Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo
4 sierpnia 2021
Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.
1 (tony elektroniczne) Optogenetyka bioluminescencyjna to technologia platformowa, w której genetycznie kodowane źródła światła mogą wizualizować i kontrolować funkcje i sieci biologiczne w komórkach i między nimi. Bioluminescencja dociera do każdej domeny światłoczułej wyrażonej w docelowej populacji komórek bez uszkodzenia tkanek i komórek przez światłowody i rozszerzoną ekspozycję na światło fizyczne. Aby rozpocząć, zacznij przygotowywać bulion Lucyferyny od rozpuszczenia pięciu miligramów liofilizowanego CTZ w 250 mikrolitrach odpowiedniego rozpuszczalnika.
Zapewnić rozpuszczenie CTZ wzdłuż ścianek za pomocą pipetowania. Chroniąc fiolkę przed bezpośrednim światłem, należy przygotować 50 mikrolitrów podwielokrotności w czarnych probówkach wirówkowych o pojemności 0,5 mililitra i przechowywać podwielokrotności w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie dalsze manipulacje wykonuj w szczelnym pomieszczeniu w okapie z przepływem laminarnym oświetlonym czerwonym światłem.
Aby przeprowadzić pojedynczą stymulację światłem bioluminescencyjnym, przygotuj roztwór roboczy lucyferyny w pożywce do hodowli komórkowej, na krótko przed dodaniem do komórek w końcowym stężeniu 100 mikromolów. Dodaj pożywkę zawierającą lucyferynę do komórek i inkubuj przez pożądany czas stymulacji światłem. Wyłącz czerwone światło.
Po odczekaniu kilku sekund, aż oczy przyzwyczają się do całkowitej ciemności, monitoruj emisję światła za pomocą oka. Udokumentuj emisję światła, robiąc zdjęcie. Zakończ stymulację światłem, zastępując pożywkę zawierającą lucyferynę pożywką hodowlaną, a następnie umyj komórki pożywką hodowlaną raz lub dwa razy, aby wyeliminować całą lucyferynę w zależności od czułości eksperymentu.
Aby uniknąć utraty komórek, umieść komórki na szalkach pokrytych PDL i inkubuj komórki. Aby wykonać powtarzającą się stymulację światłem bioluminescencyjnym, ustaw komorę obrazowania żywych komórek, tworząc szczelną komorę wokół mikroskopu obrazowania żywych komórek za pomocą pudełka i czarnych arkuszy. Upewnij się, że wszystkie źródła światła znajdujące się w pomieszczeniu są zakryte.
Skonfiguruj system perfuzyjny z żądanym roztworem do wlotu i wyjścia komory prowadzącej do pojemnika na odpady. W zależności od liczby powtórzonych stymulacji, podwielokrotność przygotowanego roboczego roztworu do obrazowania lucyferyny należy przelać do probówek mikrowirówek. Umieścić szkiełko nakrywkowe z transfekowanymi komórkami w komorze.
Utrzymując pompę w ruchu, wyjmij rurkę wlotową pompy ze zlewki wlotowej. Szybko zanurz rurkę wlotową w roztworze lucyferyny, utrzymując krótki czas przejścia, aby uniknąć pustki powietrznej w przewodach. Jak tylko roztwór lucyferyny zostanie pobrany, umieść rurkę wlotową z powrotem w zlewce wlotowej.
Powtórz wyjmowanie i zanurzanie rurki wlotowej w lucyferynie tyle razy, ile to konieczne, w odstępach od kilku minut do godzin, w zależności od fizjologicznego wzorca, na który komórki mają być narażone. Następnie trzymaj komórki w środowisku chronionym przed światłem przez 16 do 24 godzin w celu transkrypcji lub czasu do oceny efektu stymulacji światłem. Aby przeprowadzić aktywację bioluminescencji in vivo, przygotuj lucyferynę, wyjmując fiolkę CTZ z minus 80 stopni Celsjusza, a następnie pozwól jej ogrzać się do temperatury pokojowej w obszarze chronionym przed światłem.
Do każdej fiolki zawierającej 500 mikrogramów CTZ dodać 250 mikrolitrów sterylnej wody za pomocą pipety i ponownie umieścić gumowy korek na fiolce. Inkubować odtworzoną szklaną fiolkę w łaźni wodnej hartowanej w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez kilka minut, aby całkowicie rozpuścić proszek. Przenieś roztwór do czarnej probówki mikrowirówkowej i przepłucz ścianki, aby odzyskać cały CTZ.
Po usunięciu potrzebnej ilości roztworu przechowuj pozostały roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przygotowaniu, odtworzeniu i porcjowaniu nośnika w podobny sposób, należy przygotować stymulację światłem bioluminescencyjnym, usuwając objętość lucyferyny lub nośnika potrzebną do wielkości zwierzęcia i wybranej drogi aplikacji. Wstrzyknąć zwierzęciu lucyferynę lub nośnik zgodnie z przeznaczeniem.
Aby uzyskać pożądaną aktywację rekombinazy podczas określonego paradygmatu behawioralnego, wstrzyknij zwierzęciu tuż przed testami behawioralnymi. W przypadku transkrypcji fazowej należy wstrzykiwać zwierzęciu wielokrotnie w ciągu kilku dni i zbierać dane od zwierzęcia stymulowanego bioluminescencją zgodnie z przeznaczeniem. Szybki system ekspresji światła i aktywności umożliwił transkrypcję genu reporterowego ze zwiększonym wewnątrzkomórkowym jonem wapnia i światłem.
Niebieska dioda LED doprowadziła do silnej fluorescencji reporterowej, a ekspresja FLuc została określona na podstawie pomiarów luminescencji po dodaniu lucyferyny. W systemie obrazowania in vivo zarówno diody LED, jak i CTZ znacznie zwiększały ekspresję FLuc, podczas gdy sama obecność składnika czynnika transkrypcyjnego powodowała znaczny sygnał tła, prawdopodobnie z powodu spontanicznej proteolizy. NanoLuc zastosowano do regulacji optogennej poprzez dimeryzację CRY/CIB i światłoczuły czynnik transkrypcyjny EL222.
Bioluminescencja wywołana dodaniem hCTZ do komórek HEK-293 i jej usunięciem po 15 minutach była bardziej efektywna niż 20 minut ekspozycji na diody LED dla CRY/CIB i EL222. Nie zaobserwowano istotnych różnic w skuteczności transkrypcji między tymi dwoma systemami podczas jednoczesnej transfekcji z hCTZ, chociaż białka fuzyjne CRY/CIB były bardziej wydajne niż EL222. CRY/CIB wykazywał konsekwentnie wyższe poziomy tła w porównaniu z EL222 niezależnie od stężenia hCTZ.
Badano bioluminescencję światłoczułej rozszczepionej rekombinazy Cre na bazie białka VVD LOV iCreV. Wyniki z aplikacji CTZ ujawniły, że obecność CTZ znacznie zwiększyła ekspresję w tle i jest podobna do aplikacji LED. Wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji nie tylko fotoreceptorów poruszających się żelazem, ale także wszelkich domen fotosensorycznych nadaje kolejny wymiar stymulacji świetlnej, rozszerzając manipulację funkcjami komórek w skali czasowej i przestrzennej.
Optogenetyka bioluminescencyjna znalazła zastosowanie w komórkach i organizmach modelowych. Protokoły te można dostosować do testowania szerokiego zakresu ukierunkowanych hipotez in vitro i in vivo.
Przegląd
Bioluminescencyjna optogenetyka wykorzystuje genetycznie kodowane źródła światła do kontrolowania funkcji biologicznych bez uszkadzania tkanek. Metoda ta umożliwia precyzyjne manipulowanie aktywnością komórkową w różnych skalach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Bioluminescencja
- Optogenetyka
- Manipulacja komórkowa
Wstęp
- Bioluminescencja powstaje w wyniku utleniania lucyferyny przez enzymy lucyferazy.
- Technologia ta umożliwia stymulację komórek światłem bez fizycznej ekspozycji na światło.
- Można ją stosować zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo.
- Stymulacja światłem może aktywować różne funkcje i szlaki komórkowe.
Cel badania
- Zbadanie wykorzystania bioluminescencji do kontrolowania funkcji komórkowych.
- Opracowanie protokołów stymulacji światłem w różnych układach eksperymentalnych.
- Ocena wydajności bioluminescencji w porównaniu z tradycyjnymi metodami optogenetycznymi.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu zapasu i roztworów roboczych lucyferyny.
- Protokoły pojedynczej i powtórzonej stymulacji światłem bioluminescencyjnym.
- Techniki aktywacji bioluminescencji in vivo.
- Pomiar luminescencji i fluorescencji w komórkach transfekowanych.
Główne wyniki
- Stymulacja bioluminescencją skutecznie aktywuje funkcje komórkowe.
- Dodanie lucyferyny doprowadziło do silnej ekspresji genu reporterowego.
- Bioluminescencja była bardziej wydajna niż ekspozycja na LED w określonych zastosowaniach.
- Białka fuzyjne CRY/CIB wykazały wyższe poziomy tła niż EL222.
Wnioski
- Optogenetyka bioluminescencyjna rozszerza możliwości stymulacji światłem.
- Metoda ta może być dostosowana do różnych hipotez badawczych.
- Zapewnia ona nieinwazyjne podejście do manipulowania aktywnością komórkową.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bioluminescencyjna optogenetyka umożliwia precyzyjną, nieinwazyjną aktywację białek fotoczułych zarówno w układach in vitro, jak i in vivo, rozszerzając zestaw narzędzi do funkcjonalnej analizy szlaków komórkowych. Platforma ta wspiera manipulacje procesami komórkowymi zapośredniczonymi przez światło w oparciu o postawione hipotezy, eliminując ograniczenia związane z zewnętrznym dostarczaniem światła, co zwiększa pewność przewidywań w badaniach mechanistycznych i na etapie wczesnego odkrywania. Jej modułowość oraz kompatybilność z różnymi domenami fotoczułymi sprawiają, że stanowi ona powtarzalne narzędzie służące do ograniczania ryzyka biologicznego w całym portfolio projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę szlaków światłoczułych oraz funkcji białek w natywnych kontekstach komórkowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie kontrolowanej aktywacji zdarzeń sygnalizacyjnych, lokalizacji oraz transkrypcyjnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez chemogenetyczną kontrolę białek fotosensorycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane i powtarzalne dostarczanie światła za pomocą systemów lucyferaza-lucyferyna do opracowywania testów.
- Umożliwia ilościowe odczyty ekspresji genu reporterowego oraz aktywacji szlaków sygnałowych.
- Wspiera skalowalny screening związków lub perturbacji genetycznych w systemach reagujących na światło.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia manipulację funkcjami komórkowymi in vivo w organizmach modelowych na potrzeby badań związanych z chorobami.
- Ułatwia korelację wyników in vitro i in vivo dzięki zastosowaniu spójnych protokołów aktywacji bioluminescencyjnej.
- Wspiera optymalizację postępów badań poprzez umożliwienie rzetelnych, nieinwazyjnych studiów funkcjonalnych w różnych modelach biologicznych.
Integracja potoków i przepływu pracy
Technologia ta integruje etapy od wczesnego odkrycia po badania przedkliniczne, umożliwiając testowanie hipotez, wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych oraz walidację funkcjonalną zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ukierunkowaną aktywację i pomiar funkcji białek fotosensorycznych w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia pomiary luminescencji i fluorescencji w celu porównania warunków aktywacji i wyników.
- Badania translacyjne: Łączy badania in vitro i in vivo dzięki spójnym strategiom aktywacji w celu uzgodnienia biomarkerów i funkcji.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Oferuje modularną platformę możliwą do adaptacji do różnych paradygmatów eksperymentalnych i pytań biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów sterowanych światłem.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie przeprowadzania solidnych badań funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój w ramach wielu programów odkrywania leków.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii molekularnej, optogenetyki oraz pracy z żywymi komórkami lub zwierzętami.
- Niezbędny jest dostęp do systemów obrazowania luminescencyjnego oraz środowisk o kontrolowanym oświetleniu.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja wyboru pary lucyferaza-lucyferyna oraz protokołów aktywacji.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów komórek i organizmów modelowych poprzez modyfikację protokołu.
- Dla optymalnego zaprojektowania testu niezbędne jest uwzględnienie sygnału tła oraz wydajności fuzji białek.
