywołane ciepłem. Jednak w porównaniu z heterozygotycznymi zmutowanymi myszami Scn1a KT/+, myszy typu dzikiego B6NJ doświadczyły napadów padaczkowych wywołanych ciepłem przy znacznie wyższym progu temperatury. Potwierdza to, że mutacja genetyczna (Scn1a K1270T), która została wprowadzona przez CRISPR knock-in, sprawia, że zmutowane myszy są bardziej podatne na napady wywołane hipertermią.
Istnieje kilka zalet przyjęcia tego protokołu, które podsumowano poniżej. Po pierwsze, w przeciwieństwie do użycia strumienia suchego powietrza lub podgrzewanych lamp, wymuszone powietrze o kontrolowanej temperaturze ustawione w zamkniętej przestrzeni zapewnia eksperymentatorowi większą kontrolę nad nagrzewaniem się areny testowej w pożądanym tempie. Kroki w protokole ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zwiększyć/zmniejszyć temperaturę początkową, czas trwania każdego kroku itp., Aby przebadać starsze myszy, które są cięższymi lub większymi gryzoniami, takimi jak szczury. Po drugie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała myszy za pomocą dołączonej sondy doodbytniczej dostarcza cennych informacji na temat tempa zmian temperatury ciała u poszczególnych myszy podczas całego testu. Pozwala to eksperymentatorowi na dokładną obserwację, że szybkość zmian temperatury u myszy nie przekracza 0,25-0,5 °C/min (co może być stresujące dla zwierząt), podczas adaptacji tego protokołu do innych aren testowych. Co ważne, tempo zmian temperatury ciała w czasie w różnych grupach myszy może rzucić światło na ich zdolność do termoregulacji i może być pomocne w zrozumieniu, czy drgawki gorączkowe powodujące mutacje zmieniają również termoregulację u myszy. Po trzecie, ciągłe monitorowanie temperatury ciała zapewnia, że pomiary temperatury progu drgawkowego przy użyciu tego protokołu są dokładne, ponieważ są rejestrowane jednocześnie z pierwszym atakiem drgawkowym, którego doświadczyła mysz. Jeśli temperatura ciała zwierzęcia nie jest stale monitorowana lub temperatura progu drgawkowego nie jest mierzona po wyjęciu zwierzęcia z areny testowej, wartości progu drgawkowego mogą się różnić ze względu na czas potrzebny na postępowanie z myszami po napadach. Wreszcie, metoda ta omija potrzebę stosowania inwazyjnych metod wywoływania gorączki (poprzez wstrzykiwanie patogenów) u myszy w celu naśladowania drgawek gorączkowych u ludzi.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że trudno jest przebadać młode myszy (w wieku poniżej P30) pod kątem napadów wywołanych upałem. Protokół został opracowany w celu badania przesiewowego wrażliwości dorosłych myszy (P30-P40 i powyżej) na napady wywołane ciepłem lub hipertermią. Z naszego doświadczenia wynika, że młodsze myszy typu dzikiego, zwłaszcza te ważące poniżej 15 g, są bardziej narażone na napady wywołane ciepłem, które mogą być spowodowane słabo rozwiniętymi mechanizmami termoregulacji, fizjologicznym stresem termicznym lub kombinacją obu. W związku z tym nie jest idealnym rozwiązaniem wykonywanie badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem u młodych myszy przy użyciu tego protokołu.
Przyszłe badania, które łączą monitorowanie EEG podczas poddawania myszy napadom wywołanym ciepłem, mogą rzucić światło na wzorce napadów EEG wywołanych upałem, podobnie jak w poprzednim badaniu19. Aktywność neuronalną w określonych obszarach mózgu myszy można śledzić, łącząc podejścia optogenetyczne i badania immunohistochemiczne po pobraniu tkanki mózgowej. Ponadto wpływ restrykcyjnych diet, takich jak dieta ketonowa, na zmniejszenie drgawek gorączkowych można ocenić, poddając myszy karmione keto i normalne myszy karmione karmą protokołowi napadów wywołanych upałem. Podobnie, paradygmaty badań przesiewowych leków na padaczkę mogą zostać opracowane w celu przetestowania i zidentyfikowania potencjalnych leków przeciwpadaczkowych, które łagodzą lub tłumią napady wywołane ciepłem u myszy karmionych lub leczonych lekiem w porównaniu z myszami karmionymi nośnikiem lub kontrolnymi.

Epilepsja, będąca czwartą pod względem częstotliwości występowania grupą zaburzeń neurologicznych w Stanach Zjednoczonych1, charakteryzuje się brakiem równowagi między pobudzeniem a hamowaniem w OUN, co prowadzi do nawracających napadów. Napady gorączkowe (FS) lub napady związane z gorączką mogą występować w populacji ogólnej, najczęściej u dzieci od 3. miesiąca życia do 6–7 roku życia. Jednak u niektórych osób z mutacjami genetycznymi, najczęściej w genie kanału sodowego, FS mogą utrzymywać się powyżej 7. roku życia, aż do dorosłości. Stan ten określa się jako zespół napadów gorączkowych plus lub FS+. Szybki postęp w sekwencjonowaniu genomu pozwolił na zidentyfikowanie ponad 1300 mutacji w ludzkim genie kanału jonowego sodu SCN1A, co czyni go głównym obszarem mutacji odpowiedzialnych za epilepsję. Mutacje SCN1A zostały powiązane z szerokim spektrum zaburzeń napadowych, w tym z napadami gorączkowymi (FS), genetyczną epilepsją z napadami gorączkowymi plus (GEFS+) oraz zespołem Dravet (DS)2,3,4,5,6. Około 20% mutacji missense w genie SCN1A prowadzi do GEFS+5,7,8. Pediatryczny wywiad w kierunku złożonych lub przedłużających się napadów FS w dzieciństwie może w дальнейшем rozwinąć się w bardziej wyniszczające formy epilepsji, takie jak epilepsja płata skroniowego (TLE)9,10,11. Zespół Dravet wynika z mutacji trunkujących lub mutacji powodujących utratę funkcji w genie SCN1A i jest ciężką postacią epilepsji lekoopornej, z dziecięcym początkiem w postaci napadów gorączkowych, które przekształcają się w napady refrakteryjne, często współwystępując z zaburzeniami poznawczymi, rozwojowymi i motorycznymi2,5,12. Ponieważ wiele osób z GEFS+ i/lub DS wykazuje napady gorączkowe, opracowanie nowych terapii w celu lepszego zwalczania tych zaburzeń napadowych staje się kwestią kluczową.
Modele zwierzęce epilepsji związanej z SCN1A okazały się nieocenione w charakteryzacji różnych typów napadów (gorączkowych w porównaniu z uogólnionymi) oraz w analizie neuronalnych mechanizmów powstawania napadów13,14,15,16,17,18. Choć badanie napadów spontanicznych za pomocą rejestracji EEG/EMG z mózgów gryzoni jest dobrze ugruntowane i stanowi bardzo użyteczne narzędzie, tylko nieliczne badania podjęły próbę odwzorowania napadów gorączkowych w modelach mysich14,16,19,20,21,22,23. W poprzednich badaniach, w celu wywołania napadów poprzez hipertermię, stosowano strumień podgrzanego suchego powietrza, cylinder z metakrylanu wyposażony w system termiczny lub lampy grzewcze z kontrolerem temperatury w zamkniętych arenach testowych9,16,21,22,23,24. Aby zwiększyć temperaturę ciała w bardziej kontrolowanym środowisku, w opisanym tutaj protokole zastosowano specjalnie zbudowaną komorę z systemem grzewczym z regulacją temperatury, co pozwoliło na uzyskanie powtarzalnych prędkości wzrostu temperatury ciała myszy znajdującej się wewnątrz komory. Komora grzewcza została wykonana z drewna (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) i wyposażona w cyfrowy kontroler temperatury z termoparą typu K. Mały wentylator osiowy z grzałką, zamontowany na tylnym panelu komory, kieruje do jej wnętrza podgrzane powietrze, którego przepływ jest regulowany przez cyfrowy kontroler temperatury. Ten wymuszony system grzania powietrzem umożliwia kontrolowanie tempa wzrostu temperatury w komorze (Rysunek 1A,B). Termopara typu K znajdująca się wewnątrz drewnianej komory grzewczej przesyła sygnał zwrotny do cyfrowego kontrolera temperatury, aby utrzymać stałą temperaturę wewnątrz skrzynki podczas testu. Ustawienie temperatury na cyfrowym kontrolerze temperatury umożliwia wentylatorowi elektrycznemu tłoczenie podgrzanego powietrza przez otwory wentylacyjne, co zapewnia równomierne ogrzanie komory (Rysunek 1A). Przedni panel komory grzewczej stanowi przezroczysta płyta z pleksiglasu, co umożliwia łatwe nagrywanie wideo przeprowadzanych prób.
Do każdego eksperymentu wybrano dorosłe myszy (P30-P40), heterozygotyczne pod kątem mutacji missense w genie SCN1A wywołującej GEFS+, oraz równą liczbę myszy typu dzikiego z tego samego miotu, które służyły jako grupa kontrolna. Zwierzęta obu płci wykorzystane w tych badaniach ważyły co najmniej 15 g, ponieważ myszy typu dzikiego o mniejszej masie były bardziej podatne na drgawki indukowane ciepłem niż cięższe zwierzęta w tym samym wieku. W badaniu pilotażowym zaobserwowano, że zarówno myszy mutanty, jak i typu dzikiego poszukiwały chłodniejszych narożników komory z tyłu i pozostawały w nich przez dłuższy czas. Aby temu zapobiec, efektywna powierzchnia podłogi wewnątrz areny testowej komory grzewczej została zredukowana do wymiarów 16,5 cm długości x 21,5 cm szerokości x 27,5 cm wysokości poprzez umieszczenie drewnianego bloku B (wymiary 20 cm x 8 cm x 7,2 cm) po prawej stronie komory (Rycina 1A). Komora grzewcza została wykonana z przekładki sklejki o grubości 1,9 cm (długość 40 cm x szerokość 34 cm x wysokość 31 cm) pokrytej białym laminatem i wyposażona w cyfrowy kontroler temperatury z termoparą typu K. Laminowana powierzchnia ścian komory jest nieprzepuszczalna i może być łatwo dezynfekowana pomiędzy próbami poprzez przecieranie 70% etanolem. Temperaturę w komorze grzewczej początkowo ustawiono na 50 °C i podgrzewano przez co najmniej 1 h przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapewnić równomierne nagrzanie wnętrza komory. Każda mysz została wyposażona w termometr rektalny do ciągłego monitorowania temperatury ciała podczas całego eksperymentu. Do komory wprowadzano pojedynczo jedną mysz, a temperaturę utrzymywano na poziomie 50 °C od 1st do 10th minuty. Następnie temperaturę podniesiono do 55 °C w 11th-20th minucie, a na koniec do 60 °C w 21st-30th minucie. Przyniosło to powtarzalne tempo wzrostu temperatury ciała myszy (Rycina 2A). Każda próba została zarejestrowana wideo, a analiza behawioralna była przeprowadzana w trybie offline.
Protokół ogrzewania można łatwo zmodyfikować, aby zmienić temperaturę początkową komory grzewczej oraz tempo jej nagrzewania, co z kolei wpływa na szybkość wzrostu temperatury ciała myszy podczas badania. Dzięki temu metoda ta zapewnia większą elastyczność w porównaniu z tradycyjnymi metodami przy opracowywaniu testów behawioralnych obejmujących drgawki indukowane ciepłem. Protokół drgawek indukowanych ciepłem może być również wykorzystany do przesiewania leków przeciwpadaczkowych, które zwiększają odporność myszy mutantów na drgawki indukowane ciepłem lub podnoszą temperaturę progową, przy której obserwuje się drgawki. Podobnie można badać korzystny wpływ ograniczających reżimów dietetycznych, takich jak dieta ketogeniczna, na drgawki indukowane ciepłem, porównując myszy karmione standardową karmą z myszami na diecie ketogenicznej.
<img alt="Układ komory kontroli termicznej z regulatorem temperatury; schemat przedstawia kierunki przepływu powietrza i ścieżki okablowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62846/62846fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Opis zbudowanej na zamówienie komory grzewczej dla myszy. (A) Przedni panel drewnianej komory grzewczej dla myszy przedstawia boczny panel sterowania zawierający przełącznik zasilania (Power ON/OFF), który włącza cyfrowy regulator temperatury, termoparę typu K, przełącznik włącznik/wyłącznik grzejnika z wentylatorem oraz wskaźnik grzania. Wymiary zewnętrzne skrzyni oraz wewnętrznej areny testowej podano w cm. Przedstawiono również drewniany blok B, służący do efektywnej redukcji powierzchni areny testowej. Dno areny testowej wyłożone jest ściółką z kukurydzy, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z podgrzanymi drewnianymi powierzchniami. (B) Tylny panel komory grzewczej przedstawia wentylator zamontowany w górnym otworze wentylacyjnym oraz przewód zasilający dostarczający energię elektryczną do komory. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Ryciny 3 z pracy Das et al., 2021, eNeuro14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62846/62846fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Wentylator osiowy</td><td>Farnam</td><td>AF20-200-120-xx10-3.1</td><td>Produkty niestandardowe Farnam -Osiowa nagrzewnica z wentylatorem</td></tr><tr><td>Cyfrowy regulator temperatury</td><td>Inkbird</td><td>ITC-100RH</td><td>Cyfrowy regulator temperatury PID Inkbird ITC-100RH z termoparą K</td></tr><tr><td>Mysza sonda temperatury doodbytnicy</td><td>ThermoWorks, Braintree Scientific, Inc</td><td>RET-3</td><td>Mysza sonda temperatury doodbytnicy z termometrem</td></tr></tbody></table>

behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

A Behavioral Screen for Heat-Induced Seizures in Mouse Models of Epilepsy

Transgeniczne modele myszy okazały się potężnymi narzędziami w badaniu różnych aspektów ludzkich zaburzeń neurologicznych, w tym epilepsji. Padaczki genetyczne związane z SCN1A obejmują szerokie spektrum zaburzeń napadowych z niepełną penetracją i zmiennością kliniczną. Mutacje SCN1A mogą powodować dużą różnorodność fenotypu napadów, począwszy od prostych, samoograniczających się napadów gorączkowych związanych z gorączką (FS), padaczki genetycznej o umiarkowanym poziomie z drgawkami gorączkowymi plus (GEFS+) do cięższego zespołu Dravet (DS). Chociaż FS są często obserwowane u dzieci w wieku poniżej 6-7 lat, które nie mają padaczki genetycznej, FS u pacjentów z GEFS+ nadal występuje w wieku dorosłym. Tradycyjnie, eksperymentalne FS były indukowane u myszy poprzez wystawienie zwierzęcia na działanie strumienia suchego powietrza lub lamp grzewczych, a tempo zmian temperatury ciała często nie jest dobrze kontrolowane. Tutaj opisujemy zbudowaną na zamówienie komorę grzewczą z frontem z pleksi, która jest wyposażona w cyfrowy regulator temperatury i wentylator elektryczny wyposażony w grzałkę, który może wysyłać ogrzane wymuszone powietrze do areny testowej w sposób kontrolowany temperaturą. Temperatura ciała myszy umieszczonej w komorze, monitorowana za pomocą sondy doodbytniczej, może być podniesiona do 40-42 °C w powtarzalny sposób poprzez zwiększenie temperatury wewnątrz komory. Ciągły monitoring wzrokowy zwierząt w okresie grzewczym wykazuje indukcję napadów wywołanych ciepłem u myszy noszących mutację FS w temperaturze ciała, która nie wywołuje napadów behawioralnych u dzikich rodaków z miotu. Zwierzęta można łatwo wyjąć z komory i umieścić na podkładce chłodzącej, aby szybko przywrócić normalną temperaturę ciała. Metoda ta zapewnia prosty, szybki i powtarzalny protokół badań przesiewowych w kierunku występowania napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki.

Oczekuje się, że modele zwierzęce z mutacjami predysponującymi do drgawek gorączkowych będą przechodzić napady indukowane ciepłem przy podwyższonej temperaturze ciała, która nie wywołuje drgawek u współrodzeństwa typu dzikiego. Mutacje SCN1A zostały powiązane z drgawkami gorączkowymi, w tym u pacjentów z GEFS+ K1270T, u których występują zarówno gorączkowe, jak i bezgorączkowe napady uogólnione7. Przesiewowo badaliśmy myszy z mutacją SCN1A K1270T GEFS+ wygenerowaną metodą CRISPR, opisaną niedawno w badaniu14, pod kątem występowania drgawek indukowanych ciepłem w dwóch backgroundach genetycznych – opornym na drgawki 129X1/SvJ (129X1) oraz podatnym na drgawki C57BL/NJ (B6N). Grupę kontrolną stanowiły współrodzeństwa typu dzikiego w tym samym wieku, umieszczone w komorze grzewczej dla myszy, które nie posiadają mutacji GEFS+ i w związku z tym nie powinny wykazywać drgawek indukowanych ciepłem. Tempo zmiany temperatury ciała w czasie oceniano poprzez wykreślenie średniej temperatury ciała myszy rejestrowanej w każdej minucie podczas testu. Nie stwierdzono różnic w tempie zmiany temperatury ciała pomiędzy heterozygotycznymi myszami mutantami a współrodzeństwem typu dzikiego w odpowiednich backgroundach genetycznych 129X1 i B6N (Ryc. 2B,C). Sugeruje to, że termoregulacja nie jest zaburzona u heterozygotycznych myszy mutantów K1270T GEFS+.
Wszystkie heterozygotyczne myszy mutanty o tłach genetycznych 129X1 (n = 15) lub B6N (n = 9) wykazywały napady wywołane ciepłem (Rysunek 2D). Żadna z myszy typu dzikiego w wzbogaconym tle 129X1 (n = 13) nie wykazała napadów wywołanych ciepłem (Rysunek 2D). W przeciwieństwie do nich, jedna trzecia badanych myszy (n = 3 z 9 myszy) w wrażliwym na napady tle B6N wykazywała napady wywołane ciepłem. Porównanie statystyczne wykazuje, że odsetek heterozygotycznych myszy mutantów wykazujących napady wywołane ciepłem był znacznie wyższy niż u odpowiadających im myszy typu dzikiego w obu tłach genetycznych 129X1 i B6N (Rysunek 2D, dokładny test Fishera, 129X1 p &lt; 0.0001; B6NJ p = 0.009). Średnia temperatura progu napadowego była podobna u heterozygotycznych myszy mutantów w tłach genetycznych 129X1 i B6N. Myszy mutanty 129X1 mają średnią temperaturę progu napadowego 42.6 ± 0.20 °C, co nie różniło się istotnie od średniej temperatury progu napadowego 42.7 ± 0.06 °C zaobserwowanej u myszy B6N (Rysunek 2E; dwustronny nieparzysty test t Studenta, p = 0.782). Należy zauważyć, że średnia temperatura progu napadowego trzech myszy B6N typu dzikiego, które wykazywały napady wywołane ciepłem, wynosiła 43.7 ± 0.08 °C i była istotnie wyższa od średniego progu napadowego 42.7 ± 0.06 °C wykazanego przez heterozygotyczne myszy mutanty B6N (Rysunek 2E, dwustronny nieparzysty test t Studenta, p &lt; 0.0001).
Pleksiglasowy przód komory umożliwia ciągłe nagrywanie wideo podczas testu, które może zostać wykorzystane później do oceny nasilenia napadów u każdej myszy w zmodyfikowanej skali Racine, zgodnie z wcześniejszym opisem14,20. Podczas typowego testu myszy mutanty heterozygotyczne wykazują wywołane ciepłem napady z wokalizacją i/lub potakiwaniem głową (wynik w skali Racine 2), a następnie szybko przechodzą w klonus kończyn przednich, upadanie na bok, skakanie, wyprost kończyn tylnych i/lub uogólnione napady toniczno-kloniczne (wyniki w skali Racine 3-5), gdy temperatura ciała osiągnie około 42 °C. Maksymalny wynik w skali Racine reprezentuje najcięższe zachowania napadowe wywołane ciepłem wśród myszy mutantów. Maksymalny wynik w skali Racine u myszy mutantów heterozygotycznych w wzbogaconym tle 129X1 (n = 15) nie różni się od wyniku u myszy mutantów heterozygotycznych w tle genetycznym B6N (n = 9) (Rycina 2F; test Manna-Whitneya, p &gt; 0,9999). Sugeruje to, że charakterystyka zachowań napadowych wywołanych ciepłem u myszy mutantów K1270T GEFS+ jest niezależna od tła szczepu.
Wzięte razem, dane te wykazują, że wszystkie myszy mutanty przejawiają napady indukowane ciepłem o podobnej częstotliwości, temperaturze progu napadowego i behawioralnym nasileniu napadów, niezależnie od szczepu. Większość braci i sióstr z grupy typu dzikiego nie wykazuje takich napadów w temperaturze 44 °C lub niższej. Około jedna trzecia myszy kontrolnych typu dzikiego na wrażliwym na napady tle genetycznym B6N przejawiała napady indukowane ciepłem (prawdopodobnie z powodu efektów tła genetycznego), jednak temperatura progu napadowego była znacznie wyższa w porównaniu z myszami mutantami na tym samym tle. Wyniki te sugerują, że myszy mutanty na tle genetycznym B6N są podatne na napady indukowane ciepłem przy niższych progach temperaturowych ze względu na posiadaną mutację SCN1A GEFS+. Zatem, stosując ten protokół, można ocenić napady indukowane ciepłem u mutantów myszy z epilepsją i odróżnić je od myszy typu dzikiego, które albo nie ulegają napadom indukowanym ciepłem, albo wykazują napady cieplne w znacznie wyższych temperaturach.
<img alt="Równowaga statyczna w eksperymencie dotyczącym napadów wywołanych temperaturą; wykresy, diagram protokołu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62846/62846fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Myszy mutanty wykazują napady wywołane ciepłem. (A) Protokół ogrzewania do przesiewowych badań behawioralnych w kierunku napadów wywołanych ciepłem u myszy. (B-C) Średnia temperatura ciała myszy w czasie u myszy typu dzikiego (Scn1a+/+ - czarne trójkąty) i mutantów heterozygotycznych (Scn1aKT/+ - pomarańczowe koła) w dwóch tłach genetycznych, odpowiednio 129X1 i B6N. (D) Procent myszy wykazujących napady wywołane ciepłem w obu tłach genetycznych. Myszy typu dzikiego (Scn1a+/+) i heterozygotyczne (Scn1aKT/+) są reprezentowane odpowiednio przez czarne i pomarańczowe słupki. Mutanty heterozygotyczne w tłach 129X1 i B6N przedstawiono odpowiednio jako pomarańczowe słupki jednolite i pomarańczowe słupki z czarnymi paskami. (E) Próg temperatury wywołania napadów u myszy typu dzikiego (Scn1a+/+) i mutantów heterozygotycznych (Scn1aKT/+) w obu szczepach. (F) Rozkład punktowy maksymalnych wyników w skali Racine dla napadów wywołanych ciepłem u myszy heterozygotycznych (Scn1aKT/+) w obu tłach genetycznych. Każda kropka reprezentuje maksymalny wynik Racine u pojedynczej myszy. Liczba zwierząt w każdym genotypie podana jest w nawiasach. Dane przedstawione na panelach B-F to średnia ± S.E.M. Rysunek zmodyfikowano na podstawie Rysunku 3 z pracy Das et al., 2021, eNeuro14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62846/62846fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Celem metody jest badanie przesiewowe pod kątem hipertermii lub napadów wywołanych ciepłem w modelach mysich. Protokół opisuje użycie specjalnie zbudowanej komory z ciągłym monitorowaniem temperatury ciała w celu określenia, czy podwyższona temperatura ciała prowadzi do napadów.

Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

Transgenic mouse models have proved to be powerful tools in studying various aspects of human neurological disorders, including epilepsy. The ...

Mutacje GEFS+ powodują drgawki gorączkowe u pacjentów. Możliwość badania napadów wywołanych hipotermią u myszy GEFS+ pozwala nam zbadać związek między określonymi mutacjami a profilem napadów. Cyfrowy regulator temperatury pomaga w powtarzalny sposób ustawić gradient temperatury w skrzynce grzewczej.W ten sposób temperatura ciała myszy może być zwiększana w powolnym i stałym tempie. Protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji potencjalnych terapii, takich jak leki lub ograniczenia dietetyczne, które można zastosować w celu zmniejszenia lub wyeliminowania drgawek gorączkowych. Aby włożyć sondę temperatury doodbytniczej do myszy bez obrażeń, zalecamy krótkie znieczulenie myszy i nasmarowanie końcówki sondy doodbytniczej.Zacznij od włączenia komory grzewczej myszy za pomocą przycisku włączania, a następnie naciśnij przycisk włączania grzania. Za pomocą klawiatury na cyfrowym regulatorze temperatury ustaw temperaturę komory grzewczej na 50 stopni Celsjusza. Wyłóż podłogę komory grzewczej ściółką z kolb.Zamontuj kamerę nagrywającą wideo przed komorą grzewczą. Wyłóż szalkę Petriego o średnicy 140 milimetrów grubymi warstwami bibuły i umieść ją na lodzie, aby służyła jako podkładka chłodząca. W przypadku testu przesiewowego upewnij się, że masa ciała myszy wynosi 15 gramów lub więcej.Przed rozpoczęciem zabiegu upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Pokryj metalową końcówkę sondy temperatury doodbytniczej smarem i delikatnie włóż ją do myszy. Przymocuj sondę doodbytniczą do ogona myszy za pomocą taśmy.Umieść mysz w nowej klatce regeneracyjnej wyłożonej ściółką z kolb. Uruchom minutnik i obserwuj mysz przez pięć minut, monitorując temperaturę ciała, aż mysz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, a temperatura ustabilizuje się na poziomie od 35 do 36 stopni Celsjusza. Po upływie pięciu minut zanotuj temperaturę ciała myszy jako początkową temperaturę ciała w minucie zero.Szybko przenieś mysz na podłogę podgrzanej komory grzewczej myszy, aby rozpocząć próbę eksperymentalną. Po umieszczeniu myszy w podgrzanej komorze myszy uruchom aparat i stoper, zwiększaj temperaturę komory grzewczej w regularnych odstępach czasu, tak aby temperatura ciała myszy rosła w tempie 25, 2,5 stopnia Celsjusza na minutę. Rozpocznij rejestrowanie temperatury ciała myszy w jednominutowych odstępach czasu na czas trwania eksperymentu.Po 9,5 minuty ustaw temperaturę komory grzewczej na 55 stopni Celsjusza, aby ustabilizować temperaturę komory grzewczej na poziomie 55 stopni Celsjusza do 10 minuty. Podobnie osiągnij stabilną temperaturę komory grzewczej do 60 stopni Celsjusza do 20 minuty. Każda próba przesiewowa w kierunku napadów trwa 30 minut.Jeśli u myszy wystąpi napad, zapisz temperaturę ciała myszy podczas napadu jako temperaturę progu drgawkowego. Zwróć uwagę na charakterystykę zachowania drgawkowego wyświetlaną przez mysz, a następnie szybko podnieś mysz z komory i umieść ją na podkładce chłodzącej. Jeśli mysz nie doświadczy napadów wywołanych ciepłem w ciągu 30-minutowego okresu obserwacji lub temperatura ciała myszy osiągnie 44 stopnie Celsjusza, umieść mysz na podkładce chłodzącej.Gdy temperatura ciała myszy spadnie do 36 do 37 stopni Celsjusza, przenieś mysz do klatki regeneracyjnej. Aby wyjąć sondę doodbytniczą z myszy, ostrożnie przeciąć taśmę między ogonkiem myszy a drutem sondy doodbytniczej. Wytrzyj i wyczyść metalową końcówkę sondy doodbytniczej 70% etanolem.Obserwuj mysz, aż wyzdrowieje, zanim wrócisz do klatki domowej. Monitoruj stan myszy. Zaznacz koniec próby eksperymentalnej.Zresetuj temperaturę komory grzewczej myszy do 50 stopni Celsjusza i pozwól jej się zrównoważyć przed następnym testem. W teście napadów cieplnych średnia temperatura ciała myszy była rejestrowana co minutę przy użyciu protokołu ogrzewania i oceniano szybkość zmian temperatury ciała w czasie. Nie stwierdzono różnicy w szybkości zmian temperatury ciała między heterozygotycznymi zmutowanymi i dzikimi myszami w odpowiednich tłach genetycznych.Grupy eksperymentalne i kontrolne myszy wykazywały różne zachowania pod wpływem okresowego wzrostu temperatury ciała. Wszystkie heterozygotyczne zmutowane myszy z tła genetycznego 129X1 lub B6NJ wykazywały napady wywołane ciepłem. Żadna z myszy typu dzikiego w wzbogaconym tle 129X1 nie doświadczyła napadów, podczas gdy tylko jedna trzecia myszy z wrażliwego na napady tła B6NJ wykazywała drgawki.Średnia temperatura progu drgawkowego zmutowanych myszy 129X1 nie różniła się znacząco od średniej temperatury progu drgawkowego obserwowanej u myszy B6NJ. Jedna trzecia myszy typu dzikiego B6NJ, które wykazywały napady wywołane ciepłem, miała temperaturę progu drgawkowego, która była znacznie wyższa niż heterozygotyczne zmutowane myszy B6NJ. Nasilenie napadów mierzono za pomocą zmodyfikowanej skali Racine'a.Maksymalny wynik Racine'a heterozygotycznych zmutowanych myszy na wzbogaconym tle 129X1 nie różnił się znacząco od heterozygotycznych zmutowanych myszy w tle genetycznym B6NJ. Podczas ustawiania protokołu ogrzewania upewnij się, że temperatura ciała myszy nie rośnie szybciej niż 25 stopni Celsjusza na minutę, ponieważ może to być szkodliwe dla zdrowia zwierzęcia. Byłoby bardzo fajnie połączyć protokół ogrzewania z jednoczesnymi zapisami EEG, co pozwoliłoby nam skorelować różne wzorce aktywności mózgu z różnymi typami zachowań napadowych.

a-behavioral-screen-for-heat-induced-seizures-mouse-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia procedurę wywoływania stanu padaczkowego (SE) u myszy poprzez systemowe podawanie pilokarpiny w celu modelowania padaczki skroniowej.

Leczenie układowe pilokarpiny: mysi model padaczki skroniowej

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół badania wysiłkowego udaru cieplnego (EHS) w modelu mysim.

Wysiłkowy model myszy z udarem cieplnym: protokół badania mechanizmów leżących u podstaw wysiłkowego udaru cieplnego

Ten film pokazuje indukcję napadów wywołanych obsługą u myszy zakażonej wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV). Zarażona mysz, która ma nadpobudliwe neurony, jest narażona na zewnętrzne bodźce fizyczne. To narażenie powoduje stres, co prowadzi do nieprawidłowej aktywności elektrycznej neuronów, co skutkuje drgawkami.

Napady wywołane obsługą w modelu mysim

Ten film pokazuje procedurę wywoływania napadów wywołanych ciepłem u transgenicznej myszy z mutacjami genów związanymi z padaczką poprzez stopniowe zwiększanie temperatury ciała w kontrolowanej komorze. Protokół ten służy do badania mechanizmów napadów i potencjalnych terapii padaczki.

Wyzwalanie i monitorowanie napadów padaczkowych wywołanych ciepłem w transgenicznym modelu myszy

Ten film pokazuje proces wywoływania padaczki u myszy za pomocą zastrzyków z pentylenotetrazolu (PTZ), antagonisty receptora GABA-A. Wielokrotne dootrzewnowe podawanie PTZ stopniowo obniża próg drgawkowy poprzez hamowanie napływu jonów chlorkowych, zakłócanie hamowania neurotransmisji i prowadzenie do nadpobudliwości neuronów, które wywołują drgawki. Proces ten prowadzi do rozpalenia i rozwoju napadów samoistnych, naśladujących przewlekłą padaczkę.

Ustalenie modelu napadów padaczkowych indukowanych pentylenotetrazolem u myszy

Ten protokół opisuje metodę chemicznego rozpalania pentylenotetrazolu i dostarcza mysi model padaczki. Protokół ten może być również wykorzystany do badania podatności na indukcję i patogenezę napadów padaczkowych po napadach padaczkowych u myszy.

Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Ten manuskrypt opisuje metodę wywoływania stanu padaczkowego poprzez ogólnoustrojowe wstrzykiwanie pilokarpiny oraz monitorowania spontanicznych nawracających napadów u żywych zwierząt za pomocą bezprzewodowego systemu telemetrii wideo i elektroencefalogramu. Protokół ten może być wykorzystany do badania patofizjologicznych mechanizmów przewlekłej padaczki, epileptogenezy i ostrych napadów.

Pilokarpinowy model padaczki skroniowej i monitorowanie EEG z wykorzystaniem systemu radiotelemetrycznego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do rejestrowania sygnałów biologicznych mózgu i serca u myszy za pomocą jednoczesnego wideo, elektroencefalografii (EEG) i elektrokardiografii (EKG). Opisano również metody analizy wynikowych zapisów EEG-EKG pod kątem napadów, mocy spektralnej EEG, funkcji serca i zmienności rytmu serca.

Jednoczesne monitorowanie wideo-EEG-EKG w celu identyfikacji dysfunkcji neurosercowej w mysich modelach padaczki

Protokół opisuje rozwój standardowego, powtarzalnego, przedklinicznego modelu wysiłkowego udaru cieplnego (EHS) u myszy wolnych od niekorzystnych bodźców zewnętrznych, takich jak porażenie prądem. Model stanowi platformę do badań mechanistycznych, prewencyjnych i terapeutycznych.

Przedkliniczny model wysiłkowego udaru cieplnego u myszy

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Zakażenie śródmózgowe wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) u myszy C57BL/6 powiela wiele wczesnych i przewlekłych objawów klinicznych wirusowego zapalenia mózgu i późniejszej padaczki u ludzi. W artykule opisano zakażenie wirusem, objawy i histopatologię modelu TMEV.

Model padaczki o etiologii zakaźnej z wykorzystaniem wirusa mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera

Poznaj metodę behawioralnego badania przesiewowego napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach GEFS+ z wykorzystaniem komory grzewczej. Ta technika pozwala ocenić wpływ mutacji genetycznych na podatność na napady w warunkach hipertermii.

Behawioralne badanie przesiewowe napadów wywołanych ciepłem w mysich modelach padaczki

Przeglądaj więcej filmów