Name: Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj bioluminescencyjną optogenetykę do kontroli funkcji komórkowych in vitro i in vivo. Ta metoda wykorzystuje lucyferazę i lucyferynę do precyzyjnej stymulacji świetlnej bez uszkadzania tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym kolegom za konstrukcje, w szczególności A. Tingowi za proteazę Ca-FLARE, czynnik transkrypcyjny i reporter (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwonowi za TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 i NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tuckerowi za CRY-GalΔDD (B1013) i CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walshowi za pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardnerowi za VP-EL222 i C120-Fluc, oraz A. Cetin i H. Zeng za udostępnienie iCreV przed publikacja. Praca ta była wspierana przez granty NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), Fundacji W.M. Kecka i Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych dla A.B. (2016-06760).

Wszystkie procedury w obecnym badaniu zostały przeprowadzone przy użyciu zatwierdzonych przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokołów postępowania ze zwierzętami na Central Michigan University, MI.
1. Bioluminescencyjna aktywacja białek fotosensorycznych in vitro
<ol>
	<li>Konstrukcje
	<ol>
		<li>Wybierz sekwencję lucyferazy lub sekwencję fuzji białek lucyferazy i fluorescencji, która spowoduje ekspresję emitera światła wytwarzającego światło o długości fali pasującej do fotoreceptora, który ma być aktywowany. 
		UWAGA: Na przykład lucyferazy emitujące niebieskie światło, takie jak warianty lucyferazy Gaussia lub NanoLuc, mogą być sparowane z fotoreceptorami wykrywającymi niebieskie światło, takimi jak CRY/Ca2+- i białko wiążące integryny (CIB), LOV lub Vivid (VVD).</li>
		<li>Jeśli nie jest to jeszcze dostępne od innych badaczy lub depozytów plazmidowych, użyj standardowych technik biologii molekularnej, aby sklonować DNA do plazmidu ekspresji ssaków. 
		UWAGA: Wybór promotorów podyktowany jest potrzebą zapewnienia silnej i konstytutywnej ekspresji modułu emitującego światło, takiej jak ta dostarczana przez promotory CAG i CMV.</li>
		<li>Do wstępnych badań należy użyć oddzielnych plazmidów do kotransfekcji emitera światła i czujnika światła. W razie potrzeby i do kolejnych badań należy wygenerować białka fuzyjne obu ugrupowań.</li>
		<li>Uzyskaj wysokiej jakości plazmidowe DNA za pomocą zestawów mini-, midi- lub maxiprep zgodnie z protokołami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórkowa i transfekcja 
	UWAGA: Komórki HeLa i komórki HEK293 są używane jako przykłady w tym protokole.
	<ol>
		<li>Płytki komórkowe w formatach i numerach zgodnie z pożądanym zastosowaniem końcowym. 
		UWAGA: Konkretne przykłady podano w tabeli 2. Gęstość komórek w czasie posiewu określi, jak szybko komórki mogą zostać transfekowane.
		<ol>
			<li>Do oceny transkrypcji aktywowanej bioluminescencją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, umieść komórki HEK293 na 12-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną (PDL) umieszczonych w 24-dołkowych szalkach.</li>
			<li>Aby ocenić transkrypcję aktywowaną bioluminescencją poprzez pomiar emisji światła z ortogonalnej lucyferazy reporterowej w luminometrze, umieść komórki HeLa początkowo w 6- lub 12-dołkowych szalkach do transfekcji, ale ponownie je plateruj po transfekcji (patrz krok 4).</li>
			<li>Jeżeli w komorach obrazowania żywych komórek będzie przeprowadzana wielokrotna stymulacja bioluminescencyjna, należy wybrać szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze i umieścić je na płytkach wielodołkowych o odpowiednim rozmiarze (płytki 24-dołkowe dla szkiełek nakrywkowych 12 mm; płytki 12-dołkowe dla szkiełek nakrywkowych 15 mm i 18 mm). Wysiewać komórki na wierzchu szkiełek nakrywkowych, używając numerów komórek określonych w tabeli 2. Jeśli wybrany typ komórek nie przylega dobrze do powierzchni hodowli, umieść komórki na szalkach pokrytych PDL.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonać transfekcję metodą lipofekcji zgodnie z zaleceniami producenta lub użyć dowolnej metody transfekcji odpowiedniej dla wybranego typu komórki. 
		UWAGA: Tabela 3 szczegółowo opisuje eksperymenty transfekcyjne dla dwóch różnych fotoreceptorów, EL222 i CRY2/CIB, oraz ich odpowiednich plazmidów reporterowych, oprócz różnych białek emitujących światło. Proporcje różnych plazmidów działają dobrze dla wybranych przykładów, ale będą musiały być zoptymalizowane dla każdej pary emitera światła/czujnika światła.</li>
		<li>Po transfekcji umieść komórki w inkubatorze, który jest całkowicie uszczelniony światłem (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1).</li>
		<li>W zależności od pożądanego zastosowania końcowego, użyj komórek do stymulacji bioluminescencji następnego dnia w ich oryginalnych dołkach/naczyniach lub ponownie je pokryj 3-4 godziny po lipofekcji. Aby odczytać transkrypcję genu reporterowego lucyferazy świetlika w luminometrze, ponownie umieść komórki na białych 96-dołkowych płytkach. 
		UWAGA: Wszystkie manipulacje należy wykonywać w pomieszczeniu szczelnym dla światła, w okapie z przepływem laminarnym oświetlonym czerwonym światłem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
		<ol>
			<li>Przepłukać transfekowane komórki zmodyfikowanym roztworem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
			<li>Dodać minimalną objętość odczynnika trypsynizującego do studzienek (24-dołkowy: 100 μL; 12-dołkowy: 150 μL; 6-dołkowy: 300 μl) i inkubować komórki przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Dodać pożywkę hodowlaną, aby osiągnąć stężenie komórek, które pozwoli uzyskać odpowiednią gęstość komórek dla następnego etapu posiewu (na przykład ponownie zawiesić komórki w 24-dołku w końcowej objętości 1,2 ml w celu posiewu w 10 dołkach płytki 96-dołkowej; ponownie zawiesić komórki w 12-dołku w końcowej objętości 2,4 ml w celu posiewu w 20 dołkach płytki 96-dołkowej). Połącz transfekowane komórki z kilku dołków w zależności od liczby studzienek potrzebnych na końcu.</li>
			<li>Pokryć transfekowane komórki w ich ostatecznym formacie i umieścić je z powrotem w inkubatorze zabezpieczonym przed światłem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja bioluminescencji in vitro
	<ol>
		<li>Przygotuj substrat lucyferazy (lucyferynę).
		<ol>
			<li>Przygotować 50 mM zapasów, rozpuszczając 5 mg liofilizowanej koelenkterazyny (CTZ) w 250 μl jej specyficznego rozpuszczalnika. Upewnić się, że cały CTZ wzdłuż ścianek fiolki został rozpuszczony przez pipetowanie lub wirowanie. Chronić fiolkę przed bezpośrednim światłem.</li>
			<li>Przygotować 50 μl porcji w czarnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. 
			UWAGA: CTZ rozpuszczony w rozpuszczalniku nie zamarza w temperaturze -80 °C. Podwielokrotności można kilkakrotnie wyjmować z zamrażarki i wrzucać z powrotem do niej w celu uzyskania roztworów roboczych, o ile ekspozycja na światło i temperatura pokojowa są ograniczone do minimum.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pojedyncza stymulacja światłem bioluminescencyjnym 
		UWAGA: Wszystkie manipulacje są przeprowadzane w szczelnym pomieszczeniu w okapie z przepływem laminarnym oświetlonym czerwonym światłem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
		<ol>
			<li>Przygotuj roztwór roboczy lucyferyny w pożywce do hodowli komórkowych (DMEM lub NeuroBasal). Dostosuj stężenie lucyferyny tak, aby końcowe stężenie wynosiło 100 μM. Przygotuj wszystkie rozcieńczenia CTZ w pożywce na krótko przed dodaniem do komórek, ponieważ CTZ utlenia się z czasem. 
			UWAGA: Jeśli cała objętość pożywki zostanie wymieniona, roztwór roboczy będzie wynosił 100 μM. Jeśli do komórek doda się pożywkę zawierającą lucyferynę, stężenie będzie wyższe o współczynnik rozcieńczenia (na przykład dodanie 50 μl pożywki zawierającej 300 μM lucyferyny do 100 μl pożywki w studzience spowoduje rozcieńczenie 1:3, a tym samym 100 μM końcowe stężenie lucyferyny).</li>
			<li>Dodaj pożywkę zawierającą lucyferynę do komórek i inkubuj przez pożądany czas stymulacji świetlnej. 
			UWAGA: Może to trwać tak krótko, jak 1 minuta lub nawet 15 minut, a może być jeszcze krótsze lub dłuższe. Czas opuszczania pożywki zawierającej lucyferynę na komórkach zależy od okresu półtrwania i kinetyki wybranej kombinacji lucyferazy-lucyferyny.</li>
			<li>Monitoruj emisję światła przy końcowym stężeniu lucyferyny 100 μM okiem po wyłączeniu czerwonego światła; odczekaj kilka sekund, aż oczy przyzwyczają się do całkowitej ciemności. Udokumentuj emisję światła, robiąc zdjęcie (nawet telefonem komórkowym).</li>
			<li>Zakończ stymulację światłem, usuwając pożywkę zawierającą lucyferynę i zastępując ją pożywką hodowlaną. W zależności od czułości eksperymentów, przemyj komórki pożywką hodowlaną raz lub dwa razy po usunięciu pożywki zawierającej lucyferynę, aby wyeliminować całą lucyferynę. Jeśli komórki nie przylegają dobrze do powierzchni hodowli, ułóż je na szalkach pokrytych PDL, aby uniknąć utraty komórek podczas mycia.</li>
			<li>Włóż komórki do inkubatora zabezpieczonego przed światłem na 16-24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wielokrotna stymulacja światłem bioluminescencyjnym 
		UWAGA: Wszystkie manipulacje są przeprowadzane w pomieszczeniu, które może być szczelne i oświetlone czerwonym światłem.
		<ol>
			<li>Skonfiguruj komorę obrazowania żywych komórek. Stwórz światłoszczelną komorę wokół mikroskopu do obrazowania żywych komórek, używając pudełka i czarnych plastikowych arkuszy lub czarnych zasłon (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Zakryj wszystkie źródła światła znajdujące się w komorze światłoszczelnej i pomieszczeniu (np. wskaźniki LED na mikroskopie lub instrumentach).</li>
			<li>Skonfigurować system perfuzyjny z żądanym roztworem do wlotu i otworem wyjściowym studzienki prowadzącym do pojemnika na odpady. 
			UWAGA: Na przykład roztworem do obrazowania może być roztwór Tyrode'a (chlorek sodu (124 mM), chlorek potasu (3 mM), HEPES (10 mM), dwuwodny chlorek wapnia (2 mM), sześciowodny chlorek magnezu (1 mM), D-glukoza (20 mM)).</li>
			<li>Przygotować roztwór roboczy lucyferyny w roztworze do obrazowania. Porcjować do tylu probówek mikrowirówek, ile jest powtórzonych stymulacji. Dostosuj stężenie lucyferyny tak, aby końcowe stężenie w komorze obrazowania wynosiło 100 μM.</li>
			<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami w komorze.</li>
			<li>Utrzymując pompę w ruchu, wyjmij rurkę wlotową pompy ze zlewki wlotowej i szybko zanurz ją w roztworze lucyferyny, utrzymując czas przejścia tak krótki, jak to możliwe, aby uniknąć pustek powietrznych w przewodach.</li>
			<li>Jak tylko roztwór lucyferyny zostanie pobrany, umieść rurkę wlotową z powrotem w zlewce wlotowej. Powtórz ten proces tyle razy, ile potrzeba i w odstępach od kilku minut do godzin, w zależności od fizjologicznego wzorca, na który komórki mają być wystawione.</li>
			<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze chronionym przed światłem na 16-24 godziny w celu transkrypcji lub na czas, w którym ma być oceniany efekt stymulacji światłem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bioluminescencyjna aktywacja białek fotosensorycznych in vivo
<ol>
	<li>Konstrukcje
	<ol>
		<li>Wybierz sekwencję lucyferazy lub sekwencję fuzji białek lucyferazy i fluorescencji, która spowoduje ekspresję emitera światła wytwarzającego światło o długości fali pasującej do fotoreceptora, który ma być aktywowany.</li>
		<li>Użyj standardowych technik biologii molekularnej, aby sklonować DNA do plazmidu pAAV, jeśli nie jest to jeszcze dostępne u innych badaczy lub w złożach plazmidowych.</li>
		<li>Wybierz silne promotory ekspresji modułów emitujących światło, takie jak CAG lub CMV.</li>
		<li>Użyj standardowych podejść do przygotowania zapasów wirusów o wysokim mianie6 lub przygotuj komercyjnie wektory wirusowe.</li>
		<li>Do wstępnych badań należy użyć oddzielnych wektorów wirusowych do kotransdukcji emitera światła i czujnika światła, aby umożliwić dostosowanie proporcji różnych składników, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdukcja AAV
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć do narządu docelowego zwierzęcia doświadczalnego wektory wirusowe emitera światła, czujnika światła i reportera analogiczne do stosunków stężeń stosowanych w transfekcjach in vitro (tabela 3).</li>
		<li>Zwierzęta należy umieścić w ich domowych klatkach na co najmniej 2 tygodnie, aby umożliwić maksymalną ekspresję wszystkich składników. 
		UWAGA: Jeśli narząd docelowy znajduje się wewnątrz ciała i jest chroniony przed światłem otoczenia, zwierzęta mogą być trzymane w normalnych warunkach oświetleniowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja bioluminescencji in vivo
	<ol>
		<li>Przygotuj substrat lucyferazy (lucyferynę).
		<ol>
			<li>Wyjmij fiolkę z rozpuszczalnym w wodzie CTZ z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej. Chroń go przed światłem.</li>
			<li>Na fiolkę o pojemności 500 μg dodać 250 μl sterylnej wody, używając strzykawki lub otwierając fiolkę i dodając wodę pipetą, a następnie umieszczając gumowy korek z powrotem na szklanej fiolce.</li>
			<li>Inkubować odtworzoną szklaną fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C przez kilka minut, aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.</li>
			<li>Przenieść roztwór do czarnej probówki do mikrowirówki. Przepłukać ścianki szklanej fiolki, aby pobrać cały CTZ.</li>
			<li>Usuń ilość roztworu potrzebną na dzień. Pozostały roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania następnego dnia. Nie zamrażać!</li>
			<li>Wykonać te same czynności (2.3.1.1.-2.3.1.5) dla fiolki z pojazdem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bioluminescencyjna stymulacja światłem
		<ol>
			<li>Usunąć objętość lucyferyny/nośnika potrzebną do wielkości zwierzęcia i wybranej drogi podania (Tabela 4).</li>
			<li>Wstrzyknąć zwierzętom lucyferynę lub nośnik. Powtórz stymulację światłem bioluminescencyjnym zgodnie z projektem eksperymentalnym. Na przykład, jeśli aktywacja rekombinazy jest pożądana podczas określonego paradygmatu behawioralnego, wstrzyknij zwierzętom tuż przed testami behawioralnymi. Jeśli celem jest transkrypcja fazowa cząsteczki, należy wstrzykiwać zwierzętom wielokrotnie przez kilka dni.</li>
			<li>Zbierz dane od zwierząt stymulowanych bioluminescencją zgodnie z projektem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+limits+of+developmental+Erk+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling.</a> Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+by+femtosecond+laser+triggers+restorable+fragmentation+in+single+mitochondrion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion.</a> Journal of Biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+BRET-based+optogenetic+device+for+pulsatile+transgene+expression+enabling+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 615(2021).</li>
<li>Berglund, K., Birkner, E., Augustine, G. J., Hochgeschwender, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+channelrhodopsins+for+combined+optogenetic+and+chemical-genetic+control+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Light-emitting channelrhodopsins for combined optogenetic and chemical-genetic control of neurons.</a> PLoS One. 8 (3), 59759(2013).</li>
<li>Tung, J. K., Gutekunst, C. -A., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+luminopsins%3A+genetically-encoded+bioluminescent+opsins+for+versatile%2C+scalable%2C+and+hardware-independent+optogenetic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibitory luminopsins: genetically-encoded bioluminescent opsins for versatile, scalable, and hardware-independent optogenetic inhibition.</a> Scientific Reports. 5, 14366(2015).</li>
<li>Berglund, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminopsins+integrate+opto-+and+chemogenetics+by+using+physical+and+biological+light+sources+for+opsin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Luminopsins integrate opto- and chemogenetics by using physical and biological light sources for opsin activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (3), 358-367 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramirez, M., More, A. I., Friedman, N. G., Hochgeschwender, U., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BioLuminescent-OptoGenetic+in+vivo+response+to+coelenterazine+is+proportional%2C+sensitive+and+specific+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The BioLuminescent-OptoGenetic in vivo response to coelenterazine is proportional, sensitive and specific in neocortex.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 471-480 (2020).</li>
<li>Moore, C. I., Berglund, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BL-OG%3A+BioLuminescent-OptoGenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">BL-OG: BioLuminescent-OptoGenetics.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 469-470 (2020).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+luciferase-opsin+combinations+for+improved+luminopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Novel luciferase-opsin combinations for improved luminopsins.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 410-421 (2020).</li>
<li>Jaiswal, P. B., Tung, J. K., Gross, R. E., English, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+activity+is+required+for+enhancements+in+functional+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+exercised+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Motoneuron activity is required for enhancements in functional recovery after peripheral nerve injury in exercised female mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 448-457 (2020).</li>
<li>Zenchak, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence-driven+optogenetic+activation+of+transplanted+neural+precursor+cells+improves+motor+deficits+in+a+Parkinson%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence-driven optogenetic activation of transplanted neural precursor cells improves motor deficits in a Parkinson's disease mouse model.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (3), 458-468 (2020).</li>
<li>Tung, J. K., Shiu, F. H., Ding, K., Gross, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+activated+luminopsins+allow+optogenetic+inhibition+of+distributed+nodes+in+an+epileptic+network+for+non-invasive+and+multi-site+suppression+of+seizure+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Chemically activated luminopsins allow optogenetic inhibition of distributed nodes in an epileptic network for non-invasive and multi-site suppression of seizure activity.</a> Neurobiology of Disease. 109, Pt A 1-10 (2018).</li>
<li>Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algal+sensory+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Algal sensory photoreceptors.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 167-189 (2008).</li>
<li>Losi, A., Gardner, K. H., Moglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light+receptors+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blue-light receptors for optogenetics.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10659-10709 (2018).</li>
<li>Proshkina, G. M., Shramova, E. I., Shilova, O. N., Ryabova, A. V., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+of+flavoprotein+miniSOG+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer+in+genetically+encoded+system+NanoLuc-miniSOG+is+comparable+with+its+LED-excited+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity of flavoprotein miniSOG induced by bioluminescence resonance energy transfer in genetically encoded system NanoLuc-miniSOG is comparable with its LED-excited phototoxicity.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 188, 107-115 (2018).</li>
<li>Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+Cre-loxP+recombination+system+for+optogenetic+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering.</a> Nature Chemical Biology. 12 (12), 1059-1064 (2016).</li>
<li>Shramova, E. I., Proshkina, G. M., Chumakov, S. P., Khodarovich, Y. M., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavoprotein+miniSOG+cytotoxisity+can+be+induced+by+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Flavoprotein miniSOG cytotoxisity can be induced by bioluminescence resonance energy transfer.</a> Acta Naturae. 8 (4), 118-123 (2016).</li>
<li>Naim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-activated+nucleotide+cyclase+regulates+spatial+and+temporal+cAMP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).</li>
<li>Kim, C. K., Cho, K. F., Kim, M. W., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luciferase-LOV+BRET+enables+versatile+and+specific+transcriptional+readout+of+cellular+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Luciferase-LOV BRET enables versatile and specific transcriptional readout of cellular protein-protein interactions.</a> Elife. 8, 43826(2019).</li>
<li>Parag-Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+BRET-based+biologic+light+sources+enable+spatiotemporal+control+over+diverse+optogenetic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered BRET-based biologic light sources enable spatiotemporal control over diverse optogenetic systems.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 1-9 (2020).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-luminescent+photodynamic+therapy+using+breast+cancer+targeted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Self-luminescent photodynamic therapy using breast cancer targeted proteins.</a> Science Advances. 6 (37), (2020).</li>
<li>Kim, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+calcium+integrator+reveals+a+striatal+cell+type+driving+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Molecular calcium integrator reveals a striatal cell type driving aversion.</a> Cell. 183 (7), 2003-2019 (2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-+and+calcium-gated+transcription+factor+for+imaging+and+manipulating+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 864-871 (2017).</li>
<li>Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium-+and+light-gated+switch+to+induce+gene+expression+in+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons.</a> Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).</li>
<li>Pathak, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+approaches+for+optogenetic+regulation+of+gene+expression+in+mammalian+cells+using+Arabidopsis+cryptochrome+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Bidirectional approaches for optogenetic regulation of gene expression in mammalian cells using Arabidopsis cryptochrome 2.</a> Nucleic Acids Research. 45 (20), 167(2017).</li>
<li>Nishio, H., Walsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCAAT+displacement+protein%2Fcut+homolog+recruits+G9a+histone+lysine+methyltransferase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCAAT displacement protein/cut homolog recruits G9a histone lysine methyltransferase to repress transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11257-11262 (2004).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecV+recombinase+system+for+in+vivo+targeted+optogenomic+modifications+of+single+cells+or+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations.</a> Nature Methods. 17 (4), 422-429 (2020).</li>
<li>Love, A. C., Prescher, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+%28and+using%29+the+light%3A+Recent+developments+in+bioluminescence+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Seeing (and using) the light: Recent developments in bioluminescence technology.</a> Cell Chemical Biology. 27 (8), 904-920 (2020).</li>
<li>Naumann, E. A., Kampff, A. R., Prober, D. A., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+neural+activity+with+bioluminescence+during+natural+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monitoring neural activity with bioluminescence during natural behavior.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 513-520 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Istnieje szereg lucyferazy i lucyferyny o długościach fal emisji światła odpowiadających widmom aktywacji białek fotosensorycznych od światła niebieskiego do czerwonego14,29. Poza wyrównaniem długości fal emisji i wzbudzenia, nie ma niezawodnego sposobu na określenie a priori, które parowanie będzie działać najlepiej. Stąd potrzeba eksperymentalnego określenia, jak działają pary lucyferyna-lucyferazy w komórkach i organizmach w sterowaniu systemami fotosensorycznymi.
Protokoły przedstawione w tej prezentacji opisują, jak przygotować lucyferynę i jak ją stosować in vitro i in vivo, wraz z wytycznymi dotyczącymi ustawiania pomieszczeń, okapów do hodowli tkankowych, inkubatorów i mikroskopów do eksperymentów wykorzystujących bioluminescencję. W reprezentatywnych eksperymentach wykorzystano różne lucyferazy (NanoLuc, lucyferaza Gaussa ) z kilkoma białkami fotosensorycznymi (CRY/CIB, EL222, VVD, LOV), demonstrując wpływ bioluminescencji w porównaniu ze światłem fizycznym, kotransfekcję w porównaniu z białkami fuzyjnymi, porównania sygnału do szumu i różne testy odczytu. Więcej zastosowań białek fotosensorycznych aktywujących bioluminescencję opisano w publikacjach z kilku grup, ukierunkowanych na indukcję śmierci komórki, syntezę cAMP i ruch białek oprócz transkrypcji (Tabela 1).
Zwykła transfekcja komponentów emitujących i wykrywających światło to dobry początek. Zmienne to stosunki molowe emitera i czujnika; Niewiadomymi są poziomy tła aktywności czujnika w ciemności, aktywność czujnika w odniesieniu do natężenia i czasu trwania światła oraz skuteczność aktywacji czujnika porównująca światło fizyczne i biologiczne. Podczas gdy konstrukcje fuzyjne mają tę zaletę, że utrzymują stosunek molowy emitera i czujnika na poziomie 1:1 i zbliżają emiter światła do domeny wykrywania światła, w grę wchodzą inne kwestie, takie jak miejsce wiązania (koniec N lub C) i sposób łączenia (długość i skład łącznika) bez wpływu na działanie siłownika fotosensorycznego. 
W przypadku eksperymentów zarówno in vitro , jak i in vivo istnieje wiele możliwości dostrojenia emisji światła bioluminescencyjnego, albo poprzez zmianę stężenia lucyferyny, albo poprzez zmianę czasu, w którym lucyferyna jest dostępna dla odpowiedniego czujnika. Minimalna ilość i czas są określane na podstawie obecności lub braku efektu oczekiwanego przy aktywacji światła. W przeciwieństwie do tego, odpowiednie maksima są głównie określane przez tolerancję komórek na wysokie stężenia lucyferyny przez dłuższy czas. Stężenie CTZ wybrane w powyższych przykładach, 100 μM, jest bliskie górnej granicy dla różnych typów komórek, od komórek HEK293 po neurony. Celem jest użycie jak najniższego stężenia przez jak najkrótszy czas, aby osiągnąć aktywację docelowej domeny fotodetekcyjnej. Łatwiej będzie to osiągnąć za pomocą lucyferazy o wysokiej emisji światła i fotoreceptorów o wysokiej wrażliwości na światło.
Bioluminescencja do napędzania fotoreceptorów została zastosowana u gryzoni (myszy, szczurów) z białkami fotoczułymi ulegającymi ekspresji w wątrobie, mięśniach, rdzeniu kręgowym i mózgu, a także za pośrednictwem komórek wyrażających fotoreceptory przeszczepionych podskórnie lub dootrzewnowo. Zasadniczo nie ma ograniczeń uniemożliwiających zastosowanie tego podejścia do różnych gatunków, od naczelnych po ryby lub muchy. W zależności od przepuszczalności lucyferyny przez organizm, aplikacja może być tak łatwa, jak nałożenie lucyferyny do otaczającej wody (np. u larw ryb30). Przed zastosowaniem BL-OG w jakimkolwiek nowym organizmie należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe, aby upewnić się, że lucyferyna dociera do swoich celów wybraną drogą aplikacji.
Krytycznymi aspektami projektu eksperymentalnego są różne kontrole, które są ważne dla interpretacji wyników. Komórki wykazujące ekspresję reportera napędzanego przez lucyferazy działającą na białko fotosensoryczne należy porównać z komórkami pozbawionymi lucyferazy lub białka fotosensorycznego. Ponadto należy dokonać porównań między komórkami wystawionymi na działanie lucyferyny, nośnika lub trzymanych w ciemności. Ważne jest również, aby zdać sobie sprawę z ograniczeń różnych testów do oceny efektów aktywacji fotoreceptorów sterowanej bioluminescencją. Na przykład skuteczność transkrypcji aktywowanej bioluminescencją można testować na różne sposoby, w zależności od tego, czy gen reporterowy jest ortogonalną lucyferazy (luminometr, IVIS), czy białkiem fluorescencyjnym (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, analiza obrazu mikroskopowego). Podczas gdy podstawowe efekty powinny być powtarzalne na różnych platformach testowych, ilościowe aspekty efektów mogą się znacznie różnić.
Do tej pory wykazano bioluminescencyjną aktywację fotoreceptorów odpowiednio dla ograniczonej liczby lucyferazy i białek fotosensorycznych, zarówno in vitro , jak i in vivo. Można go rozszerzyć na dużą klasę fotoreceptorów do aktywacji wielu innych procesów biologicznych. Takie rozszerzenie podejścia jest dodatkowo wspierane przez ciągły rozwój nowych lucyferazy i par białek lucyferazy-fluorescencji o znacznie wyższej emisji światła niż naturalnie występujące lucyferazy i o cechach kinetycznych dostosowanych do różnych zastosowań. Postępom tym towarzyszy wytwarzanie nowych lucyferyn, co dodatkowo przyczynia się do zwiększenia jasności i palety kolorów29. Ta platforma narzędziowa oferuje aplikacje do manipulowania i badania dynamiki wewnątrzkomórkowej i interakcji komórkowych wewnątrz żywych komórek, tkanek i organizmów.

Białka fotosensoryczne mogą być aktywowane przez światło z fizycznego źródła światła lub z enzymu lucyferazy w obecności jego substratu, lucyferyny, w celu wytworzenia bioluminescencji. W przypadku zastosowań, które wymagają mili- lub nawet femtosekundowych skal czasowych i/lub rozdzielczości przestrzennej pojedynczej komórki, fizyczne źródła światła (lasery i diody elektroluminescencyjne (LED)) są jedynymi, które można dostosować do tych skal. Przykładami są przestrzenne ograniczenie światła używane do stymulacji przeciwległych biegunów w rozwoju larw Drosophila z milisekundową kontrolą czasową1 lub precyzyjna stymulacja pojedynczych struktur subkomórkowych, takich jak kanaliki mitochondrialne2. Jednak wiele innych zastosowań przełączników optycznych ma inne priorytety, w tym rozszerzoną kontrolę przestrzenną i wielokrotne stosowanie nieinwazyjnie i bez uszkodzeń spowodowanych światłem, ale ze zdefiniowaną kontrolą czasową w minutowych skalach czasowych i przestrajanej intensywności. W tym przypadku wykorzystanie lucyferazy jako alternatywnego źródła światła do aktywacji domen wykrywających światło ma kilka zalet. W przeciwieństwie do aktywacji światłem światłowodowym, bioluminescencja dociera do każdej domeny wykrywania światła wyrażonej w docelowej populacji komórek, ponieważ źródło światła jest kodowane genetycznie. Zastosowanie bioluminescencji łagodzi obawy związane z uszkodzeniem tkanek i komórek przez światłowody i przedłużoną ekspozycję na światło fizyczne. Światło włącza się po zastosowaniu substratu lucyferazy. Początek jest natychmiastowy in vitro i in vivo w zależności od drogi podania i trwa ~15-30 min; Przedłużoną obecność lub fazową stymulację światła można osiągnąć za pomocą różnych lucyferyn oraz dodatkowych lub powtarzających się aplikacji substratu3. Wreszcie, emisję bioluminescencji można dostroić, zmieniając stężenie lucyferyny.
Wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji fotoreceptorów poruszających jony, tj. elementów optogenetycznych, takich jak rodopsyny kanałowe lub pompy, zostało szeroko zademonstrowane4,5,6,7,8. To podejście BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) zostało zastosowane w eksperymentach in vivo na myszach i szczurach5,6,7,9,10,11,12. Stwierdzono, że aktywacja opsyn BL-OG wymaga bioluminescencji co najmniej ~33 μW/mm2, przy czym skuteczność aktywacji wzrasta wraz z wyższą emisją światła6,9. Fotoreceptory czuciowe poruszające się jonami są podgrupą dużego kontyngentu fotoreceptorów czuciowych występujących w przyrodzie, które nie poruszają się jonami13,14. Rozszerzenie bioluminescencji na aktywację niejonowych ruchomych fotoreceptorów, takich jak domeny fotosensoryczne roślin lub bakterii, jest zachęcane przez reports15,16, że niejonowe ruchome fotoczujniki są znacznie bardziej wrażliwe na światło niż rodopsyny kanałowe, zapewniając jeszcze lepszy napęd czujników światła z bioluminescencją niż już uzyskane w przypadku elementów optogenetycznych poruszających jony. Ostatnio w kilku publikacjach opisano wykorzystanie bioluminescencji jako źródła światła do aktywacji różnych fotoreceptorów, w tym domen światło-tlenu-voltage (LOV), domen niebieskiego światła wykorzystujących flawinę (BLUF) i kryptochromów (CRYs)3,17,18,19,20,21, 22 (Tabela 1). Zastosowania bioluminescencyjnej aktywacji przełączników optycznych ukierunkowane na procesy wewnątrzkomórkowe, począwszy od śmierci komórki wywołanej reaktywnymi formami tlenu, syntezy cAMP, rekrutacji i dysocjacji białek, a skończywszy na rekombinacji genomowej i indukcji transkrypcji.
Ten protokół przedstawia ogólny projekt narzędzi optogenetycznych sterowanych bioluminescencją i szczegółowo opisuje procedury eksperymentalnego przeprowadzania aktywacji bioluminescencji w komórkach i organizmach. Zawiera opisy, jak ustawić pomieszczenie, kaptur do hodowli tkankowych i inkubator oraz mikroskop do pracy z bioluminescencją, a także etapy od przygotowania lucyferyny do jej zastosowania. Protokół ten zapewnia badaczom podstawowe procedury przeprowadzania BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) in vitro i in vivo. Opisane podejścia mogą być dalej rozszerzane i indywidualizowane do różnych paradygmatów eksperymentalnych. Przewidujemy, że protokół ten ułatwi przyjęcie zastosowania bioluminescencji w optogenetycznych badaniach biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Żarówka LED ABI 25W Deep Red 660 nm</td><td>Amazon</td><td></td><td>do użytku z dowolnym stojakiem na lampę</td></tr><tr><td>&nbsp; Czarne probówki do mikrowirówek, 0,5 mL, Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>Czarne probówki do mikrowirówek, 1,5 mL, Argos Technologies</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-161</td><td></td></tr><tr><td>nylon, tkanina powlekana poliuretanem (1,5 m x 2,7 m) x 0,12 mm (gruba)</td><td>THOR LABS</td><td>BK-5</td><td></td></tr><tr><td>C120-Fluc</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr><tr><td>CaCl2 </td><td>Sigma</td><td>C8106; CAS: 10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza Ca-FLARE, czynnik transkrypcyjny i reporter</td><td></td><td>Addgene # 92214, 92213, 92202</td><td>A. Ting</td></tr><tr><td>CIB-VP64 (B1016)</td><td></td><td>Addgene # 92037</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CRY-Gal&Delta; DD (B1013)</td><td></td><td>Addgene # 92035</td><td>C. Tucker</td></tr><tr><td>CTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>303</td><td>preparat do zastosowań in vitro z lucyferazyami Gaussia</td></tr><tr><td>CTZ (rozpuszczalna w wodzie natywna coelenterazine)</td> <td>Prolume Inc. (NanoLight)</td> <td>3031</td><td>preparat do zastosowań in vivo z lucyferazy Gaussia</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270; CAS: 50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna, sól potasowa</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>LUCK</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>hCTZ</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>301</td><td>preparat do zastosowań in vitro z lucyferazy Oplophorus</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375; CAS: 7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>iCreV</td><td></td><td></td><td>A. Cetin i H. Zeng</td></tr><tr><td>System obrazowania in vivo (IVIS)</td> <td>Perkin-Elmer</td><td>Lumina LT</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405; CAS: 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik matrycy LED</td><td>Amuza</td><td>LAD-1</td><td></td></tr><tr><td>Tablica LED do płytek wielodołkowych</td><td>Odczynnik Amuza</td><td>LEDA-x</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydrate</td><td>Sigma</td><td>M2670; CAS: 7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653; CAS: 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NanoFuel Solvent</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>399</td><td>do rozpuszczania preparatów CTZ do stosowania in vitro</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>221465; CAS: 1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>NES-CRY2PHR-TevC</td><td></td><td>Addgene # 89877</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>transfekcja medium</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe powlekane PDL (12 mm, 15 mm, 18 mm)</td><td>Neuvitro Corporation</td><td>GG-12-PDL, GG-15-PDL, GG-18-PDL</td><td></td></tr><tr><td>pGL2-GAL4-UAS-Luc</td><td></td><td>Addgene #33020</td><td>M. Walsh</td></tr><tr><td>Prizmatix USB Pulser TTL Generator dla optogenetyki</td><td>Goldstone Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16</td><td></td><td>Addgene # 89878</td><td>H. Kwon</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Pojazd (nośnik rozpuszczalny w wodzie bez CTZ)</td><td>Prolume Inc. (NanoLight)</td><td>Sterowanie 3031C</td><td>do zastosowań in vivo z CTZ</td></tr><tr><td>VP-EL222</td><td></td><td></td><td>K. Gardner</td></tr></tbody></table>

optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małej cząsteczce, lucyferyna - zostało użyte in vitro i in vivo do aktywacji kanałów jonowych bramkowanych światłem i pomp w neuronach. Chociaż to podejście do optogenetyki bioluminescencyjnej (BL-OG) nadaje narzędziom optogenetycznym komponent chemogenetyczny, nie ogranicza się ono do zastosowania w neurobiologii. Bioluminescencję można raczej wykorzystać do aktywacji dowolnego białka fotosensorycznego, umożliwiając w ten sposób manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach. Różne pary lucyferazy-lucyferyny można dopasować do białek fotosensorycznych wymagających różnych długości fal światła i intensywności światła.
W zależności od konkretnego zastosowania, efektywne dostarczanie światła można osiągnąć za pomocą białek fuzyjnych lucyferazy z fotoreceptorami lub przez prostą kotransfekcję. Białka fotosensoryczne oparte na dimeryzacji zależnej od światła lub zmianach konformacyjnych mogą być napędzane przez bioluminescencję, aby wpływać na procesy komórkowe od lokalizacji białek, regulacji wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych do transkrypcji. Poniższy protokół szczegółowo opisuje eksperymentalne przeprowadzenie aktywacji bioluminescencji w komórkach i organizmach oraz opisuje wyniki przy użyciu rekombinacji i czynników transkrypcyjnych sterowanych bioluminescencją. Protokół zapewnia badaczom podstawowe procedury przeprowadzania optogenetyki bioluminescencyjnej in vitro i in vivo. Opisane podejścia mogą być dalej rozszerzane i indywidualizowane do wielu różnych paradygmatów eksperymentalnych.

Istnieje wiele zdarzeń wewnątrzkomórkowych, którymi można manipulować za pomocą aktuatorów reagujących na światło i które podlegają dwumodalnej aktywacji za pomocą fizycznych i biologicznych źródeł światła. Poniżej przedstawiono przykłady wykorzystujące fotoczuły integrator wapnia (Ca2+), indukowaną światłem translokację białek, światłoczuły czynnik transkrypcyjny oraz światłoczułą rekombinazę. Przykłady te ilustrują możliwość wykorzystania bioluminescencji do aktywacji różnych rodzajów fotoreceptorów. Przedstawione eksperymenty nie zostały specjalnie zoptymalizowane pod kątem zastosowania diod emitujących światło (LED), wyboru lucyferazy ani stężeń i czasu aplikacji lucyferyny.
Szybka ekspresja regulowana światłem i aktywnością (FLARE) to system optogenetyczny, który umożliwia transkrypcję genu reporterowego przy jednoczesnym wzroście wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ i naświetlaniu23 (Rysunek 4A). Obecność Ca2+ jest niezbędna do zbliżenia proteazy do miejsca cięcia proteolitycznego, które jest dostępne wyłącznie po stymulacji światłem, co prowadzi do uwolnienia czynnika transkrypcyjnego. Komórki HEK293 poddano kotransfekcji oryginalnymi komponentami FLARE, podwójną konstrukcją reporterową Firefly (FLuc)-dTomato oraz wariantem lucyferazy Gaussia zakotwiczonym w błonie, sbGLuc6. W obecności zwiększonego stężenia wewnątrzkomórkowego Ca2+, wywołanego ekspozycją komórek na 2 µM jonomycyny i 5 mM chlorku wapnia (CaCl2), zastosowanie niebieskiego LED doprowadziło do silnej ekspresji reportera fluorescencyjnego w porównaniu z komórkami pozostawionymi w ciemności, a także do ekspresji FLuc, określonej poprzez pomiar luminescencji po dodaniu substratu FLuc, D-lucyferyny. Podobne poziomy ekspresji FLuc uzyskano przy bioluminescencji emitowanej przez sbGLuc po zastosowaniu substratu sbGLuc (CTZ) wraz z jonomycyną i CaCl2. Należy zauważyć, że lucyferazy używane do aktywacji światłem (sbGLuc) oraz do raportowania efektu aktywacji światłem (transkrypcja FLuc) emitują światło wyłącznie w obecności ich odpowiednich lucyferyn (CTZ vs. D-lucyferyna) i nie wykazują reakcji krzyżowej.
Różne komponenty połączono w celu stworzenia systemu transkrypcji indukowanej światłem, opartego na heterodimeryzacji kryptochromów23,24 (Rysunek 4B). Białko CRY2 połączono z proteazą, natomiast związany z błoną CIB połączono z miejscem cięcia proteazy i czynnikiem transkrypcyjnym. Indukowana światłem translokacja białka spowodowała uwolnienie czynnika transkrypcyjnego, co doprowadziło do ekspresji FLuc i dTomato, jak pokazano na Rysunku 4A. Chociaż sama obecność komponentu czynnika transkrypcyjnego skutkowała znacznym sygnałem tła, prawdopodobnie z powodu spontanicznej proteolizy, zarówno światło fizyczne (LED), jak i bioluminescencja (CTZ) wyraźnie zwiększyły ekspresję FLuc, co zmierzono w systemie obrazowania in vivo (IVIS).
W innym zestawie eksperymentów NanoLuc (lucyferyna: furimazyna lub hCTZ) został wykorzystany do optogenetycznej regulacji transkrypcji poprzez dimeryzację CRY/CIB oraz światłoczułego czynnika transkrypcyjnego EL22225,26,27. Rycina 5A,B przedstawiają schematy różnych komponentów w stanie ciemności i naświetlenia oraz lucyferazę kotransfekowaną lub połączoną z sensorem światła. Różne porównania przedstawiono na Rycini 5C. Bioluminescencja, wywołana dodaniem hCTZ do komórek HEK293 wykazujących ekspresję konstruktów i usunięciem go po 15 min, była bardziej efektywna w napędzaniu transkrypcji reportera niż 20 min ekspozycji na światło LED, zarówno w przypadku CRY/CIB, jak i EL222. Dla CRY/CIB godzina ekspozycji na LED była wystarczająca, aby osiągnąć poziom transkrypcji porównywalny do 15 min bioluminescencji. W przeciwieństwie do tego, w przypadku EL222 nawet 60 min LED było zaledwie połową tak efektywne, jak krótka ekspozycja na bioluminescencję. Nie stwierdzono istotnych różnic w efektywności transkrypcji między dwoma systemami przy kotransfekcji, choć białka fuzyjne CRY/CIB były bardziej efektywne niż białka fuzyjne EL222. W obu systemach białka fuzyjne prowadziły do znacznie wyższych poziomów transkrypcji niż komponenty kotransfekowane. CRY/CIB wykazywało konsekwentnie wyższe poziomy tła przy zastosowaniu nośnika w porównaniu do EL222, które charakteryzowało się pomijalną transkrypcją tła. Zwiększanie stężeń samego hCTZ nie miało wpływu na transkrypcję genu reporterowego.
Fotoaktywowalne rekombinazy stanowią wszechstronne narzędzie do manipulacji optogenomicznych. Przebadaliśmy aktywację bioluminescencyjną światłoczułej rekombinazy split Cre opartej na białku Vivid LOV, iCreV28. Rysunek 6A przedstawia schemat różnych komponentów: sbGLuc, iCreV oraz fluorescencyjnego reportera lox-stop-lox (tdTomato) przed i po zastosowaniu CTZ. Wyniki zastosowania CTZ w stosunku do kontroli (brak CTZ lub LED) przedstawiono na Rysunku 6B. Występuje pewna ekspresja tła nawet w ciemności (brak CTZ); jednak w obecności CTZ ekspresja jest wyraźnie zwiększona w stosunku do tła i zbliżona do tej indukowanej zastosowaniem LED.
<img alt="Układ laboratoryjny do eksperymentów z materiałami światłoczułymi; pudełko i materiał nieprzepuszczający światła zakrywający panele." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Inkubator zabezpieczony przed światłem. Klapka z tektury chroniąca przed światłem z podświetlonego panelu sterowania (górna strzałka). Nieprzepuszczalna światło osłona na szklanych drzwiach inkubatora (dolna strzałka) w celu ochrony komórek przed ekspozycją na światło. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Konfiguracja laboratoryjna pod czerwonym światłem w celu ochrony przed UV, obejmująca lampę UV i sprzęt badawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza oświetlone czerwonym światłem. Układ przedstawiający standardowe dygestorium do hodowli tkankowych oświetlone czerwonym światłem. Strzałka wskazuje standardową lampkę biurkową z czerwoną żarówką. Wszystkie manipulacje pod czerwonym światłem są przeprowadzane w całkowicie ciemnym, szczelnym świetlnie pomieszczeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ mikroskopii równowagi statycznej; stany z przykrytym i odsłoniętym mikroskopem; schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Światłoszczelne przegrody wokół mikroskopów do obrazowania żywych komórek. Dwa przykłady układów mikroskopów do obrazowania żywych komórek pokazujące zastosowanie albo sztywnej skrzyni z plastikowymi zasłonami jedynie z przodu (panele lewe: górny i dolny), albo czarnych zasłon otaczających cały układ obrazowania (panele prawe: górny i dolny). W obu przykładach strony przednie pozostają otwarte i zwinięte, gdy nie są używane (panele górne: lewy i prawy). Przednie czarne zasłony są rozwijane w dół, aby zapobiec przedostawaniu się jakiegokolwiek światła w pomieszczeniu (np. z ekranów komputerów) do obszaru obrazowania podczas przeprowadzania stymulacji bioluminescencyjnej i/lub obrazowania żywych komórek (panele dolne: lewy i prawy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat obrazowania bioluminescencyjnego przedstawiający LED i aktywację CTZ do analizy transkrypcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Bioluminescencja do integrowania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych. (A) Schematy komponentów FLARE współtransfekowanych z sbGLuc. W obecności Ca2+ i wynikającym z tego zbliżeniu proteazy do miejsca cięcia proteazy, bioluminescencja lub LED prowadzą do rozfałdowania LOV, odsłonięcia miejsca cięcia i uwolnienia czynnika transkrypcyjnego. Komórki poddano działaniu LED (cykl pracy 33%, 2 s włączone/4 s wyłączone przez 40 min; moc światła 3,5 mW, natężenie promieniowania 4,72 mW/cm2), bioluminescencji (stężenie końcowe CTZ 100 µM przez 15 min) lub pozostawiono w ciemności. Obrazy mikroskopowe komórek HEK293 wyrażających powyższe komponenty po zabiegu zwiększającym poziom Ca2+ i ekspozycji na LED (po lewej). Luminescencja FLuc zmierzona w luminometrze z porównaniem ekspozycji na LED, bioluminescencję (CTZ) lub pozostawienia w ciemności (po prawej). (B) Schematy systemu transkrypcyjnego niezależnego od Ca2+ współtransfekowanego z sbGLuc. Komórki HEK293 w płytkach 4-dołkowych przetransfekowano czterema różnymi układami komponentów, zgodnie z przedstawionym schematem. Płytki poddano działaniu LED (cykl pracy 33%, 2 s włączone/4 s wyłączone przez 40 min; moc światła 3,5 mW, natężenie promieniowania 4,72 mW/cm2) lub bioluminescencji (stężenie końcowe CTZ 100 µM) poprzez dodanie CTZ i pozostawienie na 15 min; płytki kontrolne pozostawiono w ciemności. Transkrypcję reportera FLuc zmierzono w systemie IVIS. Obrazy IVIS reprezentatywnych naczyń pokazano po lewej; pomiary radiancji z kilku powtórzeń, znormalizowane do kontroli w ciemności, pokazano po prawej. Pasek skali = 100 µm. Skróty: FLARE = Fast light- and activity-regulated expression; LOV = light-oxygen-voltage-sensing; LED = dioda emitująca światło; CTZ = coelenterazyna; FLuc = lucyferaza świetlika; dTom = dTomato; CRY2 = kryptochrom 2; CRY2PHR = region homologiczny do fotoliazy CRY2; CIB1 = białko wiążące Ca2+ i integryny 1; CIBN = koniec N CIB1; IVIS = in vivo imaging system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat kontroli optogenetycznej z oddziaływaniem białek CRY/CIB, stanami jasnym i ciemnym oraz danymi bioluminescencyjnymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Bioluminescencja w celu indukowania transkrypcji. (A) Schematy dwóch fotoaktywowalnych systemów transkrypcyjnych w ich stanach ciemnym i jasnym. (B) NanoLuc został albo współtransfekowany, albo połączony z elementami światłoczułymi, jak przedstawiono (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Porównania obu systemów pod kątem źródeł światła, konstrukcji wektorów i stosunku sygnału do szumu. Komórki eksponowano na światło LED (cykl pracy 33%, 2 s włączone/4 s wyłączone przez 40 min; moc światła 3,5 mW, natężenie promieniowania 4,72 mW/cm2) lub na bioluminescencję przez 15 min (stężenie końcowe hCTZ 100 µM; z wyjątkiem zaznaczonych innych stężeń). Dark: płytki pozostawiono nienaruszone w inkubatorze od momentu początkowej transformacji plazmidami do pomiaru FLuc; VEH: płytkami obchodzono się tak samo jak tymi otrzymującymi hCTZ, lecz podano im nośnik. Różnice w poziomach transkrypcji: hCTZ, współtransfekcja CRY vs EL222 – nieistotne; hCTZ, fuzja lucyferazy z fotobiałkiem CRY vs EL222 – p &lt; 0,005; hCTZ, współtransfekcja CRY vs fuzja – p &lt; 0,005; hCTZ, współtransfekcja EL222 vs fuzja – p &lt; 0,01; nośnik, CRY vs EL222 – p &lt; 0,05. Skróty: UAS = upstream activating sequence; LED = dioda emitująca światło; CTZ = coelenterazyna; FLuc = lucyferaza świetlika; CRY = kryptochrom; CIB = białko wiążące Ca2+ i integryny; VEH = nośnik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat rekombinacji Cre-lox z aktywacją sbGLuc; wyniki fluorescencji z CTZ, warunki LED." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62850/62850fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Bioluminescencja w manipulacjach optogenomicznych. (A) Schematy manipulacji optogenomicznych sterowanych bioluminescencją z wykorzystaniem sbGLuc, komponentów split iCreV oraz kasety reporterowej LSL, przed i po naświetlaniu. (B) Komórki HEK293 poddano lipofekcji plazmidami, a następnie utrzymywano w ciemności. Po dwudziestu czterech godzinach komórki traktowano przez 30 min samym medium (bez CTZ), CTZ (stężenie końcowe 100 µM) lub LED (cykl pracy 25%, 5 s włączony/15 s wyłączony przez 5 min; moc światła 14,81 mW, natężenie promieniowania 20 mW/cm2) jako kontrolę pozytywną. Obrazy mikroskopowe fluorescencji tdTomato w opisanych warunkach. Pasek skali = 100 µm. Skróty: LSL = lox-stop-lox; CTZ = coelenterazyna; LED = dioda emitująca światło; VVD = Vivid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/62850fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Aktywacja bioluminescencji fotoreceptorów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%201_revised.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Wytyczne dotyczące wysiewania i transfekcji komórek w różnych formatach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%202_revised.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Stosunki różnych plazmidów do transfekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Drogi podania, objętości i stężenia lucyferyny dla zastosowań in vivo (mysz 25 g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62850/Table%204.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Bioluminescence - light emitted by a luciferase enzyme oxidizing a small molecule substrate, a luciferin - has been used in vitro and in vivo to activate ...

1 (tony elektroniczne) Optogenetyka bioluminescencyjna to technologia platformowa, w której genetycznie kodowane źródła światła mogą wizualizować i kontrolować funkcje i sieci biologiczne w komórkach i między nimi. Bioluminescencja dociera do każdej domeny światłoczułej wyrażonej w docelowej populacji komórek bez uszkodzenia tkanek i komórek przez światłowody i rozszerzoną ekspozycję na światło fizyczne. Aby rozpocząć, zacznij przygotowywać bulion Lucyferyny od rozpuszczenia pięciu miligramów liofilizowanego CTZ w 250 mikrolitrach odpowiedniego rozpuszczalnika.Zapewnić rozpuszczenie CTZ wzdłuż ścianek za pomocą pipetowania. Chroniąc fiolkę przed bezpośrednim światłem, należy przygotować 50 mikrolitrów podwielokrotności w czarnych probówkach wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra i przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie dalsze manipulacje wykonuj w szczelnym pomieszczeniu w okapie z przepływem laminarnym oświetlonym czerwonym światłem.Aby przeprowadzić pojedynczą stymulację światłem bioluminescencyjnym, przygotuj roztwór roboczy lucyferyny w pożywce do hodowli komórkowej, na krótko przed dodaniem do komórek w końcowym stężeniu 100 mikromolów. Dodaj pożywkę zawierającą lucyferynę do komórek i inkubuj przez pożądany czas stymulacji światłem. Wyłącz czerwone światło.Po odczekaniu kilku sekund, aż oczy przyzwyczają się do całkowitej ciemności, monitoruj emisję światła za pomocą oka. Udokumentuj emisję światła, robiąc zdjęcie. Zakończ stymulację światłem, zastępując pożywkę zawierającą lucyferynę pożywką hodowlaną, a następnie umyj komórki pożywką hodowlaną raz lub dwa razy, aby wyeliminować całą lucyferynę w zależności od czułości eksperymentu.Aby uniknąć utraty komórek, umieść komórki na szalkach pokrytych PDL i inkubuj komórki. Aby wykonać powtarzającą się stymulację światłem bioluminescencyjnym, ustaw komorę obrazowania żywych komórek, tworząc szczelną komorę wokół mikroskopu obrazowania żywych komórek za pomocą pudełka i czarnych arkuszy. Upewnij się, że wszystkie źródła światła znajdujące się w pomieszczeniu są zakryte.Skonfiguruj system perfuzyjny z żądanym roztworem do wlotu i wyjścia komory prowadzącej do pojemnika na odpady. W zależności od liczby powtórzonych stymulacji, podwielokrotność przygotowanego roboczego roztworu do obrazowania lucyferyny należy przelać do probówek mikrowirówek. Umieścić szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami w komorze.Utrzymując pompę w ruchu, wyjmij rurkę wlotową pompy ze zlewki wlotowej. Szybko zanurz rurkę wlotową w roztworze lucyferyny, utrzymując krótki czas przejścia, aby uniknąć pustki powietrznej w przewodach. Jak tylko roztwór lucyferyny zostanie pobrany, umieść rurkę wlotową z powrotem w zlewce wlotowej.Powtórz wyjmowanie i zanurzanie rurki wlotowej w lucyferynie tyle razy, ile to konieczne, w odstępach od kilku minut do godzin, w zależności od fizjologicznego wzorca, na który komórki mają być narażone. Następnie trzymaj komórki w środowisku chronionym przed światłem przez 16 do 24 godzin w celu transkrypcji lub czasu do oceny efektu stymulacji światłem. Aby przeprowadzić aktywację bioluminescencji in vivo, przygotuj lucyferynę, wyjmując fiolkę CTZ z minus 80 stopni Celsjusza, a następnie pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej w obszarze chronionym przed światłem.Do każdej fiolki zawierającej 500 mikrogramów CTZ dodać 250 mikrolitrów sterylnej wody za pomocą pipety i ponownie umieścić gumowy korek na fiolce. Inkubować odtworzoną szklaną fiolkę w łaźni wodnej hartowanej w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez kilka minut, aby całkowicie rozpuścić proszek. Przenieś roztwór do czarnej probówki mikrowirówkowej i przepłucz ścianki, aby odzyskać cały CTZ.Po usunięciu potrzebnej ilości roztworu przechowuj pozostały roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu, odtworzeniu i porcjowaniu nośnika w podobny sposób, należy przygotować stymulację światłem bioluminescencyjnym, usuwając objętość lucyferyny lub nośnika potrzebną do wielkości zwierzęcia i wybranej drogi aplikacji. Wstrzyknąć zwierzęciu lucyferynę lub nośnik zgodnie z przeznaczeniem.Aby uzyskać pożądaną aktywację rekombinazy podczas określonego paradygmatu behawioralnego, wstrzyknij zwierzęciu tuż przed testami behawioralnymi. W przypadku transkrypcji fazowej należy wstrzykiwać zwierzęciu wielokrotnie w ciągu kilku dni i zbierać dane od zwierzęcia stymulowanego bioluminescencją zgodnie z przeznaczeniem. Szybki system ekspresji światła i aktywności umożliwił transkrypcję genu reporterowego ze zwiększonym wewnątrzkomórkowym jonem wapnia i światłem.Niebieska dioda LED doprowadziła do silnej fluorescencji reporterowej, a ekspresja FLuc została określona na podstawie pomiarów luminescencji po dodaniu lucyferyny. W systemie obrazowania in vivo zarówno diody LED, jak i CTZ znacznie zwiększały ekspresję FLuc, podczas gdy sama obecność składnika czynnika transkrypcyjnego powodowała znaczny sygnał tła, prawdopodobnie z powodu spontanicznej proteolizy. NanoLuc zastosowano do regulacji optogennej poprzez dimeryzację CRY/CIB i światłoczuły czynnik transkrypcyjny EL222.Bioluminescencja wywołana dodaniem hCTZ do komórek HEK-293 i jej usunięciem po 15 minutach była bardziej efektywna niż 20 minut ekspozycji na diody LED dla CRY/CIB i EL222. Nie zaobserwowano istotnych różnic w skuteczności transkrypcji między tymi dwoma systemami podczas jednoczesnej transfekcji z hCTZ, chociaż białka fuzyjne CRY/CIB były bardziej wydajne niż EL222. CRY/CIB wykazywał konsekwentnie wyższe poziomy tła w porównaniu z EL222 niezależnie od stężenia hCTZ.Badano bioluminescencję światłoczułej rozszczepionej rekombinazy Cre na bazie białka VVD LOV iCreV. Wyniki z aplikacji CTZ ujawniły, że obecność CTZ znacznie zwiększyła ekspresję w tle i jest podobna do aplikacji LED. Wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji nie tylko fotoreceptorów poruszających się żelazem, ale także wszelkich domen fotosensorycznych nadaje kolejny wymiar stymulacji świetlnej, rozszerzając manipulację funkcjami komórek w skali czasowej i przestrzennej.Optogenetyka bioluminescencyjna znalazła zastosowanie w komórkach i organizmach modelowych. Protokoły te można dostosować do testowania szerokiego zakresu ukierunkowanych hipotez in vitro i in vivo.

bioluminescent-optogenetics-20-harnessing-bioluminescence-to-activate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Rozszerzanie podstaw i możliwości zastosowania Fluorescencji przez Niezwiązane Wzbudzenie z Luminescencji (FUEL) poprzez badanie odpowiednich zasad i wykazanie jej zgodności z wieloma fluoroforami i warunkami ukierunkowanymi na przeciwciała.

Krok dalej niż BRET: Fluorescencja przez niezwiązane wzbudzenie z luminescencji (FUEL)

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać eksperymenty optogenetyczne w celu kontrolowania ekspresji genów za pomocą światła czerwonego i dalekiego czerwonego przy użyciu PhyB i PIF3. W zestawie znajdują się instrukcje krok po kroku, jak zbudować prosty i elastyczny system oświetlenia, który umożliwia kontrolę ekspresji genów lub innej optogenetyki za pomocą komputera.

Budowa prostego i wszechstronnego systemu oświetlenia do eksperymentów optogenetycznych

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj bioluminescencyjną optogenetykę do kontroli funkcji komórkowych in vitro i in vivo. Ta metoda wykorzystuje lucyferazę i lucyferynę do precyzyjnej stymulacji świetlnej bez uszkadzania tkanek.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Przeglądaj więcej filmów